Biochimie - Méthodes d'étude des macromolécules

Flashcards de révision couvrant les méthodes d'étude des macromolécules (centrifugation, dialyse, chromatographies, spectrophotométrie, spectrométrie de masse, électrophorèses, Western Blot, ELISA, cytométrie en flux et approches in silico).

Quels sont les trois types de matériels biologiques issus de cellules eucaryotes utilisables pour analyser le vivant ?

L'ADN (anomalies du génome), l'ARNm (expression des gènes) et les protéines/peptides.

Quels sont les trois grands types d'analyses que l'on peut réaliser lors de l'étude des protéines ?

Les analyses qualitatives (présence/absence, masse moléculaire, modifications post-traductionnelles, localisation), quantitatives et fonctionnelles (interactions protéine-protéine).

Quels sont les trois grands principes méthodologiques utilisés pour l'étude des protéines ?

Les méthodes physiques (propriétés physico-chimiques), les méthodes immunologiques (reconnaissance antigène-anticorps) et les approches in silico (comparaisons et probabilités).

Sur quoi reposent la séparation et l'identification des protéines par les méthodes physiques ?

Sur les propriétés physico-chimiques des acides aminés et des protéines : masse, charge, affinité, hydrophobicité, etc.

Sur quel mécanisme fondamental reposent les méthodes d'étude immunologiques des protéines ?

Sur la reconnaissance spécifique antigène-anticorps au niveau de l'épitope.

Quel est le rôle de la centrifugation dans l'étude des protéines ?

C'est une méthode séparative préparatoire permettant de fractionner le contenu cellulaire, mais elle ne permet pas de caractériser les protéines.

Quelle formule régit la force centrifuge ($F_c$) appliquée aux molécules dans le rotor d'une centrifugeuse ?

$F_c = m \times \text{w}^2 \times x$, où $m$ est la masse, $\text{w}$ la vitesse angulaire du rotor et $x$ la distance de la protéine à l'axe de rotation.

Quelles sont les deux fractions obtenues à l'issue d'une centrifugation ?

Le sédiment ou culot (fraction solide au fond du tube) et le surnageant (fraction liquide).

Lors de la centrifugation d'un prélèvement sanguin, que retrouve-t-on dans le surnageant et dans le culot ?

Le plasma/sérum se retrouve dans le surnageant et les cellules sanguines sédimentent dans le culot.

Quel est le principe de la centrifugation différentielle ?

Il s'agit d'une succession de centrifugations à partir d'un lysat cellulaire, avec des vitesses et des durées croissantes pour faire sédimenter des éléments de plus en plus légers (jusqu'à l'ultracentrifugation).

Quels sont les deux principaux types de gradients de densité utilisés en centrifugation ?

Le gradient de densité en saccharose (sucre) et le gradient de densité au chlorure de césium ($\text{CsCl}$).

À quelle condition de pH la solubilité d'une protéine est-elle minimale, permettant sa précipitation isoélectrique ?

Lorsque le pH du milieu est égal à son point isoélectrique ($\text{pH}_{\text{milieu}} = \text{pI}$).

Comment varie la solubilité d'une protéine lors d'une précipitation sélective par les sels (salting-in / salting-out) ?

Les protéines sont insolubles en absence de sel, leur solubilité augmente à faible concentration saline (salting-in), puis elles précipitent à très forte concentration de sel (salting-out).

Quel est le rôle principal de la dialyse appliquée aux solutions protéiques ?

C'est une technique séparative et préparative reposant sur les échanges osmotiques, permettant de concentrer les protéines.

Quel type de membrane utilise la dialyse et que laisse-t-elle diffuser ?

Une membrane semi-perméable (ou hémi-perméable) qui laisse diffuser les sels, l'eau et certaines petites molécules selon leur gradient de concentration, tout en retenant les protéines.

Donnez un exemple d'application clinique de la dialyse.

Concentrer les protéines urinaires qui sont normalement très peu concentrées dans les urines.

Sur quels deux grands phénomènes physiques repose la séparation chromatographique ?

Sur les phénomènes d'adsorption (interaction avec le support) et les phénomènes de partage entre la phase liquide et la phase solide.

Comment la nature des résidus d'une protéine influence-t-elle sa solubilité dans les solvants ?

Plus une protéine possède de résidus polaires, plus elle est soluble dans l'eau (solvants aqueux) ; plus elle possède de résidus apolaires, plus elle est soluble dans les solvants organiques.

Dans quel ordre les protéines sont-elles éluées par rapport à leur affinité pour la phase stationnaire ?

Dans l'ordre inverse de leur affinité : plus une protéine a d'interactions avec la colonne, plus elle est retenue et collectée tardivement.

