Metoder i cellebiologi - kap 10

Hvad hedder de fire kvælstofbaser i DNA?

De fire kvælstofbaser i DNA er adenin (A), thymin (T), cytosin (C) og guanin (G). Adenin parrer med thymin (A–T), og cytosin parrer med guanin (C–G).

Hvad er restriktionsenzymer, og hvordan bruges de til at kløve og sammenføje DNA?

Restriktionsenzymer er bakterielle enzymer, der beskytter mod fremmed DNA ved at genkende og kløve korte, specifikke DNA-sekvenser, som altid er den samme sekvens. De kan danne blunt ends, som er lige ender uden overhæng, eller sticky ends, som er enkeltstrengede overhæng, der kan baseparre med hinanden. DNA-ligase er et enzym, der kan sammenføje DNA-fragmenterne.

Hvordan adskilles DNA-fragmenter med gelelektroforese?

Ved gelelektroforese placeres DNA i en agarosegel, og et elektrisk felt får det negativt ladede DNA til at bevæge sig mod den positive pol. Små DNA-fragmenter bevæger sig hurtigere gennem gelen end store og adskilles derfor efter størrelse. Fragmenterne ses som bånd ved hjælp af et fluorescerende farvestof. DNA-ladder bruges til at estimere størrelse.

Hvordan kan DNA-ligase bruges til at danne rekombinant DNA?

Rekombinant DNA er DNA sammensat af DNA fra forskellige kilder. DNA-ligase sammenføjer DNA-fragmenterne, og hvis fragmenterne har inkompatible sticky ends, kan DNA-polymerase først tilføje de manglende baser. ATP leverer energi til sammenføjningen

Hvordan bruges plasmider til at klone DNA?

Et plasmid er et lille, cirkulært DNA-molekyle, hvor et ønsket DNA-fragment kan indsættes. Plasmidet klippes med restriktionsenzym, og DNA-fragmentet indsættes i plasmidet ved hjælp af DNA-ligase. Plasmidet indsættes derefter i en bakterie, som formerer sig og dermed laver mange kopier af plasmidet og DNA-fragmentet.

Hvad er et genomisk DNA-bibliotek?

Et genomisk DNA-bibliotek er en samling af DNA-fragmenter fra hele genomet, som indsættes i plasmider og fordeles mellem mange bakterier. Hver bakterie indeholder et forskelligt DNA-fragment, så bakterierne tilsammen repræsenterer hele genomet. Biblioteket kan bruges til at finde og isolere bestemte DNA-sekvenser fra genomet.

Hvad er revers transkriptase?

Revers transkriptase er et enzym, der bruger RNA som skabelon til at danne en komplementær DNA-streng. RNA'et fjernes derefter, og DNA-polymerase bruger den første DNA-streng som skabelon og danner den anden DNA-streng ved at tilføje komplementære baser. Dermed dannes dobbeltstrenget cDNA, som er DNA lavet ud fra RNA.

Hvad er et cDNA-bibliotek, og hvordan adskiller det sig fra et genomisk DNA-bibliotek?

Et cDNA-bibliotek laves ud fra en celles mRNA, som omdannes til DNA ved hjælp af revers transkriptase og DNA-polymerase. Det indeholder derfor hovedsageligt de gener, der udtrykkes i cellen, uden introns,

Hvad er DNA-denaturering og hybridisering, og hvordan kan det bruges til at finde en bestemt DNA-sekvens?

Ved DNA-denaturering opvarmes DNA, så de to strenge skilles. Ved afkøling kan komplementære strenge binde sammen igen, hvilket kaldes hybridisering. En kort DNA-probe med et fluorescerende stof kan binde til den DNA-sekvens, man leder efter, med komplementære baser. Fluorescensen gør det derefter muligt at finde den ønskede DNA-sekvens.

Hvad er PCR, og hvordan foregår det?

PCR bruges til at lave mange kopier af en bestemt DNA-sekvens. Først opvarmes DNA, så de to strenge skilles (denaturering). Derefter afkøles DNA, så en primer binder til hver af de to DNA-strenge ved den sekvens, man ønsker at kopiere, og markerer, hvor kopieringen skal begynde (annealing). DNA-polymerase bygger derefter videre fra primerne og danner nye DNA-strenge (extension). Processen gentages mange gange, så der dannes mange kopier af den ønskede DNA-sekvens.

Hvad er qPCR, og hvordan bruges det til at måle genekspression?

Ved qPCR isoleres mRNA fra cellerne og omdannes først til cDNA med revers transkriptase. cDNA'et opformeres derefter med PCR, mens et fluorescerende signal måles for hver cyklus. Jo mere mRNA der oprindeligt var fra et bestemt gen, desto mere cDNA er der fra genet, og desto tidligere bliver fluorescensen målbar. Derfor kan qPCR bruges til at undersøge, hvor meget et bestemt gen udtrykkes.

Hvad er princippet bag Sanger-sekventering?

Ved Sanger-sekventering kopieres en DNA-streng med DNA-polymerase. Under kopieringen indsættes nogle gange et ddNTP, som stopper kopieringen, så der dannes DNA-fragmenter af forskellige længder. Fragmenterne sorteres fra kortest til længst, og den sidste base i hvert fragment aflæses, så DNA-sekvensen kan bestemmes.

Hvad er automatiseret Sanger-sekventering?

