Biokatalyse

Ser-protease

Hydrolyse van peptidebindingen (EC 3.4)

• subtilisine vs (chymo)trypsine (concergente evolutie)

• wasproducten en voefselbehandeling

• synthese van peptidebindingen vb aspartaam

Katalytische principes

• specificiteit bepaald door S1 subsite (telling met S2 S1 S1’ S2’)

• zuur/base katalyse met His

• covalente katalyse met Ser

• Asp helpt His = “katalytisch triade”

• stabilisatie van de TS in oxy-anionholte

Glycosidase

Hydrolyse van glycosidische bindingen (EC 3.2)

• lyzozyme, amylase, cellulase, galactosidase

• wasproducten en textielbehandeling

• vrijstelling van bioenergie uit biomassa

Katalytische principes

• waterstofbruggen met hydroxylgroepen

• stacking van suikerring met aromaat (Tyr of Trp) = subsite

• substraatdistorsie thv de splitsingsplaats

• zuur/base katalyse met carboxylzuur (Asp of Glu)

• covalente katalyse met carboxylzuur (Asp of Glu)

• double displacement = retention

• single displacement = inversion

HFCS/ High Fructose Corn Syrup

Sucrose substituut

Glycose isomerase (geimmobiliseerd)

> 10^6 ton/yr

Bioethanol

Gasoline additive

Amylases

> 10^6 ton/yr

Lactose-free milk

Lactose intolerantie

Lactase (geimmobiliseerd)

> 10^4 ton/yr

Cacaoboter substituut

Chocolade productie

Lipase (geimmobiliseerd)

> 10^4 ton/yr

Isomaltulose

Glc a-1-6 Glc

Sucrose substrituut

Sucrose isomerase (geimmobiliseerd, whole cell)

> 10^4 ton/yr

Acrylamide

Polyacrylamide gels

Nitrile hydratase (geimmobiliseerd, whole cell)

> 10^4 ton/yr

Vroeger:

• keuze van beste stam: Rhodococcus rhodocrous

  • Lage amidase/ hoge NHase

  • Whole cell want lage activiteit

• Ureum toevoegen als inducer van hydratase act

• Cobalt toevoegen omdat hydratase dat nodig heeft als cofactor

• UITZ koelen vr verlaging amidase act

  → VOORDEEL: energieverbruik daalt met factor 5

• Substraat (acrylonitrile) is toxisch vr cel → nitrile maar geleidelijk toevoegen, max 6% = fed batch approach

Chemisch	Enzymatisch
Hoge T: 100°C	Hydratase komt in natuur steeds voor met amidase → steeds wat door reactie, nu natuurlijk hydratase gecloneerd en enkel dat gebruiken
Vervuilende katalysator Cu2+	100% rendement
Condities waardoor het amide kan door-reageren tot het overeenkomstige zuur → mengsel	Hogere product concentratie kan worden toegelaten
Ongedifferentieerde polymeren (reageren met elkaar)	Opzuivering is niet nodig → geen downstream processing meer nodig

6-AminoPenecillanic Acid

Penecillin nucleus

Penicillin amidase (geimmobiliseerd)

> 10^4 ton/yr

7-AminoCephalosporanic Acid

Cephalosporin nucleus

Glutaryl amidase (geimmobiliseerd)

> 10³ ton/yr

Fenylglycine

Antibiotica intermediar

Hydantoinase/ carbamoylase (whole cell)

> 10³ ton/yr

Aspatraam

Artificiele zoetstpf

Thermolysine

> 10³ ton/yr

Nicotinamide

Food/ feed additief

Nitrilye hydratase (geimmobiliseerd, whole cell)

> 10³ ton/yr

(S)-choropropionic acid

Herbicide intermediar

Dehalogenase (whole cell)

> 10³ ton/yr

Ampenicilline

Semi-synthetische antibiotica

Penicilline amidase (geimmobiliseerd)

> 10² ton/yr

Cephalexin

Semi-synthetisch antibioticum

Penicilline amidase (whole cell)

> 10² ton/yr

Hernieuwbare grondstoffen

• 2/3 van alle C op aarde in de vorm van koolhydraat

• Grootste deel is (hemi)cellulose ~ biljoen ton

• Hernieuwvaar = jaarlijkse 50 miljard ton via fotosynthese

→ we gaan plantaardige biomassa, zoals zetmeel, cellulose en sucrose afbreken tot fermenteerbare suikers

Food VS fuel scheiding/ debat: gaan we echt verteerbare suikers ‘verspillen aan brandstof terwijl er vele sterven van de honger’?

