7: membranski proteini in prenos signalov

debeline membran

• lipidni del 4-5,5 nm (3-4,5 nm hidrofobni del)

• cela membrana 7-10 nm (poleg lipidov še glikokaliks + proteini)

• daljše in bolj nasičene mk, holesterol → debelejša membrana

• manj nasičene → tanjša, bolj fluidna membrana

vrste membranskih proteinov

• integralni - so notri v membrani - lahko transmembranski (skozi celo mem) ali monotopični (ne grejo skozi in skozi) - lahko ena ali več alfa vijačnic, lahko tudi beta sodček (zunanje membrane)

• periferni - vezani gor na integralne prot

• sidrani na membrano - ne grejo notr v mem, so pa vezani na maščobno kislino v membrani

pristopi za ekstrakcijo proteinov iz membrane

• detergenti → amfipoli, nanodiski ali liposomi

• SMALPs

• GPMVs

• pristopi glede na protein in tudi na metodo (detergent naredi veliko ozadja pri krioEM, nanodiski nemorejo kristalizirat, lipidne mezofaze also nemoreš kiroEM)

detergenti

• najpogosteje DDM (n-dodecil-beta-D-maltozid) - za proteine s TM alfa heliksi

• ekstrakcija je učinkovita če je [detergent]>CMC - 2x ponavadi (CMC je critical micelle concentration- minimum koncentracija lipida da se molekule v tekočini oblikujejo v micele)

• če je detergenta veliko več kot je CMC, pride do destabilizacije strukture, če ga je manj, je slaba ekstrakcija

SMALP

• lipidni delci iz stirena in maleinske kisline (naključna porazdelitev stir in mal delov)

• direktna ekstrakcija - ne rabimo detergenta

• ohranijo se nativni lipidi

• basically ovijejo se okrog proteina in njemu sosednjih lipidov v membrani in zaajmejo ta shit

amfipoli

• amfipatični polimeri

• ovijejo se okrog proteina → ga zaklenejo v določeno konformacijo

• lahko direkt ekstrakcija ali pa najprej z detergentom in potem zamenjava (ker nemorejo vsi amfipoli ekstrahirat + taka ekstrakcija je stabilnejša za prot)

• nativni lipidi se včesih ne ohranijo

nanodiski

• na osnovi MSP (membrane scaffolding protein) - basically mamo lipide okrog želenega proteina, ki so obkroženi/zajeti skupi z MSP (2 antiparalelni verigi MSPja na disk)

• najprej ekstrakcija prot iz mem z detergentom → ga zamenjamo z lipidi + MSP

• protein ohrani veliko konformacijsko svobodo, ostane funkcionalen

• lahko krioEM in NMR, nemoremo kristalografije

lipidne nanostrukture na osnovi sapozina

• sapozini so majhni proteini (80ak ostankov), , držijo lipide skupikofaktorji za lizosomske hidrolaze, sapozin A najpogostejši

• najprej ekstrakcija prot z detergenti, nato jih zamenjamo s sapozini

• lahko krioEM in NMR, nemore kristalografije

metoda ekstrakcije glede na metodo določanja strukture

• krioEM - možni različni, ponavadi ne detergent

• NMR - detergenti ali amfipoli (nanodiski redko ker so veliki)

• kristalografija: detergent ali lipidna kubična faza→ 3D, v lipidnem dvosloju → 2D

bakteriorodopsin

• pri halofilnih arhejah, vijola barve

• podoben rodopsinu v mrežnici - konvergentna evolucija

• protonska črpalka - absorbira foton → prehod iz trans v cis → proton se prečrpa

• delovanje: v hidrofobnem kanalu bakteriorodopsina je rodopsin vezan na N od Lys v trans stanju → pride foton notr in stanje gre v cis → pri tem se odda proton na COO- od nearby Asp85 → Asp96 odda svoj proton iz COOH na Lys-rodopsin (schiffova baza) → proton iz Asp85 gre po kanalčku dalje → na Asp96 pride nov proton, Lys-rodopsin gre nazaj v trans stanje

porini

• TM beta ploskve v zunanji membrani pri gram- bakterijah (v notranji mem so TM prot večinoma iz alfa heliksov)

• tvorijo z vodo napolnjen kanal → difuzija (omejena velikost da toksini nemorejo notr), vseeno dokaj velik kanal - snovi ne grejo direkt v citosol

• zvitje gori-in-dol beta sodček, ponavadi 16 trakov, naklon 40°

ionski kanalčki

• zelo ozek in selektiven kanal

• kalijev kanalček: tetrameri (2 ali 6 TM vijačnic na podenoto), skoraj prosta difuzija K+ ionov - samo tej lahko grejo skozi kanalček, Na'+ nemorejo ker so s hidratacijskim ovojem preveliki

bakterijski fotosintezni reakcijski center

• iz 4 polipeptidnih verig: Light, Heavy, Medium, citokrom (L in M homologni, po 5 TM vijačnic (A, B, C, D, E); H 1 TM vijačnica)

