bio cel chap 2

Quel est le but principal de la recherche biomedicale en biologie cellulaire ?

Ameliorer la santé humaine en etudiant les dysfocntionnement cellulaires qui causent les pathologie

Quels sont les 3 objectifs precis de la demarche experimentale ?

Identification des mécanismes cellulaire impliqués ( protéines, gène, organite)

Identification des causes

Test pharmacologiques

Quels critère discutent le choix d’un modèle d’étude avant le modèle humain ?

La pertinence du modèle, le temps et le cout

Quel animal utilise t on pour l'étude de la mort cellulaire programmée ?

La nematode caenorhabditis elegans

Pourquoi utilise t on la mouche drosophila melanogaster comme étude génétique ?

Grace a sa vitesse de reproduction

Quel est l'intérêt principal du modèle de la souris mus musculus ?

Elle permet d’avoir des organismes génétiquement modifiés

Pourquoi utilise t on le cochon comme etudes chirurgicales ?

Car il est proche de l’homme au point de vu anatomique

Quels sont les 2 modèle cellulaire cités et leur application respective ?

Escherichia coli: cout peu élvevé, reproduction rapide, modification génétique facile

Levure saccharomyces cerevisiae: permet l’étude de la regulation des gènes

Quels sont les 4 types de type cellulaire utilisés en biologie cellulaire ?

Les cellulaire primaires, les lignées de cellules immortalisées, les lignées de cellules transformées et les tissus recréés en laboratoire

Quest ce que la culture en suspension pour les bactérie ?

Ensemencer des souches dans un milieu nutritif optimal (27°C, pH controlé, avec ou sans O2)

Quel signe visuel indique la prolifèration bactérienne en suspension ?

Le milieu initialement translucide se trouble

Quest ce que la culture sur support et que permet elle d’obtenir ?

Utiliser une boite de Petri contenant un milieu nutritif gélifié a l’agar pour obtenir une colonie bactérienne ( sous forme de point )

Pour quel type d’etude la culture sur support est elle particulièrement utilisée ?

Dans l’étude de la regulation genique

Quelles est la diff entre bactérie aerobies et anaerobie ?

Les aerobies ont besoin d’oxygène, tandis que les autres non

À partir de quel type de prélèvement de tissu travaille-t-on pour une culture primaire chez les eucaryotes ?

On travaille à partir d'une biopsie (qui peut être cutanée, musculaire, etc.), prélevée sur l'humain ou sur l'animal (ex: tissu du cœur).

En quoi consiste la technique d'obtentions de cellules par "immersion d'un explant" ?

C'est une méthode physique alternative à la digestion enzymatique permettant de laisser les cellules migrer hors d'un petit morceau de tissu prélevé (l'explant) pour obtenir de multiples types cellulaires.

Quelles sont les deux enzymes couramment utilisées pour digérer la matrice extracellulaire d'un tissu ?

La trypsine et la collagénase, qui viennent dégrader les protéines de la matrice extracellulaire.

Quel est le rôle de l'EDTA lors de la phase de digestion chimique d'un tissu ?

C'est un chélateur de cations bivalents $(Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$) et un agent anticoagulant.

Quel est le principe de la centrifugation (méthode physique) pour séparer les éléments figurés du sang déposés sur du ficoll ?

Les éléments se séparent en fonction de la densité des cellules : plus elles sont lourdes (haute densité), plus elles se retrouvent basses dans le tube après centrifugation.

Sur quoi repose la méthode immunologique de purification cellulaire ?

Elle utilise l'interaction spécifique entre des antigènes (marqueurs de surfaces) présents sur la membrane cellulaire et des anticorps spécifiques introduits pour reconnaître uniquement le type cellulaire voulu.

Comment fonctionne l'utilisation d'une bille magnétique couplée à un anticorps pour l'isolement cellulaire ?

Les anticorps fixent les cellules cibles, et la bille magnétique permet de récupérer toutes les cellules liées à l'aide d'un aimant, tandis que les cellules non liées sont éliminées.

•Quels sont les deux dérivés de fluorescence cités pour le tri cellulaire et quelles sont leurs couleurs respectives ?

