Kolos 2 - krótsza

ANALIZA EKSPRESJI GENÓW - od próbki do wyniku

1. Pobranie i zabezpieczenie

2. Izolacja RNA

3. Usunięcie gDNA

4. Ocena ilości i jakości

5. Odwrotna transkrypcja

6. qPCR

7. Analiza danych

1. Pobranie i zabezpieczenie

Stabilizacja RNA (np. RNAlater), zamrożenie, warunki wolne od RNaz

2. Izolacja RNA

TRI reagent, rozdział faz, oczyszczanie na kolumienkach

3. Usunięcie gDNA

Trawienie DNazą I; kontrola bez odwrotnej transkryptazy

4. Ocena ilości i jakości

A260, A260/280, A260/230, RIN

5. Odwrotna transkrypcja

Synteza cDNA na matrycy RNA

6. qPCR

Pomiar fluorescencji w każdym cyklu

7. Analiza danych

Ct, normalizacja do genu referencyjnego, 2−ΔΔCt

IZOLACJA RNA - 1.TRI reagent

• Fenol, alkohol izoamylowy, β-merkaptoetanol, chlorowodorek/izotiocyjanian guanidyny

• Liza komórek

• Denaturacja białek – inhibicja RNaz

IZOLACJA RNA - 2. Fenol Chloroform

Rozdział faz:

• faza wodna (RNA)

• interfaza (większość DNA)

• faza organiczna (ciała komórek, białka)

IZOLACJA RNA - 3. Izopropanol Etanol

Wytrącenie i oczyszczenie RNA

IZOLACJA RNA - 4. Woda

Elucja RNA

Wykorzystanie RNA zanieczyszczonego izotiocyjanianem guanidyny spowoduje

denaturację enzymów katalizujących reakcje PCR

Zebranie do fazy wodnej interfazy bądź fazy organicznej skutkuje

izolacją DNA wraz z RNA bądź zanieczyszczeniem próbki białkami

Po etapie wytrącenia RNA izopropanolem najczęściej wprowadza się

do procedury użycie kolumienek

W celu lepszego oczyszczenia RNA można powtórzyć

etap płukania etanolem

IZOLACJA RNA - Tkanki ( złożoność próbki )

Heterogenne – różne typy komórek, macierz zewnątrzkomórkowa, białka, lipidy

IZOLACJA RNA - Tkanki ( obecność struktur utrudniających izolację )

Dużo kolagenu, tłuszczu, włókien, nukleaz

IZOLACJA RNA - Tkanki ( aktywność RNaz )

Bardzo wysoka – szczególnie w tkankach wątroby, trzustki, śledziony

IZOLACJA RNA - Tkanki ( jakość izolowanego materiału )

Często niższa (częściowa degradacja)

IZOLACJA RNA - Linie komórkowe - złożoność próbki

Homogenne – jeden typ komórek, brak macierzy

IZOLACJA RNA - Linie komórkowe - Obecność struktur utrudniających izolację

Wyłącznie komórki hodowlane

IZOLACJA RNA - Linie komórkowe - Aktywność RNaz

Zazwyczaj niższa, łatwiejsza kontrola RNaz

IZOLACJA RNA - Linie komórkowe - Jakość izolowanego materiału

Zazwyczaj wysoka (RIN > 8)

ZOLACJA RNA - Wymagana modyfikacja metody dla tkanek - Złożoność próbki, Obecność struktur utrudniających izolację

Potrzeba homogenizacji materiałuliza chemiczna (bufor TRIzol) i mechaniczna (homogenizator/moździerz w ciekłym azocie)

IZOLACJA RNA - Wymagana modyfikacjametody dla tkanek - Jakość izolowanego materiału, Aktywność RNaz

Szybsze zabezpieczenie materiału po pobraniu/sprawna izolacja

IZOLACJA RNA - tkanki

IZOLACJA RNA - linie komórkowe

IZOLACJA RNA - Wymagana modyfikacja metody – dla tkanek

ZABEZPIECZENIE RNA - stabilizacja próbki i usunięcie gDNA

• Przed izolacją: ochrona przed RNazami

• Po izolacji: usunięcie DNA genomowego

Przed izolacją: ochrona przed RNazami

• RNazy są wszechobecne i stabilne: rękawiczki, odczynniki i materiały wolne od RNaz, osobne stanowisko pracy

• Stabilizacja tkanki: odczynnik typu RNAlater lub natychmiastowe zamrożenie w ciekłym azocie

