Blokscan 2 (op basis van de leerdoelen)

Wat is een expressievector en wat is het verschil met een gewone kloneringsvector?

Een expressievector is een DNA-construct waarmee een gewenst gen (gene of interest) in een gastheercel tot expressie kan worden gebracht, zodat de cel een recombinant eiwit produceert.

• Kloneringsvector: bedoeld om DNA-fragmenten te bewaren en vermeerderen.

• Expressievector: bevat daarnaast regulerende DNA-elementen die nodig zijn voor transcriptie en translatie.

Een plasmide is een veelgebruikte vector: een meestal klein, circulair DNA-molecuul.

Wat zijn de functies van de promotor, het gene of interest (GOI) en de terminator?

Promotor: start en reguleert transcriptie.

GOI: codeert voor het gewenste eiwit.

Terminator: zorgt voor beëindiging van transcriptie.

Wat zijn de functies van de ori, selectiemarker en MCS?

Ori: zorgt dat het plasmide kan repliceren.

Selectiemarker: maakt selectie van cellen met de vector mogelijk.

MCS: bevat restrictieplaatsen om het gewenste gen in te bouwen.

Wat zijn de functies van de RBS, Kozak-sequentie en het poly-A-signaal?

RBS (prokaryoten): helpt het ribosoom de translatie te starten.

Kozak-sequentie (eukaryoten): bevordert de start van translatie.

Poly-A-signaal (eukaryoten): ondersteunt mRNA-verwerking en stabiliteit.

Wat zijn de functies van een signaalsequentie en een purificatietag?

Signaalsequentie: stuurt het eiwit naar een bepaalde locatie, bijvoorbeeld richting uitscheiding.

Purificatietag: maakt zuivering gemakkelijker, bijvoorbeeld een His-tag.

Wat is het verschil tussen een prokaryotische en eukaryotische expressievector?

Een prokaryotische expressievector bevat een bacteriële promotor, een RBS voor de start van translatie en een bacteriële terminator. Deze vector wordt gebruikt voor eiwitexpressie in bacteriën, zoals E. coli.

Een eukaryotische expressievector bevat een eukaryotische promotor, vaak een Kozak-sequentie voor de start van translatie en een poly-A-signaal voor mRNA-verwerking. Deze vector wordt gebruikt voor eiwitexpressie in bijvoorbeeld gist- of zoogdiercellen.

Belangrijk: De regulerende DNA-elementen moeten passen bij de gastheercel. Een eukaryotische expressievector kan ook een bacteriële ori en selectiemarker bevatten, zodat de vector eerst in bacteriën kan worden vermeerderd.

Wat is het verschil tussen een constitutieve en induceerbare promotor, en wanneer gebruik je welke?

Constitutieve promotor: zorgt onder geschikte omstandigheden voortdurend voor genexpressie.

Induceerbare promotor: de expressie wordt aangezet of gereguleerd door een signaal of toegevoegde stof.

Een induceerbare promotor is handig wanneer het gewenste eiwit schadelijk is voor de gastheercel of de celgroei belemmert.

Je kunt de cellen eerst laten groeien en daarna de eiwitproductie stimuleren.

Waarom wordt cDNA gebruikt voor de productie van humane eiwitten en hoe wordt het verkregen?

cDNA is DNA dat wordt gemaakt op basis van rijp mRNA en daardoor geen introns bevat.

Stappen:

1. Verkrijg het rijpe mRNA van het gewenste gen.

2. Gebruik reverse transcriptase om cDNA te maken.

3. Vermeerder het gewenste DNA-fragment eventueel met PCR.

4. Plaats het cDNA in een expressievector.

Dit is vooral belangrijk bij bacteriële expressie, omdat bacteriën normaal geen humane introns kunnen verwijderen.

Tegenwoordig kan de coderende DNA-sequentie ook direct synthetisch worden gemaakt.

Hoe wordt een gewenst gen in een expressievector geplaatst en vervolgens in een gastheercel gebracht?

1. Het gewenste DNA-fragment en de vector worden geschikt gemaakt voor koppeling, bijvoorbeeld met restrictie-enzymen.

2. Het DNA-fragment wordt met DNA-ligase in de vector geplaatst.

3. De vector wordt ingebracht in een gastheercel.

4. Cellen met het gewenste DNA worden geselecteerd.

5. Het gen wordt tot expressie gebracht.

DNA kan in cellen worden gebracht via bijvoorbeeld transformatie, transfectie of virale transductie.

