biossensores 1

o que é um biossensor?

aparelho analítico que é usado na deteção de substâncias químicas

é integrado e autonomo

combina componente biológica com um detetor fisicoquimico

transdutor oq é

elemento detetor que transforma um sinal em outro como resultado da interação entre o analito e o ambiente bio

entendido como o elemento que transforma o sinal que resulta da interação do analito com o elemento biológico em outro tipo de sinal mais facilmente quantificável

converte uma interação bioquímica que ocorre na camada de reconhecimento num sinal mensuravel e quantificável

permite quantificar e medir esta interação

que componentes tem o biossensor?

biorecetor

transdutor

detetor

zona linear/ intervalo/linear range

intervalo de valores de entrada ou saída para o qual o dispositivo produz um sinal diretamente proporcional e linear em relação ao sinal de entrada

aka a zona onde o sensor responde de forma proporcional à concentração

limite de deteção (LOD)

corresponde ao menor número que pode ser discriminado pelo sensor

geralmente é calculado como 3x o ruído

quão pequena pode a concentração ser e ainda haver sinal de presença dela

intervalo dinâmico

razão entre a concentração máxima e a menor concentração mensurável do analito

diz de forma geral entre que concentrações o sensor consegue fazer medições

tempo de resposta

tempo necessário para que o instrumento registe uma percentagem designada (geralmente 90%) de uma alteração brusca na variável que é medida

aka quão rapidamente o sensor reage a uma alteração

tempo de recuperação

tempo que o sensor demora a estar pronto p/realizar uma nova medição

p/voltar ao estado inicial

fiabilidade (reliability)

probabilidade de o sensor desenpenhar a sua função SEM falar, sob condições estabelecidas e durante determinado tempo

funcionar sem falhar em determinado periodo e condições

estabilidade

capacidade de o instrumento de medição manter as suas caracteristivcas metrologicas constantes ao longo do tempo

continuar a dar resultados consistentes ao longo do tempo

sensibilidade

quanto o sinal muda com a concentração do analito

o quanto o sinal do sensor muda quando aquilo que está a medir muda

especificidade

capacidade de responder preferencialmente ao analito pretendido perante outros

sensibilidade vs especificidade

tendem a ir em direções opostas

sensibilidade em termos de verdadeiros positivos e assim

verdadeiros positivos/ (verdadeiramente positivos e falsos negativos)

ou seja quem verdadeiramente é positivo entre todos os que têm a doença

especificidade em termos de verdadeiros positivos e assim

verdadeiros negativos/ (verdadeiramente negativos + falsos positivos)

verdadeiros negativos entre todos os que não tem a doença

classificação de biossensores de acordo com o tipo de interação que detetam

• metabolicos

baseiam se em reações cataliticas/enzimaticas; analito é consumido

(enzimas, )

• afinidade

• sem consumo ou transformação, o sinal vêm da ligação fisica e especifica

(mAB, pAB, fragmentos Fab2 ou Fab, biotina streptoavidina, proteina A e G, peptidos, oligonucleotidos, lectona, MIPs)

• metabolicos

baseiam se em reações cataliticas/enzimaticas; analito é consumido

(enzimas, )

• afinidade

• sem consumo ou transformação, o sinal vêm da ligação fisica e especifica

(mAB, pAB, fragmentos Fab2 ou Fab, biotina streptoavidina, proteina A e G, peptidos, oligonucleotidos, lectona, MIPs)

e categorias de transdutores

pode ser:

• ótico

• eletroquimico

• termico

• piezoeletrico

• triboeletrico

transdutores eletroquímicos

medem propriedades elétricas como

• corrente

• potencial

• conductância

• impendância

• capacitância

A ligação bq gera ou altera a transferência de eletrões ou altera as propriedades elétricas da interface

transdutores óticos

a ligação do analito altera a forma como a luz interage com a superficies

medem

• absorvância

• fluoresncência

• indice de refração

• SPR

transdutores de massa ou acusticos

a adição de massa à superficie do sensor torna o sistema mais pesado o que reduz a vibração que ele gere

a variação da frequencia é proporcional à massa ligada

medem

• freq de ressonância

• fase ou carga/massa acumulada

transdutores térmicos

medem a geração de calor ou a variação de temperatura

explora o calor libertado ou absorvido durante uma reação quimica especifica

transdutores mecanicos

medem a

deflexão

tensão/stress

deformação

força

quando os analitos se ligam gera-se uma tensão mecanica de superficie assimetrica que força a estrutura flexivel a sobrar-se

oq são alterações interfaciais?

dada a ligação do analito à camada de reconhecimento ocorrem mudanças físicas ou químicas do sensor

quais são as principais alterações interfaciais tipicas?