• La fluorescéine (fluo vert)

• La rhodamine (fluo rouge)

Quel est le principe de la méthode biologique par adhérence différentielle ?

Elle sépare deux types cellulaires en fonction de leur vitesse d'adhérence au fond de la boîte durant le temps d'incubation (un type adhère plus rapidement que l'autre).

Dans le sang, quel type cellulaire n'adhère pas à la boîte de culture, contrairement aux macrophages ?

Les lymphocytes n'adhèrent pas, tandis que les macrophages oui. Un simple rinçage permet donc d'éliminer les lymphocytes et de récupérer le type voulu

Quelle est la caractéristique majeure des cellules très différenciées obtenues en culture primaire ?

Elles ne sont plus capables de se diviser ni de proliférer.

Quels sont les deux exemples de cellules très différenciées cités dans le cours qui peuvent être greffées à des patients diabétiques ?

Les cardiomyocytes et les îlots $\beta$ -pancréatiques (qui sécrètent l'insuline).

Qu'est-ce que la confluence pour des cellules peu ou non différenciées ?

C'est le moment où les cellules se touchent toutes (les unes à côté des autres) et s'arrêtent de proliférer à cause du manque de place. C'est l'inhibition de contact.

Quel exemple de cellules issues de biopsie cutanée est donné pour illustrer les cellules capables de proliférer jusqu'à la confluence ?

Les fibroblastes.

Qu'est-ce qu'un repiquage (ou passage en culture secondaire) ?

C'est l'action de décoller les cellules arrivées à confluence pour les remettre en suspension et les transférer dans une nouvelle boîte de Pétri afin qu'elles recommencent à proliférer.

Quels sont les deux éléments chimiques ajoutés pour décoller les cellules de leur support lors d'un repiquage et quels sont leurs rôles ?

• La trypsine : une protéase qui coupe les protéines d'adhérence.

• L'EDTA : un chélateur qui capture les cations nécessaires à l'adhérence

Pourquoi le milieu de culture est-il souvent de couleur rouge ?

Parce qu'il contient du rouge de phénol, un indicateur de pH qui permet de surveiller et d'éviter l'acidification du milieu due au métabolisme cellulaire.

Qu'est-ce que le sérum de veau fœtal (SVF) et pourquoi parle-t-on de "milieu non défini" lorsqu'on l'utilise ?

C'est un apport non obligatoire en facteurs de croissance (ex: FGF, NGF). On dit qu'il est non défini car on ne connaît pas la concentration exacte de ces facteurs.

Quels sont les rôles respectifs de l'insuline et des antibiotiques (ex: pénicilline) dans le milieu ?

• L'insuline : promeut la survie et favorise l'absorption du glucose (source d'énergie).

• Les antibiotiques : empêchent la prolifération des bactéries dans la culture d'eucaryotes.

Quels éléments de la matrice extracellulaire peuvent recouvrir la boîte de culture pour aider les cellules adhérentes à se fixer ?

Le collagène, la laminine ou la fibronectine.

À quoi sert un Poste de Sécurité Microbiologique (PSM) ?

C'est une enceinte stérile où l'air est filtré avant d'entrer, permettant d'éviter les contaminations lors des manipulations.

Quelles sont les conditions précises d'humidité, de température et de gaz dans une étuve à atmosphère contrôlée ?

Atmosphère humide, température à 37 °C, injection de 5 % de \(CO_{2}\) (pour maintenir le pH constant) et maintien de l'\(O_{2}\) à 20 %.

Quel est l'avantage majeur de la culture de cellules in vitro par rapport au modèle in vivo ?

Elle permet d'obtenir des cellules le plus proche possible de ce qui est retrouvé in vivo.

Quels sont les principaux inconvénients de la culture primaire ?

Elle nécessite une longue préparation, elle est coûteuse, la modification génétique est difficile si les cellules sont déjà différenciées, et il y a des problèmes de viabilité car les cellules sont très fragiles.

Qu'est-ce que la sénescence réplicative ?