De quoi sont respectivement constituées la phase stationnaire et la phase mobile dans une chromatographie sur colonne ?

La phase stationnaire est fixe/solide (microbilles de résine poreuse fonctionnalisées) et la phase mobile est liquide (solvants contenant l'échantillon et tampons d'élution).

Quel est le principe de séparation de la chromatographie de filtration sur gel (exclusion stérique) ?

La séparation des protéines en fonction de leur encombrement stérique et de leur masse moléculaire.

Dans une chromatographie d'exclusion stérique, quelles protéines sont éluées en premier et pourquoi ?

Les grosses protéines sortent en premier car elles passent entre les billes sans entrer dans les microcavités, tandis que les petites protéines pénètrent dans les billes et sont retardées.

Quelle caractéristique structurale peut être déterminée grâce à la filtration sur gel ?

La masse moléculaire d'une protéine native.

Sur quel principe repose la chromatographie d'affinité ?

Sur des interactions spécifiques entre la protéine d'intérêt et un ligand spécifique (anticorps, protéine recombinante…) greffé de façon covalente sur la phase stationnaire.

Comment élue-t-on la protéine fixée sur une colonne de chromatographie d'affinité ?

En modifiant les conditions chimiques du milieu (variation de pH, salinité, etc.) pour altérer l'affinité ligand-protéine.

Quelle est la charge de la résine dans une chromatographie échangeuse d'anions et quelles molécules attire-t-elle ?

La résine est chargée positivement et attire les protéines chargées négativement (les anions) au pH du solvant.

Quelle est la charge de la résine dans une chromatographie échangeuse de cations et quelles molécules attire-t-elle ?

La résine est chargée négativement et attire les protéines chargées positivement (les cations) au pH du solvant.

Quelle est la charge globale d'une protéine lorsque le pH du tampon est inférieur à son pI ($\text{pH}_{\text{tampon}} < \text{pI}$) ?

La protéine a une charge globale positive.

Quelle est la charge globale d'une protéine lorsque le pH du tampon est supérieur à son pI ($\text{pH}_{\text{tampon}} > \text{pI}$) ?

La protéine a une charge globale négative.

Comment s'effectue l'élution des protéines fixées dans une chromatographie d'échange d'ions ?

À l'aide d'un tampon d'élution présentant une concentration croissante en sels (gradient de sels) dont les ions prennent la place des protéines fixées.

Dans la chromatographie en phase inverse pour protéines dénaturées, quel type d'interaction a lieu et quel solvant d'élution est utilisé ?

Les protéines linéarisées interagissent avec les groupes apolaires de la phase fixe par interactions hydrophobes, et l'élution utilise un solvant organique de type acétonitrile.

Quels solvants d'élution utilise-t-on en chromatographie en phase inverse pour des protéines natives ?

Un solvant de type éthylène glycol ou un solvant avec une concentration saline moindre.

Quel est le principe de la chromatographie liquide à haute performance (CLHP ou HPLC) ?

Améliorer les performances de séparation en mettant la phase mobile liquide sous haute pression, ce qui rend la technique plus rapide et plus précise.

Quels ajustements techniques sont nécessaires pour le dispositif de CLHP par rapport à la chromatographie classique ?

Réduction du diamètre de la colonne, ajout de pompes automatisées et emploi de phases fixes renforcées à base de silice pour résister à la pression.

Quelle relation mathématique décrit la mesure de l'absorbance en spectrophotométrie ?

La loi de Beer-Lambert : $A = \varepsilon \times l \times c$, avec $A$ l'absorbance, $\varepsilon$ le coefficient d'absorption molaire, $l$ la longueur de la cuve et $c$ la concentration.

À quelle longueur d'onde mesure-t-on l'absorption des acides aminés aromatiques en spectrophotométrie ?

À environ $280\,nm$.

Sur quel principe repose la spectrométrie de masse (MS) ?

Sur la séparation des molécules ionisées en phase gazeuse en fonction de leur rapport masse sur charge ($m/z$).

Quels sont les quatre composants élémentaires successifs d'un spectromètre de masse ?

1. Source (production d'ions en phase gazeuse), 2. Interface (focalisation et transmission), 3. Analyseur (séparation selon $m/z$), 4. Détecteur (conversion en signal analysable).

Pourquoi réalise-t-on souvent une chromatographie liquide préalablement à la spectrométrie de masse (LC-MS) ?

Pour fractionner les mélanges trop complexes et éviter la superposition de pics issus d'éléments ayant des rapports $m/z$ trop proches.

Qu'est-ce qu'un étalon interne en spectrométrie de masse quantitative et quelle est son utilité ?