1) transferência de carga ou troca de eletrões

2) alterações dielétricas ou de impendância

3)massa acumulada

4) alteração do indice de refração

5) libertação ou absorção de calor

6) tensão superficiaç ou deflexão

impendância

A impedância é a oposição que um material oferece à passagem de corrente elétrica alternada (AC). Ela depende de fatores como:

• Resistência elétrica;

• Capacitância;

• Frequência do sinal elétrico.

sensor de impendância

um biossensor de impendância deteta a ligação de um analito através da alteração das propriedades elétricas na na interface, nomeadamente da impendância

imobilização o que é?

processo de condicionamento de biorecetores a uma superfície (substrato) de forma estável e uniforme, de modo a manter as suas propriedades de afinidade e especificidade p/uso no biossensor

em que deve resultar a imobilização

• alta densidade de biorecetores na superficie

• preservação da atividade e especificidade do biorecetor

• otimização da carga de superficie

atenção ao overcrowding, problemas de distribuição

• reprodutibilidade do processo de imobilização

• estabilidade da camada de imobilização

que métodos de imobilização existem?

• adsorção física

• aprisionamento físico

• bioafinidade

• ligações químicas

• - lig covalente

• - crosslinking

adsorção física

método de imobilização física

quando as moléculas se agarram a uma superficie, via forças fracas (van der waals, lig. eletrostáticas, lig. hidrofóbica, lig H)

cria orientações aleatórias e attachament heterogeneo

ocorre de rápida forma (mas menor estabilidade)

adsorção física caracteristicas

fraca ligação

organização aleatoria

simples e de fácil preparo

sem reação química c/ biorecetores

adsorção não especifica (ruido maior, menor seletividade se contaminado)

sujeito a alterações de pH

aprisionamento físico

forma simpples, baseia-se na adsorção física

imobiliza-se o biorrecetor em matrizes 3D, ou seja o substrato é poroso e dentro dele está o biorecetor

caracteristicas aprisionamento físico

• sem reação química entre monomeros e biorecetor

• espessura ajustavel da camada

• porosidade ajustavel

• pode ser oticamente transparente

• pode ser preparado com materias adequadoa a sensores eletroquimicos

Sol Gel

imobilização de aprisionamento físico

enzima fica presa numa rede tridimensional de sílixa

vantagens aprisionamento físico

• não interfere com a reability do recetor

• limita contaminação por proteínas na amostra

• limita biodegradação do recetor

desvantagens de aprisionamento físico

difusão de analitos para o biorecetor pode ser lenta (a taxa de difusão é uma limitação)

pode haver contaminação (aprisionamento de moléculas não desejadas na própria rede polimérica

o biorecetor pode libertar-se

Imobilização via Bioafinidade

sem recurso a ligações covalentes

fazem recurso a ligações covalentes

exemplo é a biotina avidina

a avidina reconhece e liga-se à biotina com muita afinidade

o alvo é modificado para se ligar à biotina, que se liga à avidina que está imobilizada num substrato

caracteristicas Imobilização via Bioafinidade

afinidade muito elevada

formação rápida

elevada estabilidade

imobilização via ligação covalente

ligação química entre um grupo químico e um biorecetor na superficie de um transdutor

reação química tem de ser compatível com a integridade do recetor

imobilização via crosslinking

moléculas biorecetoras estão ligadas entre si e também à superfície transdutora - formam rede polimérica de crosslinking

utiliza-se um agente de crosslinking p/estabelecer ligações químicas entre duas moleculas ou um substrato

vantagens imobilização via crosslinking

estabilidade boa devido à forte ligação

controlol sobre orientação do biorecetor é possível (mas complicado)

