Analizy molekularne DNA oraz RNA. Zasady i rodzaje reakcji PCR. Enzymy w biologii molekularnej

Zestaw 40 fiszek pojęciowych obejmujący zagadnienia analizy molekularnej DNA i RNA, techniki PCR, enzymów restrykcyjnych, markerów genetycznych oraz metod izolacji i diagnostyki molekularnej.

Substraty reakcji PCR

Niezbędne składniki mieszaniny reakcyjnej PCR: matryca DNA, enzym termostabilna polimeraza DNA, startery, dNTP (trifosforany deoksyrybonukleozydów), jony $Mg^{2+}$, bufor, woda oraz wzmacniacz reakcji.

Zastosowania reakcji PCR

Powielanie fragmentu genomu patogenu (bakterie, wirusy, grzyby, pierwotniaki) w celu potwierdzenia infekcji lub inwazji, amplifikacja in vitro DNA i RNA przepisanego na cDNA, alternatywa dla klonowania rzadkich sekwencji oraz badania kryminalistyczne na starych i znikomych śladach biologicznych.

Denaturacja (etap PCR)

Pierwszy etap cyklu PCR zachodzący w temperaturze 95^\rigth stopni ($95^\text{o}\text{C}$), polegający na termicznym rozdzieleniu dwuniciowego DNA na pojedyncze nici matrycowe.

Annealing / Hybrydyzacja (etap PCR)

Drugi etap cyklu PCR prowadzony w temperaturze $55\text{--}65$ stopni ($55\text{--}65^\text{o}\text{C}$), polegający na swoistym przyłączaniu się starterów (primerów) do komplementarnych sekwencji jednoniciowej matrycy DNA.

Elongacja (etap PCR)

Trzeci etap cyklu PCR przebiegający w optymalnej temperaturze działania polimerazy wynoszącej $72$ stopnie ($72^\text{o}\text{C}$), podczas którego następuje synteza nowej nici DNA i wydłużanie łańcucha.

Enzymy restrykcyjne (restryktazy)

Endonukleazy DNA pochodzące z komórek bakterii i sinic, które rozpoznają specyficzne dla siebie sekwencje nukleotydowe i przecinają w nich lub w ich pobliżu cząsteczkę DNA, służąc do otrzymywania zdefiniowanych fragmentów DNA.

Podział enzymów restrykcyjnych ze względu na długość sekwencji

Klasyfikacja restryktaz na enzymy czwórkowe, szóstkowe oraz ósemkowe, wynikająca z długości rozpoznawanej przez nie sekwencji (np. enzymy szóstkowe rozpoznają sekwencję składającą się z $6$ nukleotydów).

Startery do PCR (primery)

Krótkie fragmenty jednoniciowego DNA o długości około $20$ nukleotydów; w reakcji stosuje się dwa startery oskrzydlające kopiowany fragment, wiążące się komplementarnie z przeciwnymi nićmi matrycy na jego krawędziach.

Wektory genetyczne

Niewielkie cząsteczki DNA powszechnie stosowane w inżynierii genetycznej, zdolne do autonomicznej replikacji w komórce gospodarza; po wbudowaniu obcego fragmentu DNA tworzą zrekombinowany DNA podlegający powielaniu (np. plazmidy, bakteriofagi).

Kosmidy

Sztucznie skonstruowane wektory genetyczne będące połączeniem plazmidu oraz sekwencji pochodzących z genomu bakteriofaga.

dNTP

Deoksyrybonukleotydotrifosforany wchodzące w skład mieszaniny reakcyjnej PCR oraz sekwencjonowania (dATP, dTTP, dGTP oraz dCTP), stanowiące jednostki budulcowe niezbędne do syntezy nowej nici DNA.

Liczba cykli w reakcji PCR

Standardowa liczba powtórzeń cyklu termicznego w mieszaninie reakcyjnej, wynosząca najczęściej około $40\text{--}45$ cykli.