Wat is het verschil tussen transformatie, transfectie en transductie?

Transformatie: opname van vrij DNA door een cel, vooral gebruikt als term bij bacteriën.

Transfectie: kunstmatig inbrengen van DNA of RNA in eukaryotische cellen, bijvoorbeeld via lipiden of elektroporatie.

Transductie: overdracht van genetisch materiaal via een virus of virale vector.

De geschikte methode hangt af van het type gastheercel.

Waarom kunnen een signaalsequentie en een His-tag nuttig zijn bij de productie van recombinante eiwitten?

Signaalsequentie:

• Stuurt het eiwit naar een bepaalde locatie.

• Bij eukaryoten kan een ER-signaalsequentie het eiwit naar het secretiepad leiden.

• Uitscheiding in het kweekmedium kan de zuivering vereenvoudigen.

His-tag:

• Een korte reeks histidines die aan het eiwit wordt gekoppeld.

• Bindt aan metaalionen, bijvoorbeeld Ni²⁺, op een chromatografiekolom.

• Maakt specifieke zuivering via IMAC mogelijk.

Welke stappen worden doorlopen bij het selecteren van een geschikte productiecellijn?

1. Transfectie: het gewenste DNA in de cellen brengen.

2. Selectie: cellen selecteren die het DNA bevatten.

3. Single-cell cloning: individuele cellen laten uitgroeien tot klonen.

4. Clone evaluation: klonen beoordelen op opbrengst, kwaliteit en stabiliteit.

5. Expansie: de beste kloon opkweken.

6. Cell banking: de geselecteerde cellijn langdurig bewaren.

Een Master Cell Bank (MCB) is de oorspronkelijke voorraad; een Working Cell Bank (WCB) wordt daarvan afgeleid voor routinematige productie.

Een plasmide bevat een ori, antibioticumresistentiegen en een humaan gen. Waarom is dit niet automatisch geschikt voor eiwitproductie in E. coli?

Omdat de ori en selectiemarker vooral zorgen voor replicatie en selectie.

Voor eiwitproductie zijn ook een geschikte bacteriële promotor, RBS, coderende DNA-sequentie en transcriptieterminator nodig.

Bovendien moet het humane gen geschikt zijn voor bacteriële expressie, bijvoorbeeld door gebruik van intronvrij cDNA.

Met welke factoren moet je rekening houden bij het kiezen van een expressiehost?

• Complexiteit en grootte van het eiwit.

• Noodzaak van glycosylering en andere modificaties.

• Correcte vouwing en disulfidebrugvorming.

• Oplosbaarheid en biologische activiteit.

• Gewenste opbrengst.

• Productiekosten en groeisnelheid.

• Mogelijkheid tot eiwituitscheiding.

• Productkwaliteit en veiligheid.

Belangrijk: De goedkoopste of snelst groeiende gastheer is niet automatisch de beste keuze. Het eiwit moet vooral correct functioneren.

Vergelijk E. coli, gist, insectencellen en zoogdiercellen als expressiehosts.

Host	Voordelen	Nadelen
E. coli	Snel, goedkoop, genetisch eenvoudig	Geen normale complexe humane glycosylering; risico op inclusion bodies en endotoxinen
Gist	Relatief snel en goedkoop; eukaryotische vouwing en uitscheiding mogelijk	Afwijkende glycosylering
Insectencellen	Geschikt voor complexe eiwitten, disulfidebruggen en bepaalde PTM's	Glycosylering wijkt af van humane patronen
Zoogdiercellen (CHO)	Complexe vouwing en geschikte glycosylering mogelijk	Duur, langzaam, complexe kweek

Wat zijn posttranslationele modificaties, en waarom is vooral glycosylering belangrijk bij eiwitgeneesmiddelen?

Posttranslationele modificaties zijn chemische veranderingen aan eiwitten tijdens of na de synthese.

Glycosylering is het toevoegen van suikergroepen aan een eiwit:

• N-glycosylering: aan asparagine.