quando se usa um eletrodo como transdutor

desvantagens imobilização via crosslinking

dano ao recetor com perda de seletividade ou ativ catalitica

reação de dificil controlo (especialmente a nivel de overcrowding)

metodos de preparação e funcionalizaçáo do substratp

• SAM

• Silanização

SAM

self assembly monolayer

superficie organicas, altamente orientadas

formadas por adsorç´´ao de alkanetioies em ouro

podem alcançar grande nivel de organização

controlo preciso de direção e densidade

usado em sensores eltronicos e oticos

formam-se sozinhas

silanização

método de preparação da camada
funciona em todas as superficies de oxidos metálicos

mais complicado de se obter uma monocamada homogenea

o que é microfluidica de papel?

tecnologia que utiliza o papel como material de base para criar dispositivos capazes de transportar e analisar pequenas quantidades de líquido sem a necessidade de bombas ou equipamentos complexos

vantagens do uso do papel como elemento microfluidico

• papel é um material barato, acessível e abundante

• suporta uma grande variedade de químicos de biomedicina (bom p/aplicações biomédicas)

• consegue transportar liquidos por forças capilares (s/necessidade de bombas ou equipamentos)

vantagens de biossensores baseados na microfluídica de papel

• baixos custos de produção e utilização,

• de fácil uso e manuseamento, não exigindo conhecimentos técnicos super especializados)

• descartáveis

• não necessitam de equipamentos extra (adequados para lugares sem recursos

em que se baseia o funcionamento dos muPADS

baseia-se no transporte de líquidos através do papel devido à capilaridade - capacidade de um líquido fluir espontaneamente em canais estreitos contrariando a força da gravidade; equlibrio entre adesão e coesão.

quais os elementos principais dos muPADs

• matriz hidrofílica

• canal

• barreiras hidrofóbicas

Barreiras Hidrofílicas nos muPADs

função

repelem a água e impedem que o líquido da amostra se espalhe para fora dos canais - essenciais no controlo do movimwnto dos líquidos no papel.

Barreiras Hidrofílicas nos muPADs

composição

podem ser criadas através de diferentes materiais (e técnicas)

podem ser compostas de

• resina fotossensível

• cera

fotolitografia nos muPADs

o que é e funcionamento

técnica para a formação da barreira hidrofóbica

1) impregnação do papel com a resina fotosensível;

2) pré aquecimento

3) alinhamento da máscara (padrão pretendido molde)

4) exposição a UV

%) pos aquecimento

6) revelação e remoção da resina não curada

fotolitografia nos muPADs

resumo

faz uso de resinas fotossensíveis que quando expostas à luz sofrem alterações químicas que as tornam resistentes a determinados reagentes

técnica para formar barreira hidrofóbica nos muPADs

wax printing nos muPADs

o que é e funcionamento

técnica para a formação da barreira hidrofóbica

faz uso da cera como uma tinta sólida

1) Desenho dos padrões
num programa de computador, definindo os canais, zonas de teste e a gemoetria do dispositivo

2) Impressão em cera
através de uma impressora de tinta sólida

3) Difusão por aquecimento
papel é colocado numa placa de aquecimento, de modo à cera conseguir penetrar e difundir-se na espessura do papel, ao solidificas ficam as barreiras hidrofóbicas criadas

4) depoisção dos reagentes

5) selagem
para prevenir contaminação externo ou evaporação

wax printing nos muPADs

generalidade

para formação de barreiras hidrofóbicas

não poluente, sendo considerada greenprint

associada ao Xerox

escolha do papel nos muPADs

é muito importante pois influencia a forma como os liquídos se deslocam, são absorvidos e transportam substâncias

angulo de contacto!