Zetmeel

• Hoofdketen: alfa-1-4 gebonden Glc

• Vertakking: alfa-1-6 gebonden Glc

• Mais (VS), tarwe (EU)

• Toegankelijk substraat

Sucrose

• Is al fermenteerbaar, dus geen biokatalytische stap nodig

• Belangrijke grondstof voor 1ste generatie technologie: biobrandstof

• Biet, riet

• Eerste generatie technologie

Cellulose

• B-1-4 gebonden D-Glc

• Stengels, hout

• 2de generatie technologie

Valorisatie van zetmeel

• Uit mais (VS) of tarwe (EU)

• Stapgewijze afbraak door gamma-amylase/ glucoamylase, iso-amylase en alfa-amylase

  • alfa-amylase = endoglycosidase vr hoofdketen

  • isoamylase = endoglycosidase vr vertakkingen

    wordt vervangen door pullanase omdat deze het beter doet met zetmeel uit natuur, dat waar alfa-1-6 verbindingen zelfs de hoofketen kunnen vormen

  • glycoamylase = exoglycosidase dat Glc vrijstelt

  • B-amylase wordt niet gebruikt omdat dan het disacharide wordt vrijgesteld ipv het zuivere monomeer Glc

1. naar olgigosacchariden: dextrines

   1. Deze maltodextrines hebben toep: verdikkingsmiddel

2. naar Glc

DE/ Detrose Equivalents

Het percentage van glycosidische bindingen die gebroken zijn. Dit is eenvoudiger op te volgen dan de DP: we meten de vrije reducerende uiteinden (anomere plaatsen) dmv een kleurreactie

DE = [0, 100]

DE * DP = 100

DE van maltose is dus 50 (maltose is diGlc)

DE van maltodextrines is dus ~= 10

DE van Glc siroop ~ 35

DE van Glc is 100

DP/ Degree of Polymerisation

Het aantal glucose eenheden die nog steeds aanwezig zijn in de keten

DP * DE = 100

Liquefactie

= stap 1 van de valorisatie van zetmeel = ‘vervloeiing’. Gebeurt 5 min bij 105°C en dan nog 90 min bij 95°C. De zetmeel is van DE = 1 → DE = 10-15

1. Semi-krisallijne granules van zetmeel oplossing/ openbreken dmv een jet cooker → directe verdikking → roeren in de reactor wordt moeilijk

   => we doen dit in aanwezigheid van a-amylase om verdikking tegen te gaan, maar hoe gaan AA niet kapot bij 105°C?

   • Themostabiele enzymen AA: Termamyl of Spezyme

     • Eerst in natuur gezocht

     • Verbeterd mbv semi-rational design

     • Ca++ is niet nodig vr mechanisme van AA (steeds gebruik carboxylgroep van Glu of Asp), mr vult een gat uit in de 3D struct van AA wat zorgt de stabilisatie + efficiente werking MAAR dit blijft dan in het eindproduct => enzym engineering waarbij grotere groepen worden geplaatst om dit gat op te vullen zodat Ca++ niet nodig is

     • pH optimum v (natuurlijk) AA ~= 6, zetmeel pH ~= 4,5 → NaOH toevoegen is nodig, mr tijdens saccharifiactie is pH opt GAL/PL ~= 4,5 → terug zuur toevoegen. Dit is onhandig + weer finaal in product dus enzym engineering zodat AA ook kan werken bij pH 4,5 (zeer moeilijke opgave, mr laatste tijd verbeteringen: alphera bij pHopt 4,7)

Saccharificatie

= stap 2 in de valorisatie van zetmeel = versuikering. De bekomen dextrines na de liquefactie worden verder afgebroken door pullanase (geen b-amylase!) en glycosylamylase. Finaal wordt een Glc stroop bekomen met een DE van bijna, mr niet helemaal 100 (dr de hoge concentratie Glc zal het themodynamisch evenwicht onvermijdelijk wat nr maltose verschuiven) en eventueel transglycolyseren in isomaltolose - problematisch want hydrolysatie ervan is inefficient