• O-glycosylering: meestal aan serine of threonine.

Glycosylering kan de vouwing, stabiliteit, biologische activiteit en immunogeniciteit beïnvloeden.

De glycosyleringspatronen verschillen tussen organismen; daarom zijn zoogdiercellen vaak geschikt voor complexe therapeutische glycoproteïnen.

Waarom zijn correcte eiwitvouwing en disulfidebruggen belangrijk bij de productie van therapeutische eiwitten?

De juiste driedimensionale structuur is noodzakelijk voor de biologische functie van een eiwit.

Disulfidebruggen zijn covalente bindingen tussen cysteïneresiduen die de structuur helpen stabiliseren.

Verkeerde vouwing of onjuiste disulfidebrugvorming kan leiden tot:

• Verlies van activiteit.

• Aggregatie.

• Lagere oplosbaarheid.

• Een ongeschikt geneesmiddel.

Eukaryotische cellen ondersteunen complexe vouwing onder andere via het ER.

Wat is de functie van het ER en Golgi-apparaat bij de productie van uitgescheiden eiwitten?

Endoplasmatisch reticulum (ER):

• Het groeiende eiwit kan via een signaalsequentie en SRP naar het ER worden geleid.

• Eiwitvouwing en disulfidebrugvorming vinden er plaats.

• N-glycosylering begint er.

Golgi-apparaat:

• Suikergroepen worden verder bewerkt.

• Eiwitten worden gesorteerd en vervoerd.

Vervolgens kunnen de eiwitten via exocytose worden uitgescheiden.

Welke expressiehost kies je voor insuline, EPO, factor VIII en een volledig IgG-antilichaam?

Therapeutisch eiwit	Geschikte host	Waarom?
Insuline	E. coli	Klein eiwit; geen glycosylering nodig
EPO	CHO-cellen	Glycosylering belangrijk voor werking en verblijfsduur
Factor VIII	Zoogdiercellen	Groot, complex glycoproteïne
Volledig IgG	CHO-cellen	Complexe assemblage, disulfidebruggen en glycosylering

Bij insuline moet de precursor wel correct worden verwerkt en moeten de disulfidebruggen goed gevormd worden.

Wat zijn inclusion bodies en waarom vormen ze een uitdaging bij bacteriële eiwitproductie?

Inclusion bodies zijn ophopingen van onoplosbare, vaak verkeerd gevouwen recombinante eiwitten.

Om bruikbaar eiwit te verkrijgen moet je meestal:

1. De inclusion bodies isoleren.

2. Het eiwit oplossen.

3. Het eiwit opnieuw correct vouwen (refolding).

4. Het eiwit zuiveren en de activiteit controleren.

Dit kan leiden tot extra zuiveringsstappen en productverlies.

Waarom kan extracellulaire eiwitproductie gunstiger zijn dan intracellulaire productie?

Extracellulair: het eiwit wordt uitgescheiden in het kweekmedium. Je kunt cellen verwijderen en daarna direct verder zuiveren.

Intracellulair: het eiwit blijft in de cel. Meestal is cell lysis nodig, waardoor ook andere intracellulaire eiwitten, DNA en celbestanddelen vrijkomen.

Extracellulaire productie vereenvoudigt daardoor vaak de eerste isolatie- en zuiveringsstappen.

Een onderzoeker produceert een humaan glycoproteïne in E. coli. De aminozuursequentie is correct, maar het eiwit werkt nauwelijks. Wat kan de oorzaak zijn en wat zou je veranderen?

Mogelijke oorzaken zijn:

• Ontbrekende glycosylering.

• Onjuiste eiwitvouwing.

• Verkeerde disulfidebrugvorming.

• Aggregatie.

Een mogelijke oplossing is een geschikte eukaryotische host gebruiken, bijvoorbeeld CHO-cellen.

Daarna moet je controleren of de structuur, glycosylering en biologische activiteit goed zijn.

Wat zijn de belangrijkste stappen van een eiwitzuiveringsproces?

1. Isolatie/voorzuivering: cellen of celresten verwijderen, eventueel cellen openbreken en het eiwitmengsel voorbereiden.