Czynniki doboru metody izolacji DNA

Parametry determinujące wybór procedury izolacji: rodzaj badanego kwasu nukleinowego (np. mitochondrialny), pochodzenie próbki (np. komórka roślinna), rodzaj materiału badawczego (np. tkanka żywego organizmu) oraz cel pobrania materiału genetycznego.

Rola jonów magnezu ($Mg^{2+}$) w reakcji PCR

Kofaktor polimerazy DNA warunkujący wydajne przyłączanie enzymu do kompleksu starter-matryca oraz wydajną elongację; zbyt małe stężenie powoduje gwałtowny spadek wydajności reakcji, a zbyt duże prowadzi do niespecyficznych produktów i błędów insercji nukleotydów.

Markery molekularne

Niekodujące sekwencje nukleotydowe występujące w co najmniej dwóch formach allelicznych, dziedziczone zgodnie z prawami Mendla i niezależne od czynników środowiskowych oraz fazy rozwojowej, których polimorfizm pozwala różnicować osobniki.

Marker genetyczny

Wyznacznik stanowiący dowolną genetycznie uwarunkowaną cechę fenotypową lub genetyczną różnicę służącą do uwidocznienia polimorfizmu osobniczego; może nim być dowolny fragment DNA lub białko.

Zastosowanie markerów molekularnych

Wykrywanie zmutowanych genów w jednostkach chorobowych, ocena predyspozycji do zachorowań, ustalanie ojcostwa, konstruowanie map genetycznych oraz identyfikacja zwłok i śladów przestępców w kryminalistyce.

Marker VNTR

Typ markera SSLP oparty na zmiennej liczbie powtórzeń tandemowych w sekwencjach minisatelitarnych, którego analiza opiera się na technice hybrydyzacji DNA.

Marker STR

Marker mikrosatelitarny oparty na prostych powtórzeniach tandemowych, powielany i analizowany za pomocą reakcji PCR z użyciem specyficznych starterów.

Marker SNP

Marker polimorfizmu pojedynczego nukleotydu, powielany i identyfikowany z wykorzystaniem metody PCR oraz swoistych starterów.

RFLP (polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych)

Technika polegająca na trawieniu DNA specyficznymi enzymami restrykcyjnymi po uprzedniej amplifikacji w PCR, a następnie elektroforetycznym rozdziale fragmentów w celu uzyskania unikalnego dla danego genu wzoru restrykcyjnego.

Zastosowanie metody RFLP

Analiza powiązań rodzinnych, identyfikacja osób w kryminalistyce (z próbek krwi, włosów czy nasienia), mapowanie genów w hodowli roślin (np. odporność na suszę) oraz diagnostyka mutacji punktowych (fenyloketonuria, hemofilia, niedokrwistość sierpowata).

Jednostka restrykcyjna

Ilość enzymu restrykcyjnego wymagana do całkowitego strawienia $1\,\mu\text{g}$ DNA faga lambda (o wielkości około $50\text{ kb}$) w czasie $1$ godziny w temperaturze $37^\text{o}\text{C}$.

Etapy izolacji DNA na kolumnach

Czteroetapowa procedura obejmująca: wstępne przygotowanie próbki, nałożenie preparatu na kolumnę, odpłukanie zanieczyszczeń preparatu oraz elucję (wymywanie) oczyszczonych kwasów nukleinowych z kolumny.

Przyczyny trudności w izolacji RNA

Znaczna podatność RNA na degradację przez wszechobecne, stabilne rybonukleazy, konieczność dokładnego usunięcia towarzyszącego DNA oraz konieczność eliminacji pozostałych rodzajów RNA podczas izolacji mRNA.

Markery SSR

Amplifikowane sekwencje mikrosatelitarne obecne na wszystkich chromosomach, wykazujące wysoki polimorfizm wynikający z różnej liczby powtórzeń sekwencji podstawowej i zróżnicowanej długości fragmentów.

Izoschizomery

Enzymy restrykcyjne wyizolowane z odmiennych szczepów bakterii, które rozpoznają dokładnie tę samą sekwencję nukleotydową w cząsteczce DNA.