C'est une molécule presque identique à la cible (marquée au deutérium $^2\text{H}$ ou au $^{13}\text{C}$) ajoutée en quantité constante pour corriger les variations expérimentales et d'intensité du signal.

À quoi servent les contrôles internes en spectrométrie de masse quantitative ?

Ce sont des mélanges commerciaux de concentrations connues permettant d'évaluer la reproductibilité de la technique.

Quelle est la principale application médicale du MALDI-TOF en bactériologie ?

L'identification rapide des espèces bactériennes par comparaison de leur « profil » ou « pattern protéique » spécifique.

Quel est le principe général de l'électrophorèse ?

La séparation de molécules chargées au sein d'un support gélifié soumis à un champ électrique.

De quoi est composé le gel d'électrophorèse couramment utilisé pour l'étude des protéines ?

De polyacrylamide, obtenu par polymérisation d'acrylamide et de bis-acrylamide formant un maillage poreux et réticulé.

Quels facteurs influencent la migration des protéines lors d'une électrophorèse en conditions natives ?

La charge électrique de la protéine, sa masse moléculaire, son encombrement stérique (structure 3D) et la nature du support.

Quel est le rôle du SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) dans la technique SDS-PAGE ?

Dénaturer la protéine et lui conférer une charge négative uniforme proportionnelle à sa masse, neutralisant ainsi l'impact de sa charge intrinsèque.

Quel est le rôle des agents réducteurs comme le β-mercaptoéthanol ou le dithiothréitol (DTT) en SDS-PAGE ?

Rompre les ponts disulfures pour permettre la dénaturation et la linéarisation complète des chaînes protéiques.

Vers quelle électrode migrent les protéines lors d'un SDS-PAGE et de quoi dépend uniquement leur migration ?

Toutes chargées négativement par le SDS, elles migrent vers l'anode (électrode positive $+$) uniquement en fonction de leur masse moléculaire.

À quoi sert le marqueur de masse moléculaire déposé sur un gel d'électrophorèse ?

À déduire ou contrôler la masse moléculaire de la protéine d'intérêt par comparaison avec un mélange de protéines de tailles connues.

Qu'est-ce qu'un marqueur de charge (témoin de charge) en électrophorèse/Western Blot et citez des exemples ?

Une protéine ubiquitaire présente en quantité constante (ex. actine, GAPDH, albumine) permettant de vérifier la régularité du dépôt entre les puits.

Quel est le colorant non spécifique le plus utilisé pour révéler l'ensemble des protéines sur un gel d'électrophorèse ?

Le Bleu de Coomassie.

Quels sont les objectifs et applications du Western Blot ?

Détecter une protéine spécifique via des anticorps, analyser sa régulation (sur/sous-expression), vérifier sa présence/absence et observer d'éventuelles modifications post-traductionnelles.

Quelles sont les quatre étapes principales du Western Blot ?

1. Électrophorèse SDS-PAGE, 2. Transfert sur membrane (ex. nitrocellulose), 3. Lavage et saturation de la membrane, 4. Détection par anticorps primaire puis secondaire marqué.

Quels sont les deux types de marquage couramment fixés sur l'anticorps secondaire en Western Blot ?

Une molécule émettant une chimioluminescence ou une enzyme catalysant une coloration en présence de son substrat.

Quelles sont les deux dimensions successives de l'électrophorèse bidimensionnelle (2D) ?

1. L'isoélectrofocalisation (IEF) sur gradient de pH où les protéines s'arrêtent à leur pI ; 2. L'électrophorèse SDS-PAGE qui sépare selon la masse moléculaire.

Quel est le principe de l'immunoprécipitation (IP) ?

Une technique de purification en conditions non dénaturantes d'une protéine spécifique (et de ses partenaires) grâce à un anticorps fixé sur des billes de gel, récupérées par centrifugation.

Comment l'immunoprécipitation permet-elle d'identifier des interactions protéine-protéine ?

En conditions natives, la protéine en interaction physique avec la protéine ciblée par l'anticorps reste liée à celle-ci et est co-précipitée.

Quel est le principe de la méthode ELISA en « sandwich » ?

La protéine d'intérêt est prise en sandwich entre un anticorps de capture fixé au support et un second anticorps marqué reconnaissant un épitope différent.

Quels paramètres cellulaires peuvent être analysés par cytométrie en flux (FACS) ?

Le pourcentage de cellules exprimant une protéine fluorescente, l'intensité d'expression, la taille et la granulométrie des cellules.

Quelle pathologie hématologique est couramment dépistée par électrophorèse des protéines sériques révélant un pic monoclonal d'immunoglobulines ?

Une gammapathie monoclonale (présente dans certains cancers du sang ou de la moelle osseuse).