angulo de contacto no papel dos muPADs

propriedade importante relacionada ao tipo de papel em uso nos muPADs

permite avaliar o comportamento hidrofílico e hidrofóbico

é considerado como o angulo que se forma entre a superfície de contacto e a tangente da superfície da gota

se inferior a 90: superfície é hidrofílica

se superior a 90: superfície é hidrofóbica

se semelhante a 0: líquido espalha-se totalmente

papel de cromatografia

papel desenvolvido para aplicações laboratoriais

tem estrutura porosa uniforma

boa absorção, sendo esta favorecida (alta afinidade pela água

boa reprodutibilidade no uso em muPADs

angulo de contacto=12 → bastante adequado para muPADs, é hidrofílico

papel de escritório - xerox performes

a sua superficie é lisa e completa

menor porosidaade que o papel de cromatografia

angulo de contacto = 106,2 → logo o comportamento é hidrofóbico e a água tem dificuldade a espalhar-se por ele

papel reciclado - cópia 200

pode apresentar fibras de diferentes comprimentos e caracteriditcas, tendo uma estrutura menos homogénea

angulo de contacto=97,7 → comportamente hidrofóbico, água tem dificuldade a espalhar-se

papel de filtro de café - silvex

feito mesmo para deixar a água passar

a sua estrutura é fibrosa e porosa

angulo de contacto = 18,3º → logo é hidrofílico e permite que a água se espalhe

tipos de deteção que podem ser integrados nos muPADs

• deteção colorimétrica
  glucose, proteínas, nitritos, bactérias, pH
  
  

• deteção eletroquímica
  glucose, colesterol, ácido úrico, chumbo, etanol
  
  

• deteção eletroquímica luminescentes
  NADH, ferro na hemoglobina

exemplo de deteção colorimétrica para deteção de dois marcadores: Glucose e BSA

glucose fica vermelho

proteína fica azul/verde

útil para análise de urina

witch fabrication

integração de válvulas/interruptores fluídicos mecânicos no muPADs

Estes vão permitir controlar a passagem de líquidos dentro de um dispositivo microfluídico

permite controlar reações multipasssos, ou seja ensaios complexos

3D muPADs

tridimensionalidade permite o cruzamento de canais sem mistura e o processamento de ensaios multiplexados em larga escala

muPADs medição do nível de glucose em soluções

importância

a glucose é a fonte primária de energia celular, sendo transportada na corrente sanguínea; é muito relevante em vários contextos médicos como na monitorização da Diabetes

muPADs permitem PoC

muPADs medição do nível de glucose em soluções

construção

3 componentes

• película superior
  protege o dispositivo e possui aberturas para introduzir a amostra

• papel com canais de cera
  canais microfluídicos onde a solução circula

• película inferior
  fecha dispositivo

muPADs medição do nível de glucose em soluções

geometria

trifurcado
ou seja líquido introduz-se num canal central que se difunde em 3, criando 3 zonas de deteção independentes

as 3 zonas permitem a realização de réplicas experimentais e de ajustamento a condições - maior confiança na medição; distinguir concentrações diferentes e evitar saturações ou limitações de cada ensaio

muPADs medição do nível de glucose em soluções

deteção química

método enzimático GOD-POD (glicose oxidase - reage com glucose - e peroxidade - oxidação indicador cromogénico -, respetivamente)

3 tipos de reação a ocorrer

• iodeto de potássio IK
  torna-se amarelo castanho com oxidação

• indicador AB
  acomplamento oxidativo fica vermeljo

• indicador misto AB+IK
  resposta intermédia colorimétrica

A transferência da informação colorimétrica é feita pelo sistema RGB, que analisa quantitativamente a concentração de glucose

muPADs Leishmaniose

importancia e doença

aplicação veterinária para o rápido diagnóstico de leishmaniose canina

a leishmaniose é uma doença parasitária causada por protozoários Leishmania, sendo uma doença zoonotica

é importante haver esta identificação de cães infetados para

• detetar precoce/ a infeção

• acompanhar o tratamento animal

• impllementar medidas de controlo do vetor

• contribuir para a prevenção da doença aos humanos

point of care

muPADs Leishmaniose

dispositivo de diagnóstico

funciona segundo o principio do lateral flow assay

o liquido percorre 4 zonas através da capilaridade

• sample pad
  zona da amotra, onde se insere a amostra biológica
  permite o inicio do transporte
  
  

• conjugate Pad
  tem partículas coloridas ligadas a ac ou outros reagentes
  quando a amostra passa estes reagente entram em contacto com o alvo a detetar
  
  

• membrana de nitrocelulose
  zona onde ocorre a deteção

• possui as linhas de controlo e teste
  teste: responsável pela deteção, se o marcador estiver presente ocorre a reação de captura, com acumulação de partículas coloridas que cria a linha
  controlo: verifica se o teste está a funcionar corretamente, confirma que reagentes estão a funcionar
  
