OM: Oral mikrobiata og metoder til bestemmelse af sammensætningen af orale residente mikrobiata

hvordan betragtes mundhulen i fosterstadiet

• Mundhulen betragtes som steril eller næsten steril under fosterlivet.

• Derfor har barnet ingen etableret oral mikrobiota før fødslen.

beskriv hvad der sker med fosterets mundhule ved fødsel

Barnet udsættes nu for mikroorganismer fra omgivelserne.

Vaginal fødsel

• Barnet møder moderens vaginal- og tarmbakterier.

• Derfor ses ofte flere laktobaciller tidligt.

Kejsersnit

• Barnet udsættes især for hud- og miljøbakterier.

• Derfor ses ofte flere stafylokokker i starten.

hvad sker der med barnets mundhule de første 3 måneder

• Mundfloraen består hovedsageligt af hudbakterier.

• Efterhånden etableres de bakterier, som er bedst tilpasset mundhulen.

• De orale bakterier udkonkurrerer mange af hudbakterierne, herunder stafylokokker.

hvilken betydning har amning for barnets mundhule

• Modermælk indeholder bl.a. antistoffer, gavnlige bakterier og stoffer, der hæmmer vækst af sygdomsfremkaldende mikroorganismer.

• Derfor ses ofte mindre risiko for overvækst af Candida (trøske) hos ammede børn. pga lactobaciller

• Flaskebørn kan have lidt større risiko for at udvikle trøske.

hvordan etablere de første bakterier sig i barnets mund?

• De første bakterier overføres især fra mor via spyt (fx kys, skeer og tæt kontakt).

• I den tandløse mund findes der kun slimhindeoverflader, så bakterierne skal kunne binde sig til slimhinden.

• kun mundbakterier bliver fastboende

hvilke bakterier er de første i barnets mund

Pionerbakterier:

• Streptococcus salivarius

• Streptococcus mitis

• Streptococcus oralis

De kaldes pionerbakterier, fordi de er de første, der koloniserer en næsten bakteriefri mund. Det svarer lidt til situationen efter en tandbørstning, hvor bakterier igen skal etablere sig på overfladen.

hvad gør pioner bakterierne

Pionerbakterierne ændrer miljøet:

• De producerer syrer, så pH falder lidt.

• De forbruger ilt, så miljøet bliver mere iltfattigt (lavere redoxpotentiale).

• De danner næringsstoffer, som andre bakterier kan bruge.

Derudover udtrykker pionerbakterier receptorer på deres overflade. Andre bakterier kan binde sig til disse receptorer, så flere arter kan komme til og danne et mere komplekst biofilm.

beskriv laktobaciller

• Laktobaciller kan tilføres via modermælk.

• De regnes ofte som transiente bakterier, dvs. de opholder sig midlertidigt i mundhulen.

• Når amningen ophører, forsvinder mange af dem igen, fordi de ikke er særligt godt tilpasset mundmiljøet.

beskriv hvordan orale mikrobiata ændres/udvikler sig i barndommen (0-6 år)

Når de første tænder bryder frem:

• Der opstår nye ikke-afstødelige overflader (emalje).

• Bakterier kan nu sidde fast på tænderne i længere tid.

• Derfor bliver mikrobiotaen mere kompleks.

• Før tandfrembrud var bakterierne begrænset til slimhinderne, som hele tiden afstødes.

beskriv hvordan orale mikrobiata ændres/udvikler sig i sen barndommen (6-14 år)

Ved tandskiftet:

• Mælketænder falder ud, og permanente tænder bryder frem.

• Der dannes hele tiden nye koloniseringssteder.

• Bakteriediversiteten stiger.

• Delvist frembrudte molarer samler ofte meget plak.

• Der ses ofte mere gingivalvæske og lettere inflammation omkring tænder under frembrud.

beskriv hvordan orale mikrobiata ændres/udvikler sig i puberteten (12-18+ år)

I puberteten ændres mundmiljøet igen:

• Hormoner påvirker gingiva og gingivalvæsken.

• Gingivalvæsken indeholder flere næringsstoffer.

• Det giver bedre vækstbetingelser for visse anaerobe og proteolytiske bakterier.