• C'est le phénomène par lequel les cellules prolifèrent de moins en moins vite avec le temps jusqu'à l'arrêt complet de la prolifération.

Qu'est-ce que la limite de Hayflick ?

C'est le nombre maximal de divisions qu'une cellule peut effectuer avant d'entrer en sénescence, se produisant généralement après 30 à 50 passages cellulaires.

Quelle structure chromosomique explique la sénescence réplicative en se raccourcissant à chaque division ?

• Les télomères (séquences répétitives situées à l'extrémité des chromosomes).

Quelle enzyme permet de repousser la limite de Hayflick et d'obtenir des lignées cellulaires immortalisées ?

La télomérase, une enzyme capable de rallonger les télomères pour permettre la reprise de la prolifération.

Pourquoi dit-on que les lignées de cellules sont monocouches ?

• Parce qu'elles recouvrent toute la boîte avec une seule couche de cellules et s'arrêtent de proliférer à confluence (inhibition de contact).

Quel est le grand avantage de la fragilité réduite des lignées secondaires par rapport aux cultures primaires ?

• Étant beaucoup moins fragiles, elles permettent de réaliser plus facilement des modifications de l'expression des gènes (transfection/infection).

À quelle température et dans quel fluide conserve-t-on les lignées cellulaires par congélation ?

Dans l'azote liquide à -196 °C.

Quels sont les trois types d'agents transformants qui peuvent transformer des cellules saines en lignées tumorales ?

• Les virus, les agents chimiques cancérigènes ou les radiations.

Comment les lignées transformées se comportent-elles vis-à-vis du support par rapport aux lignées classiques ?

• Elles croissent en multicouches car elles ont perdu l'inhibition de contact et continuent de proliférer même à confluence.

Pourquoi les cellules cancéreuses ont-elles une indépendance vis-à-vis des facteurs de croissance externes ?

Parce qu'elles sont capables d'en produire elles-mêmes.

Quelles modifications génétiques majeures favorisent la prolifération infinie des lignées transformées ?

• L'activation d'oncogènes (qui stimulent la prolifération) et l'inhibition des gènes suppresseurs de tumeurs.

Quel est l'organisme mondial de référence qui répertorie et conserve les échantillons de lignées cellulaires ?

• L'ATCC (American Type Culture Collection).

Que sont les cellules HeLa et quelle est leur origine historique ?

• Ce sont les premières cellules humaines récoltées, provenant d'un cancer du col de l'utérus.

Qu'est-ce qu'un anticorps et de quoi est-il structurellement composé ?

C'est une protéine dirigée contre un antigène du non-soi, composée de deux chaînes légères, de deux chaînes lourdes et de régions variables.

Qu'est-ce qu'un épitope et grâce à quelle structure l'anticorps le reconnaît-il ?

L'épitope est la partie de l'antigène reconnue par l'anticorps grâce à son paratope.

Quelles sont les cellules productrices d'anticorps et en quoi se différencient-elles ?

Ce sont les lymphocytes B, qui se différencient en plasmocytes pour produire de grandes quantités d'anticorps.

Quelle est la différence fondamentale entre des anticorps polyclonaux et monoclonaux ?

• Polyclonaux : plusieurs anticorps qui reconnaissent un même antigène mais sur des épitopes différents.

• Monoclonaux : un seul type d'anticorps issu d'un seul clone de lymphocytes B, reconnaissant un unique épitope.

Qu'est-ce qu'un anticorps monoclonal conformationnel ?

C'est un anticorps qui reconnaît une partie de la protéine se repliant dans l'espace (structure tertiaire).

Qu'est-ce qu'un anticorps monoclonal séquentiel ?

C'est un anticorps qui reconnaît une séquence particulière d'acides aminés dans la structure primaire de la protéine.

Que signifie le suffixe -MAB à la fin des noms de médicaments ?

Il signifie Monoclonal Antibody (anticorps monoclonal). Tous les médicaments finissant par -MAB sont des anticorps.

Quel exemple d'anticorps monoclonal est cité pour le traitement anticancéreux du cancer du sein (immunothérapie) ?

