20 Encimi in kataliza

Kemijske reakcije v bioloških sistemih - termodinamski vidik

• vodno okolje celic

• spontano lahko poteka hidroliza anhidridnih, estrskih, peptidnih, glikozidnih vezi (∆G < 0)

• za tvorbo vezi (∆G > 0) je nujna sklopitev z eksergonsko reakcijo

• Sizifovo delo

• zelo pomembna hitrost kemijske reakcije

Kemijske reakcije v bioloških sistemih - kinetični vidik

• Q₁₀ (temperaturni kvocient) - za kolikokrat se hitrost biokem. reakcije spremeni, če se T poveča za 10 ºC

  • za biološke procese okoli 2

  • majhen, če vemo, da je W_k(molekul) = m ^. v² / 2 linearno proporcionalna T (k_BT)

  • porazdelitev molekul po E sledi Maxwell-Boltzmannovi enačbi

  • za uspešnost reakcije potrebna dovolj velika E_a

  • višja T → večja površina pod grafom → večja verjetnost, da reakcija poteče

Teorija prehodnega stanja

• transition state

• opišemo z modificirano Arreniusovo enačno

Biokemijske reakcije - termodinamsko in kinetično kontorlirane

• ∆G - smer reakcije pod termodinamskimi ravnotežnimi pogoji

• ∆G^# - kako hitro bo reakcija potekla pod določenimi pogoji

• življenje ne poteka pod ravnotežnimi pogoji → nujna kontrola

• energijske bariere nujne za kinetično stabilnost → znižanje (kataliza) → hitrejša reakcija

• nastanek kinetičnega produkta hitrejši kot termodinamskega produkta zaradi nižje aktivacijske energije → je pa manj stabilen

Kataliza

• z različnimi kemijskimi dejavniki spremenimo reakcijsko pot → povečamo hitrost reakcije (zaradi znižanja E bariere prehodnega stanja - PS)

• katalizator - stabilizira nestabilno PS, iz reakcije izstopi nespremenjen (ne vpliva na ravnotežje)

Kislinsko-bazna kataliza

• kisline/baze stabilizirajo elektrofile/nukleofile/izstopajočje skupine

• mutarotacija (npr. α-D-glc → β-D-glc) - hitrejša pri nizkih in visokih pH

• katalizatorja H₃O⁺/OH^- - specifična kislinska/bazna kataliza

• katalizatorja kislina/njena konjugirana baza, ki nista topilo (npr. imidazol) - splošna kislinsko-bazna kataliza

• hitrejša, če sta kislinsko-bazni funkcionalni skupini na isti molekuli

  • najhitrejša mutarotacija - kislina + njen konjugiran par + istočasno približanje + pravilna orientacija → malo verjetno

  • najbolje, če sta funkcionalni skupini na isti molekuli

Približevanje in orientacija

• intramolekularne reakcije s pravo konfiguracijo potečejo hitreje zaradi zmanjšanja entropije PS

Kovalentna kataliza

• ko med katalizatorjem in substratom nastane nestabilen kovalentni intermediat → hitro razpade → pospešek reakcije

• nukleofilno katalizirana hidroliza s piridinom

• nukleofilno katalizirana dekarboksilacija acetoacetata

Elektrostatska kataliza

• kataliza s kovinskimi ioni

• ustrezno skupino naredimo bolj elektronegativno

• stabilizacija oksianiona s H-vezmi (pri encimih oksianionske luknje)

• s kovinskim ionom katalizirana dekarboksilacija oksaloacetata

• aktivacija karbonilnega C-atoma s H-vezmi

Biokemijske reakcije - počasne

• substratno specifične in regulirane

• pod fiziološkimi pogoji tako počasne, da so kljub ustreznimi termodinamskimi pogoji kinetično ujete

  • za potek potrebna velika katalitična moč (učinkovitost) bioloških katalizatorjev - encimov

Encimi - biološki katalizatorji

• že starodavna ljudstva → fermentacija → pivo

• velika katalitična moč in specifičnost

• nastanek kompleksa encim-substrat (ES) omogoča geometrijska in fizikalno-kemijska komplementarnost → skupine si ustrezajo tako, da se lahko med seboj povežejo

