Méthodes d’études des genes

Quels sont les trois piliers pour comprendre le vivant ?

• Génétique

• Biochimie

• Biologie moléculaire

Quand a été realisé le séquençage du génome humain?

Dans les années 2000

Quelles sont les propriétés physico-chimiques de l’ADN ?

• Taille variable

• Masse variable

• Longueur variable

• Charge négative

Pourquoi la charge de l’ADN est elle négative ?

• Car présence de nombreux groupements phosphates

Vers quoi l’ADN migre t il en electrophorese ?

• Vers l’anode : pôle positif

À quoi la masse de l’ADN est elle proportionnelle ?

• À la quantité de base

À quelle longueur d’onde l’absorption de la lumière UV par les bases de l’ADN est elle maximale ?

• 260nm

Par quoi est obtenu le spectre d’absorption ?

• Par mesure de la densité optique par un spectrophotomètre

À quoi la hauteur du pic dans le spectre d’absorption est elle proportionnelle ?

• Directement proportionnelle à la concentration d’ADN

Que signifie un épaulement à 280nm sur un spectre d’absorption ?

• Présence de proteines

Qu’est ce que l’effet hyperchrome ?

• Absorbance à 260nm → ADN double brin < ADN simple brin

Loi de Beer Lambert

• Relie la densité optique mesurée à la concentration des acides nucléiques

Qu’est ce que la dénaturation de l’ADN?

• Dissociation de l’ADN double brin en deux ADN simple brin par rupture des liaisons hydrogènes

Qu’est ce que la température de fusion Tm?

• Température pour laquelle 50% de l’ADN est dénaturé

Dans quelles techniques est utilisée la température de fusion?

• Dans les techniques d’hybridation

Par quoi est obtenue la dénaturation de l’ADN?

• Traitements physiques → Augmentation température, changement pH

• Agents chimiques → chaotropes

Par quoi est modulée la dénaturation de l’ADN?

• Nb liaisons hydrogène

• Taille fragment

• Force ionique milieu

• % en paire de bases G-C

Comment se fait la renaturation de l’ADN?

• Ré-appariement spontané des deux simples brins par complémentarité

Comment varie la température lors de la renaturation de l’ADN?

• Abaissement de la température

Par quoi est défini la renaturation de l’ADN?

• Par le paramètre COT

Comment peut se faire la dégradation des acides nucléiques ?

• Par coupure chimique

• Par coupure enzymatique

Quels sont les deux acteurs de la coupure enzymatique des acides nucléiques ?

• Exonucléases

• Endonucléases

Comment est la quantité d’ADN dans chaque cellule humaine et dans le corps humain ?

• Dans chaque cellule : très faible

• Dans le corps humain : 600g

Quelles sont les cellules utilisées pour l’extraction de l’ADN?

• Possibilité d’utiliser toutes les cellules nucléés de l’organisme

• Le plus souvent les leucocytes

À quoi sont sensibles les ARN ?

• Aux ribonucléases = RNAses

Quelle est l’activité des endonucléases ?

• Coupure des liaisons phosphodiesters des molécules d’ADN ou d’ARN

Que reconnaissent les endonucléases ?

• Motifs palindromiques → 4 à 8 désoxynucléotides

Que sont les endonucléases ?

Des enzymes de restriction

De quelle origine sont les endonucléases ?

• Origine bactérienne → ex : EcoRI

Quels sont les deux types coupures des endonucléases ?

• Franche : création extrémités équivalentes

• Cohésive : création extrémités asymétriques

Quelle est l’activité des polymérases ?

• Catalyse l’extension d’un brin d’ADN ou d’ARN

Comment est aussi appelée l’ADN polymérase ARN dépendante ?

• Reverse transcriptase

Pour quoi est utilisée l’ADN polymérase ARN dépendante ?

• Pour la création d’ADN complémentaire : ADNc

Qu’est ce qu’un ADNc = ADN complémentaire ?

• Copie des séquences d’ARNm sous la forme d’un ADN double brin

Quelle est l’activité des ligases?

• Crétaion de l phosphodiesters entre extrémités 5’ phosphate et 3’ OH

• Nécessite molécule d’ATP

Quels sont les groupes marqueurs permettant la visualisation des acides nucléiques durant leur analyse ?

• Isotopes radioactifs

• Fluorophores

Ou sont marqués les fragments ?

• Aux extrémités des acides nucléiques

Par quoi sont marquées les extrémités des acides nucléiques ?

• Par ajout de phosphates marqués grâce à des enzymes

-3’ OH : terminal transférase

-5’ phosphate : ATP-y32P et T4 kinase

Par quoi se fait le marquage interne des acides nucléiques ?

• Par amorçage aléatoire

Selon quels critères se fait la séparation des fragments par electrophorese sur gel ?

• Selon masse/ taille

À quoi est proportionnelle la migration dans un champ électrique en electrophorese sur gel ?

• Proportionnelle à la taille

Quel est l’intérêt de l’hybridation?

• Recherche d’une séquence d’intérêt ou cible au sein d’un génome

Qu’est ce qu’une sonde moléculaire ?

• Séquence d’ADN complémentaire de la séquence cible

Pour quoi sont utilisées les sondes moléculaires ?

• Pour l’hybridation

Quels sont les trois types de sondes moléculaires ?

• Génomique

• ADNc

• Oligonucléotide

Par quoi est obtenu l’ADNc ?

• Par transcription reverse des ARNm

Qu’est ce qu’un oligonucléotide et comment est ce synthétisé ?