• Derfor ses en større andel af bakterier, som forbindes med parodontitis.

beskriv hvordan saliva, antistoffer og pelikkel forandres gennem tiden

Med alderen ændres også:

• Salivas sammensætning.

• Salivas flow-rate.

• Koncentrationen af IgA (sekretorisk immunglobulin A) stiger.

• Pelliklen ændrer sammensætning.

Når pellikel, saliva og immunforsvar ændres, ændres også hvilke bakterier der bedst kan kolonisere mundhulen.

hvordan ændres den orale mikrobiota hos voksne

Hos raske voksne er mikrobiotaen relativt stabil.

• Der sker kun små ændringer over tid.

• Immunforsvaret, saliva og de eksisterende bakterier holder hinanden i balance.

• Dette kaldes homeostase.

hvordan ændres den orale mikrobiota ved tandtab

Når tænder mistes:

• De bakterier, som normalt lever på tandemaljen, mister deres levested.

• Mundfloraen kommer derfor til at ligne en slimhindeflora mere.

• Slimhindebakterier som fx Streptococcus salivarius bliver relativt vigtigere.

• Tungen fungerer stadig som en stor bakteriereservoir.

hvordan ændres den orale mikrobiota ved proteser

Når man får en protese:

• Protesen giver en ny hård overflade, som bakterier kan hæfte sig på.

• Der dannes biofilm på protesen ligesom på tænder.

• Candida albicans kan let kolonisere proteseoverflader.

• Det kan føre til protesestomatitis (svampebetændelse under protesen).

hvordan ændres den orale mikrobiota ved cancer

Ved cancer ses ofte ændringer i mikrobiotaen:

• Øget forekomst af Candida albicans.

• Flere tarmbakterier kan forekomme i mundhulen.

• Flere opportunistiske bakterier som stafylokokker og Pseudomonas aeruginosa.

hvorfor ses mere candida ved cancer?

Immunforsvaret er ofte svækket og har sværere ved at kontrollere Candida.

Ved strålebehandling:

• Spytproduktionen falder (hyposalivation).

• Der kommer færre antimikrobielle stoffer i spyttet.

• Mundhulens naturlige beskyttelse svækkes.

Desuden bliver kolonisationsresistensen dårligere.

hvordan ændres den orale mikrobiata sig hos ældre over 70 år

• Der ses ofte flere stafylokokker i mundhulen.

• Stafylokokker er normalt ikke blandt de dominerende orale bakterier hos raske voksne.

• Når de bliver hyppigere, tyder det på, at den normale balance i mikrobiotaen ændrer sig.

hvordan ændres den orale mikrobiata sig hos ældre over 80 år

• Der ses ofte flere svampe, især Candida.

• Candida findes ofte i små mængder i munden, men kan lettere vokse frem hos ældre.

hvad er grunden til at den orale mikrobiata ændre sig hos ældre?

den cellemedierede immunitet falder med alderen.

Cellemedieret immunitet:

• Styres især af T-lymfocytter.

• Er vigtig til at bekæmpe svampe, virus og intracellulære mikroorganismer.

• Holder normalt Candida under kontrol.

hvilke faktorer styrer udviklingen af den orale mikrobiota (kun navn)

• allogen indflydelse

• autogen indflydelse

beskriv allogen indflydelse

er ikke mikrobiel

Det er ydre faktorer, som påvirker bakterierne:

• Tandfrembrud giver nye overflader, som bakterier kan sætte sig fast på.

• Proteser skaber nye kolonisationssteder.

• Antimikrobielle stoffer (fx mundskyl eller antibiotika) kan hæmme eller fjerne bestemte bakterier.

Disse faktorer ændrer miljøet i mundhulen og dermed hvilke bakterier, der kan overleve.

beskriv autogen indflydelse

er mikrobiel

Her er det bakterierne selv, der ændrer miljøet.

Redoxpotentiale

• De første bakterier bruger ilt.

• Derfor bliver miljøet mere iltfattigt (mere reducerende).

• Det gør det muligt for anaerobe bakterier at etablere sig senere.

Mikrobielle fødekæder

• Nogle bakterier producerer affaldsstoffer eller nedbrydningsprodukter.

• Andre bakterier bruger disse som næring.

• Derfor kan flere arter efterhånden leve sammen.

Nye bakterielle receptorer

• Bakterier kan binde sig til hinanden (co-aggregation).