Le trastuzumab

D'après les schémas manuscrits, à quoi sert l'ajout d'un "tampon détergent / dénaturant" sur le culot cellulaire ?

Il permet d'effectuer une lyse cellulaire pour libérer la protéine à détecter en la séparant des débris cellulaires.

Quelles sont les deux techniques utilisées pour détecter des protéines membranaires ou intracellulaires mentionnées en bas de page ?

L'immunocytochimie (ICC) ou l'immunocytofluorescence (ICF).

Quelle est la différence entre l'immuno-détection directe et indirecte ?

• Directe : L'anticorps qui porte la molécule rapporteuse se fixe directement sur la protéine à détecter.

• Indirecte : Un premier anticorps (primaire) se fixe sur la protéine, puis un second anticorps (secondaire) portant la molécule rapporteuse se fixe sur l'anticorps primaire.

Quelles sont les deux enzymes citées comme molécules rapporteuses ?

La Horse Radish Peroxydase (HRP) et la Phosphatase Alcaline (PA).

Quelles sont les deux molécules fluorescentes citées comme molécules rapporteuses ?

Le Texas Red et la Fluorescéine.

Par quels types d'appareils ou de méthodes réalise-t-on la détection de ces signaux membranaires ?

Par cytométrie en flux ou au microscope à fluorescence.

Quelle est la première étape indispensable pour une technique intracellulaire et quel produit utilise-t-on souvent ?

L'étape de fixation, souvent réalisée au paraformaldéhyde (PAF), pour s'assurer que le contenu cellulaire ne migrera pas par la suite.

Pourquoi doit-on réaliser une étape de perméabilisation juste après la fixation ?

Pour faire des trous dans la membrane afin de permettre à la solution d'anticorps de pénétrer à l'intérieur de la cellule.

Quel est le principe de la technique ELISA (technique en sandwich) ?

Des anticorps sont fixés au fond de plaques de 96 puits, on y verse le lysat (la protéine est capturée), puis on ajoute un second anticorps au-dessus pour la détecter.

Quel est le support de gel utilisé pour le Western-Blot et comment s'y séparent les protéines ?

Un gel de polyacrylamide parcouru par un courant électrique, où les protéines (chargées négativement) migrent et se séparent selon leurs tailles.

Pourquoi est-il obligatoire de transférer les protéines sur une membrane après la migration du Western-Blot ?

Parce qu'il est impossible de mettre des anticorps directement dans le gel ; on ne peut pas y détecter directement les protéines.

Quels sont les deux grands types de paramètres physiques mesurés en cytométrie en flux grâce à la diffraction des faisceaux lumineux ?

La taille cellulaire et la densité ou granulosité (taux d'organites dans la cellule).

Comment met-on en évidence des marqueurs de surface (immunophénotypage) en cytométrie en flux ?

Par immunodétection directe (anticorps primaire fluorescent) ou indirecte (anticorps secondaire fluorescent).

Quelle molécule fluorescente intercalante est citée pour détecter et quantifier l'ADN ?

L'iodure de propidium.

Quelle sonde fluorescente spécifique permet de détecter les paramètres mitochondriaux (masse, potentiel de membrane) ?

Le mitotracker

Dans quel domaine clinique la cytométrie en flux est-elle utilisée pour le diagnostic d'hémopathies ?

En hématologie (notamment via la NFS).

Quel autre nom donne-t-on au trieur de cellules ?

La technique FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting)

Sur quel principe physique repose le tri des cellules après leur passage devant le rayon laser du FACS ?

L'appareil confère une charge électrique (positive ou négative) aux gouttelettes contenant les cellules, ce qui permet de les attirer à différents endroits selon leur charge.

Sur quels types de lignées cellulaires réalise-t-on majoritairement les modifications de gènes ?

Sur les cellules immortalisées ou transformées.

Quelle est la définition exacte de la transfection ?

C'est l'apport d'un gène étranger par un vecteur d'expression non-viral, qui est généralement un plasmide.

Quels sont les deux types de séquences spécifiques apportés par un plasmide modifié in vitro en plus du gène d'intérêt ?