• Przechowywanie RNA w −80°C, bez wielokrotnego rozmrażania

• Ślady biologiczne: zabezpieczać wysuszone, w niskiej temperaturze; wysoka temperatura i duże wahania temperatury oraz wilgoć przyspieszają degradację

Przed izolacją: ochrona przed RNazami ( RNazy są wszechobecne i stabilne )

rękawiczki, odczynniki i materiały wolne od RNaz, osobne stanowisko pracy

Przed izolacją: ochrona przed RNazami (Stabilizacja tkanki)

odczynnik typu RNAlater lub natychmiastowe zamrożenie w ciekłym azocie

Przed izolacją: ochrona przed RNazami (Przechowywanie RNA w −80°C)

bez wielokrotnego rozmrażania

Przed izolacją: ochrona przed RNazami (Ślady biologiczne)

zabezpieczać wysuszone, w niskiej temperaturze; wysoka temperatura i duże wahania temperatury oraz wilgoć przyspieszają degradację

Po izolacji: usunięcie DNA genomowego - czemu usuwamy?

• gDNA w próbce zawyża wynik pomiaru stężenia RNA

• gDNA w analizie RT-PCR daje fałszywie dodatni sygnał

• Trawienie DNazą I (na kolumience lub w roztworze), a następnie inaktywacja enzymu

• Kontrola „−RT” (bez odwrotnej transkryptazy): brak sygnału potwierdza brak gDNA

Po izolacji: usunięcie DNA genomowego - gDNA w próbce

zawyża wynik pomiaru stężenia RNA

Po izolacji: usunięcie DNA genomowego -gDNA w analizie RT-PCR

daje fałszywie dodatni sygnał

Po izolacji: usunięcie DNA genomowego - Trawienie DNazą I

(na kolumience lub w roztworze), a następnie inaktywacja enzymu

Po izolacji: usunięcie DNA genomowego - Kontrola „−RT”(bez odwrotnej transkryptazy):

brak sygnału potwierdza brak gDNA

OCENA ILOŚCIOWA I JAKOŚCIOWA RNA

• Ocena stężenia RNA (Metoda spektrofotometryczna)

• Ocena czystości RNA (Metoda spektrofotometryczna)

• Ocena jakości RNA (Metoda elektroforetyczna)

OCENA ILOŚCIOWA I JAKOŚCIOWA RNA - Ocena stężenia RNA (Metoda spektrofotometryczna)

Pomiar absorbancji przy długości fal 260 nm (A260) – maksimum absorbancji dla kwasów nukleinowych

A260 = 1 → 40 ug/ml RNA

c [ug RNA/ml] = A260 × R × 40

OCENA ILOŚCIOWA I JAKOŚCIOWA RNA - Ocena czystości RNA (Metoda spektrofotometryczna)

Maksimum absorbancji przy długości fal:

260 nm kwasy nukleinowe

280 nm białka

230 nm związki wykorzystywane do izolacji RNA

Współczynnik A260/A280 1,8 – 2,0 zanieczyszczenie białkami

Współczynnik A260/A230 1,90 – 2,25 zanieczyszczenie np. izotiocyjanianem

Maksimum absorbancji przy długości fal: 260 nm

kwasy nukleinowe

Maksimum absorbancji przy długości fal: 230 nm

białka

Maksimum absorbancji przy długości fal: 280 nm

związki wykorzystywane do izolacji RNA

Współczynnik A260/A280 1,8 – 2,0

zanieczyszczenie białkami

Współczynnik A260/A230 1,90 – 2,25

zanieczyszczenie np. izotiocyjanianem

OCENA ILOŚCIOWA I JAKOŚCIOWA RNA - Ocena jakości RNA (Metoda elektroforetyczna)

• Densytometryczna ocena jakości prążków odpowiadających 28S i 18S rRNA (A) –stosunek intensywności prążków 28S:18S rRNA zbliżone 2:1 – najlepsza jakość, brak degradacji im mnieszy stosunek, tym większa degradacja;

• Ocena współczynnika RIN (ang. RNA integrity number; B) 10 – 1 (10 = niski stopień degradacji, 1 = wysoki poziom degradacji)

Jak oceniamy jakość RNA na podstawie prążków 28S i 18S rRNA?

Stosunek 28S:18S ≈ 2:1 oznacza najlepszą jakość. Im mniejszy stosunek, tym większa degradacja RNA.

Czym jest RIN i co oznaczają jego wartości?

RIN ocenia jakość RNA w skali 1–10. 10 = najlepsza jakość, 1 = największa degradacja