• TM vijačnice (pod kotom 20-25°) oba para D+E tvorita snop 4 vijačnic, stabiliziran s Fe

• notranjost centra so fotosintezni pigmenti (4 klorofili, 2 feofitina, 2 ubikinona), orientirani okrog psevdo-dvoštevne osi

• TM vijačnice lahko napovemo z diagramom hidrofobnosti, ostanki ki tvorijo kontakte s klorofili so >60% ohranjeni

prenos elektronov po fotosinteznem centru

• posebni par klorofilov absorbira foton → se vzbudi in preko drugega klorofila prenese e- na feofitin → prenese e- na kinon A → kinon B → citokrom (nad posebnim parom klorofilov jima donira še en e- → tudi ta se prenese do kinona B → kinon B z dvema e- oddisocira in ju prenese na protonsko črpalko

• majhna verjetnost da foton zadane center - žetveni kompleksi (iz alfa in beta verig, vmes so klorofili) lovijo fotone in jih prenašajo na fotosintetski center

prenos signala

• potrebna je: specifičnost (samo določen signal sproži odziv), fleksibilnost (1 signalna pot lahko aktivira/inhibira drugo), prilagodljivost (z evolucijo lahko nastanejo nove variante brez vpliva na obstoječe poti)

• kooperativnost: vezava enga liganda omogoči vezave še drugih

• vidiki signaliziranja: specifičnost, ojačitev signala (vsak encim aktivira več encimov naprej v kaskadi), integracija (signali se združijo oz se vsi upoštevajo), adaptacija (aktivacija receptorja sproži povratno zanko → se sklopi samega sebe signal)

membranski receptorji kateri so

• ionski kanalčki

• z G proteini sklopljeni receptorji (=GPCR)

• z encimi povezani receptorji (Tyr kinaze in gvanilil ciklaze)

• adhezijski receptorji

GPCR in G proteini

• največja skupina mem receptorjev, delimo na 6 družin (glede na pozicijo in obliko vezavnega mesta za ligand)

• na GPCR se veže ligand → preko 7 TM vijačnic se signal prenese v celico → ojačitev zaradi asociiranih G proteinov

• G protein je heterotrimer (alfa beta gama podenote) → po aktivaciji se Galfa odcepi (GTPazna aktivnost)→ prenese signal na cAMP → gre dalje signal

G proteini

• alfa in gama podenoti sidrani v membrano z lipidnim sidrom

• beta je asociran z gama (perimembransko) - hitra razgradnja če se ločita)

• ko se ligand veže na GPCR se konf spremeni TM del → aktivacija G proteinov → na aktiviran GPCR se lahko veže nov trimer G

• toksini blokirajo GTPazno aktivnost alfe → neprestana aktivacija → transport dosti signala

podobnost GPCR z Ras

• Ras = Rat sarcoma virus

• Ras nima GTPazne aktivnosti → aktivira jih izmenjava GDP za GTP, za izklop rabijo GAP protein

• idk man upm d nebo tega

GPCR in G proteini: stikalo

• primer transducin (G protein, prenača signal od rodopsina do cGMP fosfodiestraze)

• GTPazna domena Galfa, notr ima “stikala” + ogrodna vijačnica - “pokrov”, ki zapre GTP → za izmenjavo se mora odpreti

• stikalo je mesto interakcije z Gbetagama → ko se veže GTP namesto GDP, se stikali I in II premakneta proti gama fosfatni skupini GTPja, stikalo III pa tvori solne mostičke s stikalom II

Gbetagama

• Gbeta je 7-krilni beta propeler z alfa vijačnico na N-koncu

• Ggama je vijačnica, s hidrofobnimi interakcijami se veže na Gbeta vijačnico → obviti vijačnici

• Galfa se veže na drugo stran Gbeta propelerja kot Ggama → vezava onemogoči izmenjavo GDP→GTP, ko se ob aktivaciji veže GTP pride do konf sprememb v stikalih → Gbetagama se oddisociira iz Galfe

fosducin

• sodeluje pri prilagajanju vida na jakost svetlobe

• v temi je fosforiliran - neaktiven → možna tvorba Galfabetagaam

• na svetlobi je aktiven → vezava na Gbetagama → translokacija kompleksa iz membrane

receptor za rastni hormon GHR

• rastni hormon je peptidni hormon (snop 4 vijačnic, hidrofobna notranjost)

• receptor iz 2 domen, imunoglobulinsko zvitje, 2 domeni, med njima povezovalna regija ki veže GH

• na en GH se vežeta 2 GHR - na dve različni vezavni mesti

• ko je dosti GHja se tvorijo 1:1 kompleksi z GHR (preko A-D regije na hormonu) → dimerizacija GHR preko C-končne domene → vezava GH preko A-C regije

• vezava GH na povezovalno regijo s solnimi mostički Arg - Glu, vezava GH na Ig domeno poveča Zn afiniteto