Biotech week 3

Wat voor een type organisme is E.coli?

Een bacterie

Wat voor een type organisme is Pichia Pastoris?

Een gist

Wat voor een type organisme zijn CHO-cellen?

Zoogdiercellen

Wat is de groeisnelheid van E.coli?

20 minuten

Wat is de groeisnelheid van Pichia pastoris?

2-4 uur

Wat is de groeisnelheid van CHO-cellen?

24 uur

Wat zijn de kosten verschil tussen bacteriën, gisten en zoogdiercellen

B = laag

G = gemiddeld

Z = hoog

Celstructuren verschil tussen bacteriën, gisten en zoogdiercellen?

B = Prokaryoot

G = Eukaryoot

Z = Eukaryoot

Hoe goed zijn bacteriën, gisten en zoogdiercellen in complexe eiwitten maken?

B = Beperkt (vb. geen disulfide bindingen)

G = Redelijk, goed

Z = Zeer goed

Is glycosylering mogelijk bij bacteriën, gisten en zoogdiercellen?

B = Nee

G = Ja maar beperkt

Z = Ja, mensachtig

Wat zijn de toepassingen van bacteriën, gisten en zoogdiercellen?

B = enzymen, insuline

G = enzymen, vaccins

Z = monoklonale antistoffen

Wat zijn de beste plasmide/systeem, promoter en inducer voor E.coli?

Plasmide = pET

Promoter = T7

Inducer = IPTG (lac operon)

Wat zijn de beste plasmide/systeem, promoter en inducer voor Pichia?

Plasmide = pPIC

Promoter = AOX1

Inducer = methanol

Wat zijn de beste plasmide/systeem, promoter en inducer voor CHO-cellen?

Plasmide = pcDNA

Promoter = CMV

Inducer = Geen of doxycyline (TET)

Bij plasmide pET-21 wat is het resistentie gen en antibioticum?

resistentie gen = ampR

antibioticum = Ampicilline

Bij plasmide pET-28 wat is het resistentie gen en antibioticum?

resistentie gen = kanR

antibioticum = Kanamycine

Bij plasmide pPICZ (pichia) wat is het resistentie gen en antibioticum?

resistentie gen = ZeoR

antibioticum = Zeocine

Bij plasmide CHO selectiesystemen wat is het resistentie gen en antibioticum?

resistentie gen = neoR

antibioticum = G418

Hoe controleer je jouw doelgen?

Met gelelektroforese met PCR bandjes

Wat is bij een vector kenmerkend?

• Is ontworpen voor ‘‘blunt-end-klonering’’

• Reeds gelineariseerd (geopend) met ‘‘blunt-ends’’

wat is kenmerkend aan MCS en volledige naam?

= Multiple Cloning Site

→ Bevat restrictie-enzymsites die gebruikt kunnen worden voor latere manipluatie v.h. DNA

Hoe controleer je positieve klonering?

m.b.v. restrictie digestie analyse

Expressie via lac operon tekening

• lactose bindt aan lac repressor eiwit
  → hierdoor kan de afschrijving NIET meer blokkeerd worden
  
  

• RNA polymerase bindt
  → gen wordt afgeschreven ‘‘lactose is de inducer’’

Wat is het doel van eiwit zuivering?

= Eiwit zo zuiver mogelijk in handen te krijgen en ook biologisch actief

Eiwit zuivering en analyse

• Vaak gebaseerd op chromatografie

• Ionen wisseling

• Hydrofobe interactie

• Affiniteit

Hoe wordt een eiwit gecontroleerd? + voorbeeld

Met eiwit elektroforese

BV. SDS-PAGE

Volledige naam SDS-PAGE?

= Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrylamide Gel Elektroforese