Tępe końce DNA

Końce cząsteczki DNA powstałe po symetrycznym cięciu restrykcyjnym na tej samej wysokości obu nici, pozbawione niesparowanych, jednoniciowych nukleotydów.

Lepkie końce DNA

Jednoniciowe nadwieszenia powstałe w wyniku niesymetrycznego rozcięcia obu nici DNA; koniec $5'$ zawiera zwykle $2\text{--}6$ niesparowanych nukleotydów, a koniec $3'$ zawiera $2\text{--}4$ niesparowane nukleotydy.

Metoda spektrofotometryczna w analizie DNA

Technika analityczna oparta na pomiarze pochłaniania promieniowania przez roztwór badanej substancji, stosowana do detekcji, oznaczania ilościowego oraz weryfikacji stopnia czystości wyizolowanego DNA.

Wzór restrykcyjny

Specyficzny dla danego genu zestaw i układ prążków DNA o określonej masie cząsteczkowej, powstający w żelu po cięciu enzymami restrykcyjnymi i rozdziale elektroforetycznym.

Metody przesiewowe PCR

Techniki laboratoryjne (np. PCR-SSCP, PCR-DGGE) umożliwiające identyfikację zmian we właściwościach fizykochemicznych cząsteczek DNA spowodowanych odmiennym składem nukleotydowym.

Polimeraza Taq

Termostabilna polimeraza DNA wyizolowana z bakterii termofilnej, charakteryzująca się odpornością na wielokrotne etapy denaturacji termicznej w cyklach PCR.

RT-Q-PCR (ilościowy PCR w czasie rzeczywistym)

Metoda amplifikacji DNA umożliwiająca jednoczesne powielanie i ilościowe monitorowanie kinetyki reakcji w czasie rzeczywistym poprzez pomiar wzrostu fluorescencji w kolejnych cyklach.

Sonda molekularna TaqMan

Znakowana fluorescencyjnie sonda oligonukleotydowa komplementarna do sekwencji DNA leżącej pomiędzy starterami, posiadająca barwnik reporterowy na końcu $5'$ oraz wygaszacz na końcu $3'$; hydroliza sondy podczas elongacji uwalnia mierzalną fluorescencję.

Wpływ mutacji na wzór restrykcyjny RFLP

Uzyskanie w elektroforezie o $1$ fragment za mało świadczy o mutacji w obrębie dotychczasowego miejsca cięcia enzymu, natomiast uzyskanie o $1$ fragment za dużo oznacza zajście mutacji tworzącej nowe miejsce restrykcyjne.

Nested PCR (gniazdowa / wewnętrzna PCR)

Odmiana PCR wykorzystująca dwie pary starterów: w pierwszej kolejności startery zewnętrzne amplifikują dłuższy fragment DNA, po czym produkt ten staje się matrycą w kolejnej reakcji ze starterami wewnętrznymi, co znacznie podnosi swoistość i czułość.

PCR-SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)

Przesiewowa metoda badająca polimorfizm konformacji pojedynczej nici w żelu; po denaturacji jednoniciowy DNA przyjmuje sekwencyjnie zależną strukturę przestrzenną, dzięki czemu odmienna ruchliwość elektroforetyczna pozwala wykryć mutacje punktowe i różnice alleliczne.

ASA-PCR (amplifikacja allelo-specyficzna)

Technika PCR dedykowana identyfikacji polimorfizmu alleli oraz znanych mutacji punktowych leżących poza miejscami cięcia restrykcyjnego, oparta na projektowaniu starterów specyficznie różnicujących allel prawidłowy od zmienionego.

Multipleks PCR

Reakcja amplifikacji kilku różnych fragmentów DNA w jednej mieszaninie reakcyjnej przy jednoczesnym użyciu kilku par starterów; produkty muszą różnić się długością w elektroforezie, a brak powstania prążka świadczy o delecji badanego genu.