Toep: HFCS dr isomerase van Glc dr xylose isomerase nr Fru

HFCS

• Vorming door xylose isomerase dat Glc → Fru

  • Slechts 42% conversie nr Fru in normaal evenwicht → min % voor nabootsen van sucrose (55%) is nog niet bereikt

    => we gaan een deel van de Fru fractioneren om de opbrengst te verhogen nr 90%

    • Hogere T zou het evenwicht ook nr juiste richting sturen, mr geen stabiele thermostabieleisomerasen zijn gevonden

• Sweetzym en Gensweet is geimmoboliseerd GI pm stabiliteit te verhogen→ GI staat bekend als model enzym vr immobilisatie

Cyclodextrines

• Vorming met cyclodextringlycosyltransferase (CGTases + deels AA)

• DP ~= 7 (2 euro/kg) maar kan ook 6 of 8 zijn

• Febreze → zoch niet alleen zetmeel gebruiken vr voeding?

De 3 moeilijkheden van tweede generatie afbraak biomassa

• Lignine (aromatisch) belemmert toegang tot suikers (cellulose)

• Pentosen (arabinoxylose) moeilijk fermenteerbaar

• Cellulose-microfibrillen totaal onoplosbaar

Pretreatment biomassa afbraak 2de generatie

De celwand van plantencellen afbreken zodat cellulose toegankelijk wordt. DIt is de moeilijkste stap. Wordt vaak gedaan dr combinatie van chemische (zuren en basen) als mechanische technologie (hoge druk, verpulveren, hoge T)

• Steam explosion

  De celmassa opbreken onder invloed van stoom + hoge druk. Hoe hoger de T van water, hoe zuurder het karakter ervan → verwijdert hemi-cellulose (de cross-linking tussen de cellulose) dr katalyse van afbraak reacties

  • Dit wordt nu minder gedaan omdat men ondertussen gisten heeft ontw die HC kunnen gebruiken als C-bron → beetje zonde om de af te breken => overschakeling nr meer basische behandeling + afbraak lignine, niet HC

• Ammonia fiber explosion (AFEX)

  Een uitgesproken base, ammoniak wordt gebruikt om lignine afbraak reacties de katalyseren.

  Fysisch-chemisch alkalisch voorbehandelingsproces waarbij lignocellulosehoudende biomassa periodiek wordt blootgesteld aan vloeibare ammoniak bij hoge temperatuur en druk, gevolgd door een snelle drukontlasting

• Organosolv

  Niet op industriele schaal gebruikt voor valorisatie van cellulose, mr eerder om de 3 fracties apart te krijgen, zonder te veel afbraak. Methanol + azijnzuur wordt gebruikt

Hydrolyse van 2de generatie voorbehandelde cellulose

• Chemisch proces: vereist zuur en hoge T

• Enzymatisch proces: zeer nuttig, maar duur

Slechts weinig microben kunnen cellulose afbreken

• Anaerobe secreteren een enzymmengsel vb Trichoderma ressei. Komen in oplossing voor.

• Anarobe produceren 1 groot cellulosoom vb Clostridium (vindt je terug in de maag van herkauwers) De bac hecht zich aan de maag, produceert enzymen die aan de cel hangen (om wegspoeling te vermijden → alles blijft lokaal bij elkaar)

Trichoderma ressei

• Endoglucanase (EG) = knipt in het midden in de keten → groef

• Cellobiosehydrolase (CBH) = exoenzym, verwijdert cellobiose (disacchariden) van het einde → tunnel → doet aan processieve splitsing UNIEK (dit is onstaan drdt er zo weinig ketenuiteinden zijn, dat eens gevonden het enzym er niet meer van weg wilt)

• Er treeft synergie op tussen EG en CBH: als EG een keten knipt worden nieuwe keten uiteinden gevormd → meer startpunten vr CBH

Belang van cellulose-bindend domein (CBM)

= vlak oppervlak dat kan associeren met de kristallijne vezels (celluloseketens associeeren tot vezels). Het houdt het enzym in de buurt van het onoplosbaar polysaccharide en heeft geen invloed op de hydrolyse van oligosachariden

Unlocking the true potential of cellulases?