Ved automatiseret Sanger-sekventering er de fire forskellige ddNTP'er mærket med hver sin fluorescerende farve. DNA-fragmenterne adskilles efter længde, og når de passerer en detektor fra kortest til længst, registreres farven på det ddNTP, der sidder som sidste base i hvert fragment. Farverne viser dermed rækkefølgen af A, T, C og G, så hele DNA-sekvensen kan aflæses.

Hvad er clone-by-clone sequencing?

Clone-by-clone sequencing bruges til at organisere genomet i den rigtige rækkefølge, før det sekventeres. Genomet opdeles i store, overlappende DNA-fragmenter, som indsættes i BAC'er. Fragmenternes restriktionsmønstre sammenlignes. Hvis to fragmenter har dele af det samme mønster, tyder det på, at de indeholder overlappende DNA, og man kan dermed finde ud af, hvordan fragmenterne ligger i forhold til hinanden.

Hvad er shotgun sequencing?

Ved shotgun sequencing opdeles flere kopier af genomet tilfældigt i mange overlappende DNA-fragmenter, som sekventeres hver for sig. En computer sammenligner derefter DNA-sekvenserne, finder hvor de overlapper og bruger dette til at samle den oprindelige genomsekvens.

Hvordan fungerer Illumina-sekventering?

Ved Illumina-sekventering bindes millioner af DNA-fragmenter til en overflade, og hvert fragment kopieres mange gange med PCR, så der dannes et cluster af identiske DNA-fragmenter. DNA-polymerase tilføjer derefter én komplementær, fluorescerende base til hvert DNA-fragment. Basen blokerer midlertidigt for, at den næste base kan tilføjes, så et kamera kan registrere farven og dermed bestemme, hvilken base der blev tilføjet. Farven og blokeringen fjernes derefter, så den næste base kan tilføjes. Dette gentages, så DNA-sekvensen aflæses én base ad gangen.

Hvad er comparative genomics, og hvad bruges BLAST til?

Comparative genomics går ud på at sammenligne DNA- eller proteinsekvenser mellem organismer. BLAST bruges til at sammenligne en sekvens med kendte sekvenser i databaser, så man ud fra ligheder kan finde beslægtede gener eller proteiner og få en idé om deres funktion.

Hvad er RNA-Seq, og hvad bruges det til?

RNA-Seq bruges til at undersøge, hvilke gener der udtrykkes i en celle, og hvor meget de udtrykkes. Cellens mRNA omdannes til cDNA og sekventeres, hvorefter sekvenserne kobles tilbage til generne. Jo flere sekvenser der findes fra et bestemt gen, desto mere mRNA var der fra genet, og desto højere var genets ekspression.

Hvad er single-cell RNA-Seq?

Single-cell RNA-Seq bruges til at undersøge genekspressionen i individuelle celler. mRNA fra hver celle mærkes med en unik barcode, så man efter sekventeringen kan se, hvilke gener der udtrykkes i hver celle, og gruppere celler med lignende genekspression.

Hvad er GFP, og hvad bruges det til?

GFP (green fluorescent protein) er et fluorescerende protein, der bruges som reporter til at gøre bestemte celler eller proteiner synlige. Ved at få bestemte celler til at producere GFP kan man følge dem i levende organismer, og ved at bruge flere forskellige fluorescerende proteiner kan man give celler forskellige farver og dermed skelne dem fra hinanden.

Hvordan kan mutationer bruges til at undersøge et gens funktion?

Man kan mutere et gen, så det mister sin funktion, og derefter undersøge, hvordan organismens fænotype ændres. Mutationen kobles derefter til det pågældende gen, og ud fra ændringen i fænotypen kan man få en idé om, hvilken funktion genet normalt har.

Hvad er RNA-interferens (RNAi), og hvordan bruges det til at undersøge geners funktion?

RNA-interferens bruges til midlertidigt at reducere et bestemt gens aktivitet. Dobbeltstrenget RNA, der matcher genet bliver introduceret. Det nedbrydes til korte siRNA'er i organismen, som binder til det tilsvarende mRNA og får det nedbrudt, så der dannes mindre af genets protein. Dette kaldes gene knockdown.

Hvad er knockout og knock-in?

Ved knockout gøres et bestemt gen inaktivt, så man kan undersøge, hvad der sker, når genet ikke fungerer. Ved knock-in indsættes eller ændres en bestemt DNA-sekvens i genet, så man kan undersøge effekten af den ønskede genetiske ændring.

Hvad er CRISPR-Cas9, og hvordan bruges det til at ændre gener?

CRISPR-Cas9 bruges til målrettet at ændre DNA. Et guide-RNA er designet til at binde til den DNA-sekvens, man ønsker at ændre, og leder Cas9-proteinet dertil. Cas9 klipper begge DNA-strenge, og når bruddet repareres, kan genet ændres eller erstattes med en ønsket DNA-sekvens.

Hvordan kan CRISPR-Cas9 bruges til at tænde eller slukke for et gen uden at klippe DNA'et?

Man kan bruge en inaktiv Cas9, som ikke kan klippe DNA, men stadig kan ledes til et bestemt gen af guide-RNA. Cas9 kobles til enten en transkriptionsaktivator, der tænder genet, eller en transkriptionsrepressor, der slukker genet.

Hvordan kan man fremstille en transgen plante?

Agrobacterium kan bruges til at overføre et ønsket DNA til planteceller. De genetisk ændrede planteceller udvælges og dyrkes, så de regenererer til en hel plante, der indeholder det indsatte DNA.