• En bakterie skaber en overflade, som andre bakterier kan hæfte sig på.

• Så bliver biofilmen mere kompleks.

hvad bidrager både allogen og autogen indflydelse med?

Mikrobiel udvikling

Alle disse faktorer fører til en gradvis udvikling af biofilmen:

1. Pionerbakterier koloniserer først.

2. De ændrer miljøet.

3. Flere bakteriearter kan derefter etablere sig.

4. Biofilmen bliver tykkere og mere kompleks.

hvad sker der efter den mikrobielle udvikling hvis man ikke børster tænder længe

Efter cirka 14-21 dage uden tandbørstning opnås et klimaks-samfund.

Det betyder:

• Bakteriesammensætningen bliver relativt stabil.

• Nye bakterier kommer stadig til, men samfundet ændrer sig ikke ret meget.

• Biofilmen har nået et modent stadium.

hvorfor bliver biofilmen ikke ved med at vokse?

Fysisk modstand

• deskvamation af epitelceller (slimhindeceller afstødes hele tiden og fjerner bakterier)

• saliva flow

• mundbevægelser - shear

Kemisk modstand

• pH (som kan begrænse nogle bakteries vækst)

• antibakterielle stoffer i saliva (kan hæmme)

• begrænset næring til rådighed

• iltindhold (begrænser hvilke bakterier der overlever)

beskriv den orale mikrobiatas dynamiske balance

Den orale mikrobiota er i konstant balance mellem bakterierne, værten og miljøet i munden.

faktorer påvirker løbende, hvilke bakterier der trives.

feks: pH, næring, mundbevægelser, saliva flow, ilt, immunforsvar

beskriv homeostase

Homeostase betyder, at mundens mikrobiota er i balance.

• Der findes mange forskellige bakterier.

• De holder hinanden i skak.

• Immunforsvar, saliva og bakterier arbejder sammen, så der ikke udvikles sygdom.

Det er en dynamisk balance, fordi der hele tiden sker små ændringer.

beskriv resistens

Resistens er biofilmens evne til at modstå en forstyrrelse.

Eksempel:

• Du ryger én cigaret.

• Der tilføres kemiske stoffer, og spytflowet falder lidt.

• Alligevel ændres bakteriesammensætningen kun lidt.

Biofilmen "står imod" påvirkningen.

beskriv resiliens

Resiliens er biofilmens evne til at vende tilbage til den oprindelige tilstand efter en forstyrrelse.

Eksempel:

• Rygning eller anden påvirkning ændrer faktisk biofilmen midlertidigt og bakteriesamfundet forskydes faktisk efter rygning.

• Når påvirkningen stopper, vender bakteriesammensætningen tilbage mod udgangspunktet.

Det er derfor, man ikke nødvendigvis får sygdom af en enkelt påvirkning.

så forskel i resistens og resiliens?

• Resistens = evnen til at modstå ændringen.

• Resiliens = evnen til at komme tilbage efter ændringen.

I figuren:

• Før rygning holder biofilmen sig tæt på ligevægten → det er resistens.

• Rygningen får biofilmen til at ændre sig alligevel → resistensen var ikke stor nok til helt at forhindre ændringen.

• Efter rygningen stopper, bevæger biofilmen sig tilbage mod udgangspunktet → det er resiliens.

beskriv traditionel identifikation af bakterier med dyrkning

1. Først skal bakterien kunne dyrkes

• Man tager en prøve og prøver at få bakterien til at vokse på et dyrkningsmedie (agar).

• Problemet er, at mange orale bakterier ikke kan dyrkes i laboratoriet.

2. Cellemorfologi og farvning

Når bakterien vokser, ser man på formen (kokker eller stave) og Gramfarvning

3. Forhold til ilt

Man undersøger, om bakterien er anaerob, aerob eller fakultativt anaerob ved at dyrke under iltfattige forhold og undersøger vækst.

4. Forgæring af sukker

Man tester, hvilke sukkerarter bakterien kan omsætte.

• Hvis bakterien forgærer sukker, dannes syre.

• pH falder, og mediet skifter farve.

5. Enzymproduktion

Man undersøger, hvilke enzymer bakterien producerer.

Eksempel:

• Katalase-test.