Vrij recent heeft men een niet-hydrolytisch aeroob enzym, polysaccharide mono-oxygenases (= PMO), ontdekt. Deze genereren oligosachariden die geoxideerd zijn thv C1 of C4. Het heeft een vlak bindingsoppervlak, en heeft dus wss het CBD niet nodig. Bovendien verkiest het de kristallijne structuur van de cellulose vezels.

Het vertoont synergie met cellulases, in aanwezigheid van een reducerende partner: cellulobiose dehydrogenase.

1. PMO oxideert de oligosacchariden in aanwezigheid van O2, waardoor de ringstructuur wordt vrijgesteld → amorphogenesis van de kristallijne structuur waardoor dispertie/ zwelling optreedt van de cellulose vezels.

2. Hydrolyse kan nu optreden van de onoplosbare cellulose ketens

3. Hydrolyse van de oplosbare cello-oligosacchariden dr o.a. cellubiosehydrolases (CBH) met vorming van cellobiose → activatie treedt op dmv de cellobiose dehydrogenase partner → stimulering van PMO

De droom is om zo de voorbehandeling zo minder intensief te maken omdat het enzym toch al direct kan werken op de vezels → mogelijk verschil in moeite en kost

Process overview biomassa 2de generatie

EtOH wordt verbrand vr opwarming van fabriek

Proces intregratie: SSF = simultaneous saccharification and fermentation. Dit wordt gedaan omdat cellulase (cellobiosen hydratasen) ervaren productinhibitie → door het product steeds om te zetten wordt dit probleem vermeden

De cellulasen en gist werken wel niet bij dezelfde omgevingsconditiies → moeten we wat op elkaar afstemmen

SSCF = SSF incl, pentoses. Als je dit wilt doen, mag de voorbehandeling niet zuur gebeuren, anders ben je deze fractie kwijt (dr afbraak van hemi-cellulose)

CBP = Consolidated BioProccessing with endogenous enzyme production is de ideale droom: ontwikkeling van een gist die de fermentatie processen uitvoert, mr ook de cellulasen produceert. Dit zal in de praktijk zeer moeilijk zijn omdat we met een zeeer grote cellulasen cocktail hebben → grote aanpassingen moeten gebeuren

Isomaltulose

In de winkel gekend als palatinose.

VOORDEELHeeft een lagere glysemische index waardoor in in vergelijking met sucrose waardoor het trager wordt afgebroken → minder sterke suikerpieken in je bloed (bevat evenveel calorien)

VOORDEEL is niet-cariogeen (= veroozaken geen tandbederf)

• geproduceerd door sucrose mutase

  • Sucrose (Glc a-1-2 Fru) om nr isomaltulose (Glc a-1-6 Fru)

  • Sucrose (Glc a-1-2 Fru) om nr trehalulose (Glc a-1-1-Fru)

  • Bij 40°C om evenwicht zo goed mogelijk nr isomatulose te verschuiven (standaard in suikerindustrie wordt 60°C gebruikt om groei mesofiele MO te vermijderen)

IMO

Isomalto-oligosacchariden

• Prebiotisch → stimuleert de groei van gezonde bacterien

• Kunnen enkel de bifodobac in onze darm afbreken dr de a-1-6 binding (zie struct isomaltose)

• Hydrolase wordt onder kinetische controle gebruikt voor synthestische doeleinden volgens dubbel dispacement mechanisme: transglycosylering van maltose door geimmobiliseerd glucosidase

  1. Maltose eenheid treedt op als donor: 1 Glc wordt afgesplitst (is LG)

  2. Andere Glc eenheid van maltose komt covalent eraan binden om de energie van de binding te capteren/ binding kan gebruikt wordt om in de volgende stap een reactie met maltose aan te gaan (is zowel donor als acc dus) → vorming trisaccharide waarbij nu 1-6 binding → ketenverlenging steeds met 1-6

  3. Dit trisaccharide kan verder op deze manier verlengd worden tot een DP van 7-8

  • Mechanisme wordt verraad drdat op de kop maltose voorkomt met 1-4 binding

• b-amylase wordt gebruikt soms bij zetmeel afbraak om toch een batch maltose te produceren (glucoamylase wordt vervangen)

