Hoofdstuk 1 - Substraat

Onderdelen hoofdstuk Substraat

1. Media formuleringen

2. Nutriëntbronnen

3. Media sterilisatie

Algemeen fermentatieproces

1.1 Mediaformuleringen - 6 basisonderdelen van een fermentatieproces

1. Formulering van het medium voor de kweek van het organisme (ontwikkelen van inoculum + productiefermentor)

2. Sterilisatie van medium, fermentor en bijkomende apparatuur

3. Productie van actieve, zuivere cultuur in voldoende hoeveelheid om de productievat te inoculeren

4. Groei van het organisme in de productiefermentor onder optimale omstandigeden voor productvorming

5. Extractie en zuivering van het product

6. Verwerking/afvoer van het effluent van het proces

1.1 Mediaformuleringen - Algemene vereisten voor een goed mediumontwerp

• maximale opbrengst (yield)

• maximale snelheid van productvorming

• minimale vorming van ongewenste bijproducten

• goed beschikbare mediumcomponenten

• minimale problemen bij sterilisatie

• minimale problemen tijdens het fermentatieproces

1.1 Mediaformuleringen - Ontwerpprincipe

• Start met stoichiometrische vergelijking voor groei en productvorming

• Laat kwantitatieve berekening toe van minimaal benodigde nutriënten → vermijdt verspilling

• Basis = minerale oplossing met alle anorganische nutriënten

  • 1 g K₂HPO₄

  • 0,2 g MgSO₄·7H₂O

  • 0,01 g FeSO₄·7H₂O

  • 0,01 g CaCl₂

  • sporenelementen (Zn, Mn, Mo, Cu, Co; elk 0,5 mg)

  • 1 l water

  • koolstof-, energie-, stikstofbron en eventuele extra groeifactoren

1.1 Mediaformuleringen - Reactievergelijkingen Aerobe microorganismen

koolstof-/energiebron + N-bron + O2 + mineralen → BM + CO2 + H2O + warmte + producten

1.1 Mediaformuleringen - Reactievergelijkingen Anaerobe microorganismen

koolstof-/energiebron + N-bron + mineralen → BM + CO2 + H2O + warmte + producten

1.1 Mediaformuleringen - Elementaire samenstelling MO

CH(x)O(y)N(z)

1.1 Mediaformuleringen - Doel C-bron

• biosynthese = biomassa productie → Y_c

Y_{c}\left(\frac{g}{g}\right)=\frac{\differentialD x}{dS} = (hoeveelheid cel-DM geproduceerd)/(hoeveelheid C-bron verbruikt)

• energiegeneratie

m = maintenance coëfficient = (g C-bron/g cellen/ h) ~= 0,01 - 0,04 g/g/h

• productvorming

→ totale snelheid van C-bron consumptie = \frac{dS}{\differentialD t}=\frac{\mu x}{Y_{c}}+mx+\frac{q_{p}x}{Y_{\frac{p}{S}}}

$q_{p}$ = snelheid waarmee een specifiek product gevormd wordt

$Y_{\left(\frac{p}{S}\right)}$ = conversie factor voor substraat naar product

µ = groeisnelheid

1.1 Mediaformuleringen - Uit wat bestaan MO

1.2 Nutriëntbronnen - Verschillende type media

• Simpel

• Complex

• Gedefinieerd/ synthetisch

• Selectief

• Differentieel

• Minimaal

• Verrijkt

1.2 Nutriëntbronnen - Verschillende type media: Simpel

Algemeen media gebruikt om normale MO te kweken of cultiveren (bv. agar)

1.2 Nutriëntbronnen - Verschillende type media: Complex

De exacte concentratie van alle componenten in het media is niet geweten

1.2 Nutriëntbronnen - Verschillende type media: Gedefinieerd/Synthetisch

Alle componenten en concentraties zijn van het media zijn geweten

bv. bij productie van vitamine B12 wil je dat kobalt aanwezig is in het media omdat deze nodig is in de structuur van vitamine B12