  

• wicking pad
  zona absorvente, absorve o excesso de liquido no fim do dispositivo

muPADs Leishmaniose

Fabrico

• preparação do papel, com desenho da estrutura do canal pelas barreiras hidrofóbicas

• deposição linhas T e C
  colocam se os reagentes que ficam imobilizados na membrana
  na linha T são os antigenios leishmania e na C os ac de controlo

• Deposição do conjugado
  marcador colorimétrico

• Aplicação de amostra

• Desenvolvimento do teste

leishmania

imunodeteção da leishmania
Anticorpos no circulo no inicio são da amostra biologica sendo Y verde o anti leishmania ac e o Y azul outro
a estrela é a proteina A conjugada ao AuNO, que são os responsáveis por oferecer a cor vermelha se concentrados

na zonas de teste há a primeira, estrela preta, que contem o antigenio leshmania imobilizado

e a de controlo tem um anticorpo controlo para verificar funcionamento do teste

conforme a solução flui a proteina A-AUNP liga-se à região constante dos ac da amostra

na linha de teste os anticorpos da leishmania são capturados ao se ligar aos antigenios leishmania da zona (epitopos livres) - acumulação deles gera uma linha vermelha

na linha de controlo, os restantes complexos imunes são capturados pelos anticorpos

identifica

cinzento: positivo

laranja: negativo

azul claro: não válido

Sensores Eletroquímicos

os seus transdutores convertem reações químicas em sinais elétricos

a resposta analítica deles surge devido a transferência de carga na interface do elétrodo/eletrólito (que é heterogénea)

reações redox geram potencial, corrente e impendância

o sinal eletrico é proporcional à concentração de analito

sistema de 3 eletrodos

• dos sistemas mais usados em anáçlises eletroquímicas de precisão

cada eletrodo tem uma função diferente

working eletrodo
é onde ocorre a reação de oxidação ou redução

referência
mantém o potencial estável e conhecido

auxiliar

passagem de corrente elétrica

sistema de 2 eletrodos

no caso o WE e CE

a configuração é mais simples, mais barata e adequada a PoC

contudo pode levar a problemas na polarização do contra eletrodo, diminuindo a precisão do teste

materiais usados para eletrodo de trabalho

carbono

outro

platina

grafeno

LIG

nanoparticulas de metal

modos de operação de sensores eletroquimicos

• voltametricos (3 eletrodo setup)

• amperometrico (3 eletrode setup)

• impedimetricos (3 eletrode setup)

• potenciometrico (2 eletrodos)

exemplos e aplicações de sensores eletroquimicos

• biossensores de glucose
  amperimetricos, enzimatidos ou medidores

• biossensores de lactato
  amperometrico, wearables

• ph
  potenciometricos

• biossesnores de afinidade
  impediometricos

O que significa LIG?

fabricação dos elétrodos LIG?

vantagens

Laser-Induced Graphene: grafeno produzido por indução laser.

Preparação do substrato, laser patterning e encapsulamento.

Prototipagem rápida, montagem simples, utilização de diferentes substratos e otimização da geometria e das propriedades dos materiais.

O que é a biofuncionalização do working electrode?

Imobilização de enzimas (GOx ou GDH) e mediadores na superfície do elétrodo, por adsorção ou ligação covalente.

Como funciona o sensor enzimático não mediado de glucose?

A GOx oxida a glucose, produzindo gluconolactona e H₂O₂. A oxidação do H₂O₂ gera eletrões, originando uma corrente elétrica mensurável.

SEM um mediador eletrónico adicional, neste caso um mediador à base de ferro.

Qual é a diferença entre sensores mediados e não mediados?

O não mediado deteta o H₂O₂ produzido pela reação enzimática. O mediado utiliza um mediador para transferir eletrões entre a enzima e o elétrodo, permitindo a deteção eletroquímica da glucose.