FOS

Fructo-oligosacchariden

• Hydrolyse van inuline (vb uit chicorij). Er is geen Glc aan de kop = raftilose

• Prebiotica

• Via double displacement mechanisme (kinetische controle: ene sucrose is donor, andere acceptor. De Fru molecule van donor wordt overgedragen nr de acc → verlenging van basis disaccharide met Fru). De eindstandige glucose is een rest die verwijst naar het mechanisme. = actilight

GOS

Galacto-oligosacchariden

• = vivinal

• Prebiotica

• Transglycosylatie van lactose: ene lactose treedt op als donor, de andere als acceptor

• Wat variaties in bindingen (1-3, 1-6, 1-4, ..) het is niet zo selectief. Dit helpt om de vertering dr onze enzymen tegen te gaan

• Heel bel vr de gezondheid van pas geboren babys (stimuleert gezonde darmflora)

Trehalose

• Glc 1-1 Glc → er is geen reduceren einden meer omdat beide anomere einden gekoppeld zijn → zeer stabiele molecule en wordt in de natuur gebruikt tegen stress (droogte, vrieskou, …)

  => we kunnen zo diepvriesmaaltijden beschermen tegen de kou

  => cake droogt niet zo snel uit

• Minder zoet dan sucrose, maar bevat calorien

• Lage tijd zeer duur, mr nu Esys ontdekt waarbij zetmeel (goedkoop bulk product kan worden omgezet in trehalose)

  1. Een transglycosidase enzym gaat het eindstandige glucose (met nog reducerend einde) omkeren via double displacement mechanisme → eindstandig 1-1 binding

  2. Deze kop wordt als disacharide (trehalose) afgesplist dr een hydrolase → nieuw reducerend einde

  3. Herhaling

Tagatose

• = tagatesse

• Monosacharide

• Lage calorie inhoud vr even grote zoetkracht

• L-arabinose isomerase wordt gebruikt om D-galactose om te zetten nr D-tagatose (doet natuurlijk L-arabinose nr L-riboluse → enzym engineering vr optimalisatie van de reactie)

• Ondanks wetenschappelijk lagere calinhoud, moet volgens de wetgeving toch de volledige calorieinhoud van sucrose op het label worden te gezet → lobbyen

Aspartaam

• Is geen suiker, maar een (gemodificeerd) dipeptide

• Artificiele zoetstof

• 200 x zo zoet als sucrose, mr zelfde calorie inhoud (moet je natuurlijk veel minder van gebruiken) → cola “zero” bevat dus wel nog calorieren, mr gwn 200 keer minder dan sucrose

• Toep: NutraSweet/ Candarel, frisdrank

  • Niet bij bakken dr denaturatie bij hoge T

• 2 AZ moeten gekoppeld worden in de juiste volgorde: aspartaat gekoppeld aan fenylalanine en zo dat er geen isomeer gevormd wordt (deze smaken bitter). Enkel de L-vormen leveren een zoet product

• Proces dat industrieel gebruikt wordt laat niet toe de volgorde van koppeling te controleren, andere vwden zijn dr enzym wel voldaan => beschermingsstap (Asp koppelen met Z-groep en de carboxylgroep met metyl. Deze methylgroep moet in het finale product nog aanwezig zijn, de Z-groep wordt verwijderd)

• Peptidase in synthese richting (Ser protease in synthese richting)

• Thermolysine is geen Ser protease, heeft metaal katalysator in het KC en werkt niet met double displacement, mr single displacement We werken dan met thermische controle

• Voor fenylalanine is het essentieel dat je vertrekt van het racemisch mengsel: D-fenylalanine gaat namelijk een complex vormen met het nog beschermde aspartaam (dat uit L-Asp en L-Phe-O-Me bestaat) complexeren en neerslaan → evenwicht wordt nr rechts getrokken/ natuurlijk thermische controle zeg maar. Bij het ontschermen wordt de D-vorm terug vrijgesteld + aspartaam. De D-vorm wordt opnieuw geracemiseerd en gebruikt in het proces

• 200 ton/yr

• 25 euro/kg, mr je hebt er weinig van nodig ~= prijs chemische synthese

• pH = 7, 50°C

Margens waren te klein + te weinig voordelen van het E → nu enkel chemische synthese

Hoe synthetiseren we de precursoren vr aspartaam?