1.2 Nutriëntbronnen - Verschillende type media: Selectief

Gebruiken voor de groei van geselecteerde MO

bv. enkel resistente stammen van antiobioticum groeien

1.2 Nutriëntbronnen - Verschillende type media: Differentieel

Gebruiken om types MO te onderscheiden van andere types MO groeiend op hetzelfde medium

bv. lactosefermentatie → kleurverandering bij lactose-positieve stammen

1.2 Nutriëntbronnen - Verschillende type media: Minimaal

Bevat enkel strikt essentiële nutriënten

bv. selectie van auxotrofe mutanten = groeien niet zonder extra toevoeging

1.2 Nutriëntbronnen - Verschillende type media: Verrijkt

Vaak gebruikt om verschillende types MO te oogsten van dezelfde bron

1.2 Nutriëntbronnen - Macro- en Micronutriënten

Macronutriënten

• koolstof (C): nodig voor groei, productvorming en als E-bron

• zuurstof (O): nodig voor de groein van aerobe organismen

• stikstof (N): essentieel voor eiwitsynthese

• waterstof (H): bouwsteen van koolhydraten, lipiden, eiwitten en nucleïnezuren

• zwavel (S) en fosfor (P): bouwsteen van koolhydraten, lipiden, eiwitten en nucleïnezuren

  • bv. S → zwavelhoudende AZ

  • bv. P → ATP, fosfolipiden

Kationen

• Calcium (Ca2+): celactivatie, hittebestendigheid van endosporen, activiteit van een aantal enzymen

• Kalium (K+): cofactor voor veel enzymen, stabiliseert membranen en ribosomen

• Magnesium (Mg2+): cofactor voor enzymen, stabilisatie van membranen en ribosomen

• Ijzer (Fe2+, Fe3+): onderdeel van cytochromen, cofactor voor enzymen en elektrondragende eiwitten

Sporenelementen

• Mn,Zn,Mo,Co,Ni,Cu

  • enzym en cofactoren

  • katalyse van reacties

  • behoud eiwitstructuur

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen

1. (Water)

2. Energiebronnen

3. Koolstofbronnen

4. Stikstofbronnen

5. Mineralen

6. Chelatoren

7. Groeifactoren

8. Buffers

9. Precursoren en metabolische regulatoren

10. Zuurstof

11. Antifoam

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen: water (1)

• Hoofdbestanddeel van alle fermenatiemedia !!

• Grote hoeveelheden nodig, met constante samenstelling

• Controle van pH, opgeloste zouten en contaminatie met afvalwater

• Hergebruik van water is hoge prioriteit

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen: Energiebronnen (2)

• Komt uit oxidatie van mediumcomponenten of uit licht

Meeste MO = chemo-organotrofen → koolstofbron = energiebron

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen: Koolstofbronnen (3)

• Meest gebruikt: koolhydraten, oliën en vetten, koolwaterstoffen (en derivaten)

  • Koolhydraten: pentosen, hexosen, di-, tri-, polysachariden, glucosiden, polyolen

  • Problemen met koolhydraten: hydrolyse of oxidatie van complexe suikers bij verhitting, Maillard-reactie, gelatinisatie van zetmeel

• Industrieel gebruik wegens de kostprijs van zuivere stoffen: maïs- of aardappelzetmeel, mout, suikerriet/suikerbiet, melasse, corn steep liquor, cellulose, wei

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen: Koolstofbronnen (3) - zetmeel, dextrine en mout

• niet elk MO kan zetmeel verwerken → amylase is nodig

• Dextrine = gehydrolyseerd zetmeel (geknipt met amylase, kortere stukken) → nog steeds glucoamylase nodig

• Mout = zetmeel uit graan dat voorgehydrolyseerd is door amylase + bevat ook N en as

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen: Koolstofbronnen (3) - melasse

• Europa: melasse van suikerbiet

• Azië: melasse van suikerriet

• Sterilisatie is cruciaal, want de contaminatiegraad is hoog

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen: Koolstofbronnen (3) - wei