Anticorpos Policlonais

caracteristicas e vantagesn/desvantagens

direcionados contra todos os epitopos do antigénio, i.e

• tem propriedades heterogéneas, existem uma variedade de anticorpos com especificidades e afinidades diferentes

• baixa pureza

• menor custo de produção

• obtidos relativamente depressa

tem a vantagem de reconhecer várias regiões do antigénio, contornando bloqueios pela obstrução de 1 epitopo

mas tem maior variabilidade e menor consist~Encia

produção anticorpos policlonais

admnistração do antigénio num animal, de modo a induzir uma resposta imunitária (SI reconnhece como estranho, ativa linfócitos B que maturam a plasmócitos e produzem anticorpos)

centrifugação de sangue do animal, separando os seus componentes. O anti-soro é a fração liquida que contem os ac produzidos contra o antigenio, proteinas plasmaticas e outras proteinas

purificação dos ac de interesse

obtém-se uma misturas de anticorpos com diferentes especificidades

produção anticorpos monoclonais

admnistração do antigénio num animal, de modo a induzir uma resposta imunitária (SI reconnhece como estranho, ativa linfócitos B que maturam a plasmócitos e produzem anticorpos)

mata-se o animal e recolhe-se o baço, onde se encontram os linfócitos

fundem-se com células de mieloma, formando hibridoma que é cpaz de produzir ac e dividir-se indefinidamente

seleção celular, purificação

anticorpos monoclonais

→ direcionados a 1 único epitopo

são produzidos a partir de um único clone de linfócitos B

• propriedades homogéneas

• maior pureza

• caracteristicas especificas

• mais caro

• mais tempo de produção

anticorpos recombinantes

→ segmentos clonados de um gene de uma célula que expressa o ac

produzidos por técnicas de engenharia genética

• propriedades homogeneas

• alta purezza

• selecionada de uma biblioteca de cDNA

• avaliabilidade curte

• caros

Imunoensaio

técnica de laboratório que utiliza a ligaçãoque ocorre entre o antigénio e o anticorpo correspondente para identificar e quantificar o antigenio/anticorpo ou substância numa amostra

a afinidade anticorpo antigénio forma um complexo estável que serve de base para o imunoensaio

ensaio que quantificica um ac ou antigenio por meios imunoquímicos

métodos de deteção utilizados em imunoensaios

• imunofluorescência

• imunonefelometria

• radioimunoensaio

imunofluorescência

método de deteção utilizado em imunoensaios

• Utiliza anticorpos ligados a marcadores fluorescentes.

• O anticorpo reconhece e liga-se ao antigénio específico.

• Quando iluminado com um comprimento de onda adequado, o marcador emite luz fluorescente.

• A fluorescência permite identificar onde está o antigénio.

Portanto, a deteção é feita através da emissão de luz fluorescente.

Imunonefelometria

método de deteção utilizado em imunoensaios

• O antigénio reage com o anticorpo específico numa solução.

• Formam-se complexos antigénio–anticorpo.

• Estes complexos podem formar partículas que dispersam a luz.

• Mede-se a intensidade da luz dispersa, que está relacionada com a concentração do analito.

Portanto, a deteção é feita através da dispersão da luz (light scattering).

solução turva se houver formação de partículas

Radioimunoensaio

método de deteção utilizado em imunoensaios

• Utiliza antigénios ou anticorpos marcados radioativamente.

• Um exemplo de marcador é o iodo-125 (¹²⁵I).

• O marcador radioativo permite detetar a ligação através da medição da radioatividade.

• A intensidade do sinal permite determinar a concentração do analito.

Portanto, a deteção é feita através da medição da radioatividade.

quimioluminescência

É um fenómeno em que uma reação química liberta energia sob a forma de luz.

Pode ser utilizada em:

• Imunoensaios (deteção de antigénios ou anticorpos).

• Biossensores.

• Deteção de determinadas moléculas em amostras biológicas.

• Análises químicas e ambientais.

Ensaio Imunoenzimático (EIA) para Deteção de Antigénios

técnica de imunoensaio baseada na ligação específica entre um antigénio e um anticorpo, utilizando uma enzima para produzir um sinal detetável.

Consoante o tipo de marcador e substrato utilizados, o sinal pode ser:

• Colorimétrico: produz uma alteração de cor (o formato clássico de ELISA).

• Quimioluminescente: produz luz através de uma reação química.

• Fluorescente: utiliza um marcador fluorescente para produzir um sinal luminoso.