Fenylalanine

• Fermentatief om enkel L vorm te hebben vr chem synthese aspartaam

• Chemisch voor D/L vorm vr enzymatische productie van aspartaam (benzyl hydantion)

Aspartaat

• Fermentatie is mogelijk

• Enzymatisch is goedkoper

• Apartase = aspartaat aminia lyase → is lyase, niet hydrolase

Hoe gezondheidseigenschappen van plantaardige vetten behouden, mr toch vaste structuur hebben? + wat laat deze tech nog toe?

Hydrogenatie

• Partiele hydrogenatie

• Milieuvervuilend

• Trans fats (cis-trans isomerasie), deze zijn nog ongezonder dan de dierlijke vetten die we proberen te vervangen → gebannen

Interesterificatie

• Plantaardige olie 100% hydrogeneren, dus alle dubbele bindingen eruit → heel vaste vette structuur

• Met lipase, die voorkeur heeft voor de buitenste ketens, een interesterificatie uit te voeren (hydrolase mechanistisch eig kinetische controle)

• → chemische mengvorm waarbij er minder dubbele bindingen aanwezig zijn dan van het start materiaal

• Lipozyme TL IM = zeer goedkoop geimmobiliseerd (op silica carrierl) enzym gebruikt vr inesterificatie

• Archer Daniels Midland: gebruikt packed-back reactor waardoor ENKEL de 2 lipide fracties worden gepompt (geen water, geen solvent) → NovaLipids

=> ook maken van functionele vetten zoals cacao boter substituten CBS of milk fat substitiues MFS dmv het intesterificatie dr de juiste regiospecifieke enzymen

Beta-lactams

• Penicillines

• Cephalosporines

• Inhiberen de synthese van de celwand van bactieren

• Nu semi-synthetische

  → modificatie van zijketens om spectrum eigenschappen te wijzigen + resisitentie te vermijden

• Kern blijven we af omdat het de functionele werking heeft

6-APA

6-aminopenicillanic acid

7-ACA

7-aminocephalosporanic acid

Synthese penicilline antibiotica

Chemische modificatie	Enzymatische modificatie
Een reactief tertair amide moet beschermd worden, het secundaire amide moet reageren → veel stappen	2 stappen
30kg afval/ kg product	Normale condities: pH8, 35°C

penG amidase = acylase maar moet direct geimmobiliseerd worden wat is niet stabiel buiten de cel. Eupergiet werd vroeger gebruikt

1. Zijketen van penicilline G verwijderen dr hydrolyse met PenG Amidase (rel eenvoudig)

2. PenGAmidase nu in synthese richting gebruiken: PenGAcylase

   • Thermodynamische controle

     • 2 partners: 6-APA en de nieuwe zijketen,

       D-phenylglycine. Een synthetisch AZ

     • MAAR koppelt niet goed want D-fenylglycine komt voor als zwitterion

     • - lading carbonzuur → niet reactief

     • + amine → past niet in KC van het enzym

     • => gaan we niet doen

   • Kinetische controle

     • Gebruik van geactiveerde donor: fenylglycinamide, waarbij NH3 LG is

     • Optimale condities van T en pH zijn nodig vr primaire hydrolyse en secundaire hydrolyse te minimaliseren

     • Verandering van carrier is nodig → geen eupergiet, maar gelatine.

       • Grotere porien, waardoor er minder grote competitie is door kleine mobiele H2O moleculen vb grotere ‘lompe’ zijketen die als acceptor moet optreden

Synthese cephalosporines antibiotica

Geen minder aanleiding tot allergische reacties

• In natuur niet direct een vb Cephalosporine C Amidase → kunnen de natuurlijke zijketen van Cephalosporine niet direct verwijderen

De ‘zeur’ methode

• Een penicilline structuur cephalosporine achtig maken door de 5-ring in de kernstructuur van penG de expanderen tot een 6 ring systeem - chemisch → bekomen 7-ADCA = 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid ipv 7-ACA

Enzymatische methode

1. Startend van natuurlijk cephalosporine-C, dmv D-AAO = D-aminozuur oxidase waardoor het amine wordt omgezet nr een ketonfunctie → onstabiel

2. De zijketen wordt spontaan korter gemaakt de spontane decarboxylering nr glutaarzuur

3. De glutaarzuurketen dmv glutaryl amidase hydrolyseren

D-fenylglycine amide - hoe komen we hier aan?