• aktivno mesto - le majhen del proteinske strukture

• sodelovanje kofaktorjev/prostetičnih skupin

  • majhne molekule/ioni (npr. kovinski ioni)

  • zagotovijo dodatne funkcionalne skupine

  • aktivni encim s kofaktorjem = holoencim

  • neaktiven proteinski del = apoencim/apoprotein

  • prekurzorje (dele) koencimov dobimo s hrano - vitamini

• prilagojeni na okolje delovanja (delujejo pri različnih pH, T, ionski moči …)

  • vpliv pH - ionizacija AK radikalov → vpliv na vezavo (K_m) in pretvorbo (k_kat) S v P

  • vpliv T - s povečevanjem narašča hitrost (do optimuma) → preseg vodi do denaturacije

    • E termofilnih organizmov delujejo pri visokih T (npr. polimeraza Taq pri Thermophillus aquaticus - ključni E pri PCR → v pogojih in vitro lahko z njo pomnožimo katerikoli del DNA)

Razlike med koencimi in prostetičnimi skupinami

koencimi

• menjavanje encimov, na encim niso trajno vezani

• na enem encimu sprejmejo skupino, na drugem jo oddajo

• povezava različnih encimov v kompleksne večstopenjske procese → prenašanje skupine/molekule med substrati

prostetične skupine

• trajno vezane na določen encim, nikoli ne zapustijo

• na istem encimu sprejmejo skupino od enega substrata in jo oddajo drugemu substratu

• povezujejo večstopenjske procese, a običajno sodelujejo z omejenim št. substratov

ni ostre meje med CoE in PSk → včasih molekula z določenimi encimi deluje kot CoE z drugimi pa kot PSk (npr. NADH/NAD⁺)

Visoka katalitična moč in specifičnost encimov

• v primerjavi z njihovim aktivnim mestom zelo veliki → lahko vzržujejo primerno konformacijo → z dovolj veliko vezavno E se lahko veže substrat v PS

• encim in substrat se inducirano prilagodita drug drugemu → princip ključ-ključavnica ne velja!

• šibke interakcije med E in S

Encimi katalizirajo reakcije z več različnimi katalitičnimi mehanizmi

primer: hidrolaza - kimotripsin → ping-pong mehanizem

• vidimo vse oblike mehanizmov: približanje & orientacija, kislinsko-bazna kat., kovalentna kat., elektrostatska kat.

  1. približanje & orientacija - AK radikali v AM (aktivno mesto) na isti molekuli (zmanjšanje S); kovalentna - nukleofilni Ser napade karbonilni C v peptidni vezi

  2. elektrostatska - karbonilni O v oksianionski luknji stabiliziran s H-vezmi (ni prikazano)

  3. kislinsko-bazna - His kot šibka kis., protonira N v peptidni vezi

  4. P1 zapusti AM

  5. vstop vode kot substrat 2

  6. kovalentna - His aktivira vodo, nastane OH^-, S_N OH^- s Ser na karbonilnem C; elektrostatska - karbonilni O v oksianionski luknji satabiliziran s H-vezmi (ni prikazano)

  7. P2 zapusti AM

  8. AM oz. E iz reakcije izstopi nespremenjen

Kataliza z induciranim prileganjem, orientacijo in približevanjem

primer: heksokinaza (E glikolize)

• pravilno orientirati in približati OH-skupino na 6. C-atom in P-skupino ATP → potek fosforilacije glc

• brez prisotnosti sladkorja ATP ne more hidrolizirati (lahko v prisotnosti drugega podobnega sladkorja)

• ob vezavi pride do precejšnje konformacijske spremembe → inducirano prileganje

Kovinska kataliza

primer: enolaza (E glikolize)

• Mg²⁺ kofaktor

• kataliza eliminacije vode s pomočjo stabilizacije - naboja na karboksilni skupini

• ion zniža pK_a vode → pretvorba v reaktivni OH^- ion → lažje zreagira s CO₂