• ADN ou ARN simple brin de 18 à 50 nucléotides

• Synthétisé chimiquement

Quels sont les facteurs influençant l’hybridation?

• Température

• Taille fragments et sonde

• Force ionique

• Nature des hybrides

Comment est la température optimale d’hybridation ?

• Généralement inférieure à la température de fusion de la sonde

En présence de quoi l’hybridation est elle accéléré ?

En forte concentration saline

Ordre stabilité des hybrides

• ARN/ARN>ARN/ADN>ADN/ADN

Quels sont les deux types d’hybridation sur un support solide ?

• Southern Blot pour ADN

• Northern Blot pour ARN

Quels sont les éléments indispensables à une amplification d’ADN par PCR ?

• Matrice : ADN

• ADN polymérase Thermostable

• Mélange de 4 désoxynucléotides

• Un couple d’amorces oligonucléotides

De quoi est composé un couple d’amorces oligonucléotides ?

• Deux séquences d’ADN simple brin complémentaires

Quelles sont les deux conditions du choix des amorces ?

• Hybridation de part et d’autre de la sequence à amplifier

• Orientation 5’-3’

Quelles sont les 3 étapes de la PCR ?

1) Dénaturation à 94-95°C

2) Hybridation des amorces à 55-60°C

3) Polymérisation à 72°C

Quelle est la température optimale de fonctionnement de la Taq polymérase ?

• 72°C

Quelles sont les deux applications de la PCR ?

• Quantification du nombre de copies d’ADN initiales

• Quantification du nombre d’ARNm synthétisés par un gène

Quels sont les éléments indispensables au séquençage de l’ADN par la méthode enzymatique de Sanger ?

• Matrice ADN

• Amorcé

• ADN polymérase

• 4 désoxynucléotides

• 4 didésoxynucléotides

Que sont des didésoxynucléotides ?

• Analogue des désoxynucléotides mais sans hydroxyle en C3’

Par quoi sont marqués les didésoxynucléotides ?

• Par des fluorophores de couleur différente selon la base

Quelles sont les étapes de la méthode de séquençage de sanger ?

1) Dissociation des deux brins d’ADN

2) Hybridation amorce de séquençage

3) Fixation ADN Pol

4) Incorportaion d’un nucléotide à la fois

5) Séparation des fragments par electrophorese capillaire

6) Lecture des fragments par une détecteur de fluorescence

Quels sont les nucléotides incorporés lors de la méthode de séquençage de Sanger?

• Soit un dNTP (99% cas) : polymérisation continue

• Soit un ddNTP (1% cas) : polymérisation s’arrête

Qu’est ce qu’un insert ?

• Tout fragment d’ADN d’intérêt manipulable

Quelles sont les propriétés requises d’un vecteur ?

• Réplication active

• Plus petite taille possible

Exemple principal de vecteur

• Plasmides

Les plasmides comportent ils beaucoup de gènes ?

Non, peu

Caractéristiques plasmides

• Petits ADN double brin circulaire extra chromosomique

• Rencontrés naturellement chez bactéries

• Présence gènes de résistance à un antibiotique

Qu’est-ce que les sites de clonage multiples des plasmides?

• Séquence ADN avec plusieurs motifs nucléotidiques

-Reconnus par enzymes de restriction

-Absents du reste de la sequence du plasmide

Quels sont les deux gènes de sélection des plasmides?

• Un gène contenant site multiple de clonage

• Un gène de résistance aux antibiotiques

Quelles sont les étapes d’intégration de l’insert dans le vecteur ?

1) Digestion = coupure de l’ADN à insérer

2) Digestion vecteur

3) Ligation

Par quoi sont réalisées les digestion de l’insert et du vecteur ?

• Par une enzyme de restriction

À quoi peut aboutir la Ligation lors de l’étape d’intégration de l’insert dans le vecteur ?

• Soit intégration : vecteur recombinant

• Soit re circulation du vecteur sur lui meme sans intégration : vecteur natif

Quelles sont les deux méthodes d’analyse d’interaction entre facteurs protéiques trans et sequence ADN cis?

• Foot printing

• Retardement sur gel

Par quelle méthode peut on caractériser une séquence régulatrice?

• Méthode du gène reporter

Par quoi peut se faire la modulation de l’expression d’un gène ?

• Par expression

• Par extinction

Qu’analyse t on lors de la modulation de l’expression d’un gène par expression ?

• Analyse des conséquences de l’expression d’un gène dans une cellule qui ne l’exprime par naturellement

Qu’analyse t on lors de la modulation de l’expression d’un gène par extinction ?

• Analyse des conséquences de l’arrêt de l’expression d’un gène

Quelles sont les 3 méthodes d’extinction de l’expression d’un gène ?

• ARN anti sens

• ARN interférents (ARNsi)

• Invalidation génétique

Avec quoi s’hybrident les ARN anti sens ?

• Avec ARNm non mature

Avec quoi s’hybrident les ARNsi ?

• ARNm : influence sur transcription et traduction

Qu’est ce que l’invalidation génétique ?

• Remplacement du gène cible par recombinaison par une autre version du gène

Quelles sont les deux versions possibles du gène lors de l’invalidation génétique ?

• Soit une version inactivée : KO → invalidation conditionnelle ou constitutive

• Soit une version modifiée porteuse d’une mutation : K-In

À quoi aboutissent les invalidations génétique ?

À des OGM

Quelles sont les trois méthodes d’analyse globale de l’expression des génomes ?

• Transcriptome

• Protéome

• Metabolome