• gebruikt als koolstofbron of als poeder in voedingstoepassingen

• lactose is moeilijk te verwerken als het MO geen melkzuurbacterie (MZB) is

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen: Koolstofbronnen (3) - Sulfite waste liquor

• rijk aan koolstofbronnen

• mannose en xylose zijn moeilijk te verwerrken voor bacteriën, beter voor schimmels

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen: Koolstofbronnen (3) - cellulose

• enkel als koolstofbron voor schimmelfermentatie, want cellulase is nodig

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen: Koolstofbronnen (3) - oliën en vetten

• dierlijk, maar vaker plantaardig (restproducten van olieraffinage bv. perskoek)

• kunnen ook als antischuimmiddel dienen

• enkel gebruiken wanneer echt nodig (bv. als MO een vetafgeleid product moet maken of lipase moet produceren)

• Probleem: vetten mengen niet met waterig milieu

• Oplossing:

  • emulgatoren

  • hard roeren

  • plug-flowreactor: lange smalle buis met afwisselend water- en vetfase (MO in waterfase en verschuiven naar interfase met vet waar dus koolstofbron zit)

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen: Koolstofbronnen (3) - koolwaterstoffen

• minder gebruikt

• n-alkanen kunnen interessant zijn voor organische zuren en AZ

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen: Koolstofbronnen (3) - alcoholen

• ethanol: industriële productie van azijnzuur

• methanol: single cell (protein)

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen: Stikstofbronnen (4)

Algemeen

• Meeste MO kunnen inorganische én organische stikstofbronnen gebruiken

• groei is vaak sneller met organische N

• Complexe organische bronnen = goedkoper en makkelijk beschikbaar

Anorganisch stikstof

• ammonia, ammoniumzouten, nitraten

Organisch stikstof

• AZ, eiwit, ureum

• complex organisch stikstof:

  • eiwitten (melkeiwitten, vleeseiwitten, planteiwitten), eiwithydrolysaten (peptonen)

    • MO moet proteasen produceren

  • corn steep liquor: op voorhand aan het water sulfiet toevoegen als anti-microbiele component

  • Distiller’s byproducts: koek die overblijft na bio-ethanolproductie

  • Gistextracten: bevatten celwand met bèta-glucanen → belangrijk omdat ze enzym of immuunstimulerend zijn

  • Gisthydrolysaat: afbraakproduct van de gistcelwand → gebruiken in diervoeding en als smaakcomponent

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen: Mineralen (5)

• essentieel voor de groei van alle levende cellen

• Lage concentraties stimuleren de groei, hoge concentraties remmen de groei

• Sporenelementen zijn nodig, maar zitten meestal al als onzuiverheden in complexe ingrediënten

• Minerale oplossingen worden vaak gebruikt om MO-suspensies of verdunningsreeksen te maken

• Meeste mineralen al in ruwe N-bronnen en C-bronnen

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen: Chelatoren (6)

• zichtbare neerslag van onoplosbare metaalfosfaten weg krijgen

• (bv. EDTA, citroenzuur, polyfosfaten)

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen: Groeifactoren (7)

bv. vitaminen, specifieke AZ, vetzuren, sterolen

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen: Buffers (8)

• pH-controle is cruciaal voor optimale productiviteit

bv. peptones, vleesextract, fosfaten (ook essentieel voor groei)

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen: Precursoren en metabole regulatoren (9)

• sturen productvorming ipv groei

bv. precursoren, inhibitoren, inductoren

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen: Zuurstof (10)

beschikbaarheid is bepalend voor groei en metabolietproductie

1.2 Nutriëntbronnen - Bronnen: antifoam (11)

• Oorzaak schuimvorming:

  • een mediumcomponent of factor die door het MO zelf wordt geproduceerd

  • aanwezigheid van eiwitten

• Ongecontroleerd schuim geeft fysische problemen

• Oplossing: antifoams

  • hydrofobe bruggen tussen 2 oppervlakken

  • verdringing van het geadsorbeerde eiwit

  • snelle uitspreiding over het oppervlak van de film

→ oppervlaktespanning van het schuim verlagen