Batch proces

Beide routes zijn sterioselectief

1. Vertrekkend van benzaldehyde

2. Corresponderende hydantoine van maken (meest generische methoden om AZ te maken)

3. Via hydantoinase- carbamoylase D-fenylglycine maken

4. Activatie nog nodig naar D-fenylamide

1. Vertrekken van benzaldehyde

2. Met ammionia cyanide (strecker synthese) wordt het overeenkomstige aminonitrile bekomen

3. Dit kan niet selectief met nitrile hydrolase wordt omgezet naar een racemisch mengsel van het overeenkomstige amidase → geen optisch zuiver mengsel (opkuisen kan via kinetische resolutie door er een amidase die het ongewenste enantiomeer (L) weggreageert => D-enantiomeer blijft over

   Rendement is slechts 50% → bedroevig

Graag rijk worden: een enantioselectief nitrile hydrolase ontwikkelen die vanuit het aminonitrile het beoogde D-entantiomeer maakt

Biotransformatie vs fermentatie

Stremsel

Diastase

Zymase

Oropon

BioTex

Eiwit families

Superfamilie = in sommige gevallen is de sequentie-identiteit tussen evolutionair verwante eiwitten zo laag geworden dat het bijna onmogelijk is om deze te herkennen. De sequenties worden ingedeeld in verschillende families die later een vergelijkbare structuur en functie zullen blijken te hebben. Dergelijke verwante families zijn superfamilies

TIM-barrel

Loop graften

Sleutel slot vs induced fit

Hoe versnelt een biokatalysator de reactie?

Substraat distortie

His-H+ shuttle

Superzuren

katalytische activiteit Ser Protease + specificiteit

Oxyanionholte

Lyzozym

Katalytische activiteit van glycosidasen + specificiteit

Parameters goed enzym

Perfect katalytisch enzym + vb

TIM-barrel

Types inhibititie + vb affiniteitslabeling

Thermodynamische vs kinetische controle

2 Routes voor de productie van optisch zuivere alcoholen

Methoden voor optisch zuivere aminozuur synthese

Belang van cofactor regeneratie + geef vb

Nut glucose oxidase

Chytochroom P450 + de uitzondering, wat is de droom?

Chloroperoxidase + voordeel tov oxidasen

Enzym vernetting van vlees

Types glycosyltransferasen + voordelen/ nadelen

Cyclodextrine, met welke enzym synthese?

Trehalose + synthese, waar wordt dit nog gevormd?

Glycoside hydrolasen, welke groot nadeel? Hoe vb productie van N-acetyllactosamine?

Cofactor regeneratie bij kinases (+ synoniem kinase)

Fosfoenolpyvaat moet: zijn

Enzymen nodig valorisatie van zetmeel

Verschil tussen lipasen en esterasen + hun mechanisme

Toepassingen lipasen en esterasen + hoe wordt specificiteit van lipasen bepaald?

Wat is er gaande?

Dit is een voorbeeld van een stereospecifieke transesterificatie. Startend van een racemisch mengsel (zie hieronder) waar de functionaliteits trans staan tov elkaar, heeft het lipase CALB een voorkeur voor het R enantiomeer. Het voert stereospecifiek (kan discrimineren in chirale centra van alcoholen) een transesterificatie uit met vinylacetaat. Het ‘vinylalcohol’ wordt via tautomerie irreversibel omgezet naar acetaldehyde. Het S enantiomeer blijft als ongereageerd substraat over. Finaal wordt een optisch zuiver mengsel bekomen. Het rendement is in dit geval slechts 50%.

Papaine / (bromelaine)

Belangrijk lyase

Belangrijk isomerase

GRAS

PlugBug

Plasmides, welke promotor + vector + hoe gebeurd controle van afschrijving?

Manieren van cellyse

Verwijderen van brokken na cellyse

Manieren lage opzuivering + voor en nadelen

Manieren hoge opzuivering

Enzym formulering

Voor en nadelen van immobilisatie + wat zijn de types

Voor en nadelen van enzym-crosslinking + vb

Voor en nadelen van het binden van enzymen aan onoplosbare carriers

Voor en nadelen van entrapment in carriers