• Une séquence promotrice forte (pour contrôler l'expression).

• Un gène de résistance à un antibiotique.

Quelles sont les deux enzymes utilisées pour ouvrir un plasmide puis y intégrer le fragment du gène d'intérêt ?

Une enzyme de restriction (pour retirer un fragment) et une ligase (pour réaliser la jointure).

Comment fonctionne l'introduction d'un gène par un agent lipofectant ?

On utilise des liposomes (lipides cationiques) qui interagissent avec l'ADN du plasmide et les lipides de la membrane pour favoriser l'entrée du gène.

Quel est le principe de la méthode d'électroporation ?

On applique un champ électrique qui conduit à la formation de pores dans la membrane cellulaire, permettant au plasmide d'entrer.

Comment sélectionne-t-on uniquement les cellules correctement transfectées dans la boîte de culture ?

On applique l'antibiotique dans le milieu ; seules les cellules transfectées résistent et survivent, éliminant toutes les autres.

Quelle est la définition exacte de l'infection en biologie cellulaire ?

C'est l'apport d'un gène exogène par un vecteur d'expression de type virale

Quel type de virus à ADN est fréquemment cité et utilisé comme vecteur d'expression pour l'infection ?

Les adénovirus.

Pourquoi produit-on une protéine de fusion (protéine + étiquette) en laboratoire ?

Pour pouvoir étudier et suivre une protéine dont on ne connaît pas l'anticorps spécifique capable de la détecter.

Quelle est la propriété principale de l'étiquette poly-histidine ?

Elle confère une forte affinité pour le nickel, permettant de coupler le nickel à une enzyme (PA ou HRP) pour générer des capacités chromogènes et détecter la protéine.

Quelle étiquette enzymatique possède une forte affinité pour le glutathion et permet de purifier la protéine à l'aide de billes par centrifugation ?

Le GST (Glutathion S-Transférase).

Quel est le grand avantage de l'ajout d'une étiquette de fluorescence comme la GFP (Green Fluorescence Protein) ?

Elle permet de visualiser directement la protéine sous un microscope et de connaître sa localisation précise dans la cellule.

En quoi consiste la technique de la micro-injection ?

Elle utilise un microscope et un contrôleur pour manipuler un bras portant une aiguille fine afin d'injecter directement une protéine dans quelques cellules.

Sur quel type de cellules (adhérentes ou non) réalise-t-on le plus souvent la micro-injection, et que fait-on si elles ne le sont pas ?

Elle se fait le plus souvent sur des cellules adhérentes. Si elles ne sont pas adhérentes, on utilise un mécanisme par aspiration pour les maintenir en place.

Quelle application clinique majeure de la PMA utilise la micro-injection ?

L'ICSI (injection intracytoplasmique de spermatozoïde).

Quel détergent chimique spécifique est mentionné pour l'étape de perméabilisation des protéines intracellulaires (Étape 2) ?

Le Triton X-100 (qui crée des pores dans la membrane après la fixation au paraformaldéhyde).

Quelle molécule fluorescente spécifique utilise-t-on pour mesurer le flux de $Ca^{2+}$ (permettant notamment d'observer la contraction musculaire) ?

Le fluo-3.

Sur quel grand principe physique est basée la technique du fractionnement cellulaire ?

Sur la centrifugation différentielle après homogénéisation cellulaire.

Quel est l'élément cellulaire récupéré au fond du tube lors de la première centrifugation à basse vitesse ?

Le noyau (car c'est l'élément non lysé le plus rapide à aller au fond).

Quels organites récupère-t-on au fond du tube lors de la deuxième étape à vitesse moyenne ?

Les mitochondries, les lysosomes et les peroxysomes.

Quels éléments retrouve-t-on au fond du tube après la dernière étape à grande vitesse, et que reste-t-il dans le surnageant ?

• Au fond : Les microsomes.

• Dans le surnageant : Les ions, l'eau et les ribosomes.

Quelle est la règle générale reliant la vitesse de centrifugation et la densité des éléments récupérés ?

Plus on centrifuge vite, plus on récupère des éléments de faible densité.