• Hvis bakterien producerer katalase, dannes bobler ved tilsætning af hydrogenperoxid.

beskriv molekylær metode m. dyrkning til at identificere bakterier

1. GC%

Man måler, hvor stor en del af bakteriens DNA der består af guanin (G) og cytosin (C).

• Forskellige bakterier har forskellig GC-procent.

• Kan bruges til at karakterisere og sammenligne bakterier.

2. DNA-hybridisering

Man sammenligner DNA fra en ukendt bakterie med DNA fra en kendt bakterie.

• DNA-strengene adskilles (denatureres).

• Enkeltstrengene blandes.

• Hvis de binder godt til hinanden (hybridiserer), ligner DNA'et hinanden.

Over ca. 70 % hybridisering tyder på, at det er samme art.

3. 16S rRNA-sekventering

Den vigtigste metode.

• Man sekventerer 16S rRNA-genet.

• Dette gen findes hos alle bakterier.

• Nogle dele er ens hos alle bakterier, mens andre varierer mellem arter.

Hvis sekvenserne ligner hinanden meget (typisk >97 %), er bakterierne sandsynligvis samme art.

4. Kemotaxonomi

Man undersøger bakteriens kemiske bestanddele: lipider, proteiner, polysakkarider, cellevæg

Disse mønstre kan bruges til identifikation.

5. Serologi

Man bruger antistoffer til at genkende bakterier.

• Et kendt antistof tilsættes.

• Hvis antistoffet binder til bakterien, ved man, at bestemte overfladeantigener er til stede.

• Kan derfor bruges til identifikation.

beskriv molekylær metode uden dyrkning - hvem er til stede

1. Prøvetagning

Man tager en prøve fra biofilm, spyt og/eller andre steder i mundhulen

Derefter ekstraheres bakteriernes DNA.

2. PCR af 16S rRNA-genet

PCR fungerer som en "kopimaskine" for DNA.

• Man vælger 16S rRNA-genet, fordi alle bakterier har det.

• Genet har både:

  • konserverede områder (næsten ens hos alle bakterier)

  • variable områder (forskellige mellem arter)

Primere binder til de konserverede områder, og PCR laver millioner af kopier af genet via

denaturering: DNA-strengene skilles ad

annealing: Primerne sætter sig fast

elongering: Et enzym laver nye DNA-strenge

dette gentages 25-35 gange

3. Sekventering

Nu aflæses rækkefølgen af DNA-baserne

Dermed får man den præcise DNA-sekvens for bakterierne i prøven.

4. Kvalitetskontrol

• Fejl og støj fjernes.

• Sekvenserne sorteres i unikke grupper (ASV'er).

En ASV repræsenterer en bestemt bakteriel variant.

5. Sammenligning med database

Sekvenserne sammenlignes med en database, fx HOMD (Human Oral Microbiome Database).

• Finder man et match, kan bakterien identificeres.

6. Taksonomisk profil

Til sidst får man en oversigt over:

• hvilke bakterier der er til stede

• hvor stor en andel de udgør

beskriv molekylære metoder uden dyrkning - metagenomanalyse - hvad kan de

kaldes også shotgun metode

1. Prøvetagning

Man tager en prøve fra fx plak eller spyt og isolerer alt DNA.

2. DNA-sekventering

Alt DNA klippes i små fragmenter og sekventeres.

• Ikke kun ét gen.

• Hele arvematerialet fra alle bakterier undersøges.

3. Kvalitetskontrol

• Dårlige DNA-sekvenser og fejl fjernes.

4. Samling og annotation

• Computerprogrammer finder fragmenter, der overlapper.

• Fragmenterne samles til længere sekvenser (contigs).

• Man leder efter gener og deres funktioner.

5. Biologisk fortolkning

Nu kan man se:

• Hvilke bakterier der er til stede.

• Hvilke gener de har.

• Hvad de kan gøre.

feks resistens eller stofskifte

hvad er forskellen på shotgun metode og 16S?

Forskellen fra 16S-metoden er:

• 16S-metoden ser kun på ét gen (16S rRNA-genet).

• Metagenomik ser på alt DNA i prøven.

hvilken metoder vælger man?

1. 16sRNA

2. Dyrkbare bakterier

3. Shotgun - hvad kan de metoden

4. Traditionelle dyrkningsmetoder