Cellbiologins relevans och metoder (föreläsning 1)

In vitro

odla celler.

Celler tagna från en vävnad kan bilda en primärkultur. Dessa kan sättas i nytt odlingsmedium flera gånger för massframställning. De flesta normala differentierade celler kan endast dela sig ett begränsat antal gånger.

In vitro - cell-linjer

delar sig ett obegränsat antal gånger. kommer från ursprungscell. ofta framställd från tumörer. kan även fås från stamceller. celler i cell-linjer är i regel differentierade.

in vitro - primärkultur

celler från en vävnadskulture delar sig ett begränsat antal gånger men är ofta ganska oförändrade.

In vitro - sortera celler

En FACS (fluorescent activated cell sorting) kan användas för att isolera olika cellpopulationer. Flödescytometri används för att analysera en population.

Flödescytometri är den övergripande analysmetoden för att mäta cellers egenskaper (som storlek, form och markörer) i vätska med hjälp av laser. FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) är en specifik typ av flödescytometri som dessutom kan sortera ut och samla in de levande cellerna efter analys

visualisera

mikroskopi.

ett mikroskopipreparat är tredimetionellt. konfokal- eller dekonvolutionsmikroskopi används för att få ett skarpt plan. Fluorescerande antikroppar, gifter, sensorer för pH, Ca2+ m.m. används som prober.

En mikroskopibild är inte bevis i sig. Den måste kvantifieras och kontrolleras.

Ljusmikroskopi

- Ljusfältsmikroskopi: max upplösning 200 nm.

- Faskontrast / DIC: ger bättre bilder av celler utan färgning. vanligen färgas celler och vävnadssnitt.

- Fluorescensmikroskopi: exitering av elektroner. Transgena tekniker används för introduceraoch aktivera fluorescerande proteiner i celler. GFP = green fluorescent protein. Flugembryornas nervceller uttrycker GFP till skillnad från övriga celler.

- Konfokalmikroskopi: skannar prover punkt för punkt i flera olika nivåer och kan ge en 3D bild.

- Live-cell imaging

Elektronmikroskopi

- Transmission electronmicroskop, TEM: inre ultrastruktur

- Scanning electronmicroscope, SEM: ytstruktur

- Kryo-EM, kortfattat, som brygga till strukturell biologi

In vivo

modellorganismer.

Biologiska system följer reglerna för fysikaliska och kemiska lagar. Biologiska strukturer och processer har utvecklats längs olika vägar under trycket från naturligt urval i miljarder år. Även om de är mycket divergerade, är alla biologiska system sammansatta av celler som innehåller samma typer av kemiska molekyler och använder liknande principer för organisation på cellnivå. Likheter mellan biologiska system gör undersökningar av modellorganismer informativa för att förstå grundläggande cellulära processer.

Modellorganismer 8 exempel

1. jäst: Cellcykel-kontroll och celldelning. Utsöndring av proteiner, membranbildning. Cytoskelettets funktion. Celldifferentiering och åldrande. Genreglering och kromosomstruktur.

2. grönalg: Flagellers struktur och funktion. Kloroplaster och fotosyntes. Organell-rörelser. Fototaxi.

3. nematod och

4. bananfluga: Utvecklingsbiologi. Cell-linjer. Nervcellsbildning. Programmerad celldöd. Åldrande. Genreglering och kromosomstruktur.

5. planaria: Stamceller. Vävnadsomsättning. Sårläkning. Regenerering.

6. Zebrafisk: Uvecklingsbiologi. Cancer. Fosterdefekter. Bildning av organ och vävnader.

7. Mus: Utvecklingsbiologi. Däggdjurs immunsystem. Nervcellsbildning och hjärnans funktion. Sjukdomsmodeller - cancer. Ärftlighet. Beteende. Genreglering. Beteende m.m.

8. Växter: Utvecklingsbiologi. Jordbrukets tillämpningar. Fysiologi. försvarsreaktioner. Genreglering m.m.

Homeobox-gener

Homeobox-gener är en grupp gener som kodar för homeo-domäner, en typ av proteinstrukturer som fungerar som transkriptionsfaktorer. Homeodomän-proteiner reglerar uttrycket av andra gener under utvecklingen av en organism genom att binda till specifika DNA-sekvenser och kontrollera transkriptionen av målgener.

Homeobox-gener finns hos alla eukaryota organismer och spelar en avgörande roll i att specificera kroppsaxlar och differentiering av kroppsegenskaper under embryogenes.

HOX-gener

HOX-gener är en undergrupp av homeobox-gener som är specifika för att reglera och koordinera utvecklingen av kroppsegenskaper längs huvud-stjärtsaxeln hos flercelliga organismer. HOX-gener fungerar genom att kontrollera utvecklingen av segmenterade kroppsstrukturer, till exempel extremiteter, revben, ryggkotor och organens anatomi.

Hox-gener, kontrollerar utvecklingen av det centrala nervsystemet och kroppen. De är gemensamma för de flesta organismer. Fyra grupper av liknande Hox-gener, visade i färg, verkar kontrollera relaterade områden i människokroppen och flugan. Varje låda representerar en enda Hox-gen.

att mäta populationer och dynamik

- tidsserieförsök: används för signaleringsdynamik, cellcykelprogression, proteinnedbrytning, respons på stress.

- flödescytometri/FACS: används för cellstorlek och granularitet, DNA innehåll och cellcykelanalys, apoptosanalyser, proteinexpression, sortering av celler baserat på fluorescens.

- kvantitativa avläsningar: Fluorescensintensitet, Antal celler i mitos, Migrationshastighet, Andel apoptotiska celler, Intensitet hos proteinband.

Omics och systembiologiska metoder

- transkriptomik: vilka gener uttrycks

- proteomik: vilka proteiner finns eller är modifierade

- single-cell RNA-seq: heterogenitet mellan celler

- spatial transkriptomik/proteomik: molekylär information med vävnadskontext

- bioinformatik som nödvändig del av tolkningen av stora datamängder.