2. Capture: gewenst eiwit opvangen en vaak concentreren.

3. Intermediate purification: grootste deel van de resterende verontreinigingen verwijderen.

4. Polishing: laatste ongewenste eiwitten, aggregaten en productvarianten verwijderen.

Mogelijke verontreinigingen zijn andere eiwitten, DNA, RNA, celresten, endotoxinen en virale verontreinigingen.

Waarvoor worden centrifugatie en filtratie gebruikt bij de voorzuivering van eiwitten?

Centrifugatie: scheidt cellen en celresten van de vloeistof.

Filtratie: verwijdert deeltjes uit de vloeistof.

Waarvoor worden ultrafiltratie en diafiltratie gebruikt bij de voorzuivering van eiwitten?

Ultrafiltratie: concentreert het gewenste eiwit.

Diafiltratie: vervangt de buffer waarin het eiwit zich bevindt.

Waarvoor worden ontzouting en zoutprecipitatie gebruikt bij de voorzuivering van eiwitten?

Ontzouting: verwijdert kleine opgeloste stoffen, zoals zouten.

Zoutprecipitatie: scheidt eiwitfracties op basis van verschillen in oplosbaarheid.

Wat is het principe van affiniteitschromatografie en hoe verloopt deze techniek?

Affiniteitschromatografie scheidt eiwitten op basis van specifieke binding aan een ligand op de kolom.

Stappen:

1. Loading: het gewenste eiwit bindt aan de ligand.

2. Washing: niet-gebonden stoffen worden verwijderd.

3. Elution: de binding wordt verzwakt, zodat het eiwit vrijkomt.

Voorbeelden:

• Protein A bindt aan veel IgG-antilichamen; elutie vaak bij lage pH.

• IMAC bindt aan His-tags via metaalionen; elutie bijvoorbeeld met imidazol.

Dit is vaak een geschikte capture-techniek.

Hoe werkt ionenwisselingschromatografie (IEX) en wat bepaalt of een eiwit bindt?

IEX scheidt eiwitten op basis van hun elektrische lading.

De kolom bevat geladen groepen die tegengesteld geladen eiwitten aantrekken.

• Loading: eiwit bindt onder geschikte pH- en zoutomstandigheden.

• Washing: niet-gebonden verontreinigingen worden weggespoeld.

• Elution: bijvoorbeeld door de zoutconcentratie te verhogen of de pH te veranderen.

De binding hangt af van de lading van het eiwit, de pH, zoutconcentratie en kolomhars.

Wat is het iso-elektrisch punt (pI), hoe beïnvloedt pH de eiwitlading en wanneer gebruik je AEX of CEX?

Het pI is de pH waarbij een eiwit gemiddeld een nettolading van nul heeft.

Omstandigheid	Nettolading	Mogelijke kolom
pH lager dan pI	Positief	CEX
pH gelijk aan pI	Gemiddeld nul	Binding vaak minder gunstig
pH hoger dan pI	Negatief	AEX

• CEX: negatief geladen hars bindt positief geladen eiwitten.

• AEX: positief geladen hars bindt negatief geladen eiwitten.

Rond de pI kan de oplosbaarheid lager zijn en kunnen eiwitten gemakkelijker aggregeren.

Hoe werkt size-exclusion chromatografie (SEC) en waarvoor wordt deze techniek gebruikt?

SEC scheidt eiwitten op basis van hun hydrodynamische grootte met behulp van poreuze geldeeltjes.

• Grote eiwitten gaan minder diep in de poriën en elueren meestal eerst.

• Kleine eiwitten gaan dieper in de poriën en elueren later.

SEC kan onder andere worden gebruikt om aggregaten van monomeren te scheiden.

Het wordt vaak gebruikt bij polishing. Nadelen zijn de beperkte monstercapaciteit en verdunning van het product.

Onthouden: groot eerst, klein laatst.

Hoe werkt hydrophobic interaction chromatography (HIC)?

HIC scheidt eiwitten op basis van verschillen in hydrofobiciteit.

• De kolom bevat hydrofobe groepen.

• Bij een relatief hoge zoutconcentratie worden hydrofobe interacties vaak versterkt, waardoor eiwitten kunnen binden.

• Bij het verlagen van de zoutconcentratie worden deze interacties zwakker en elueren de eiwitten.

Minder hydrofobe eiwitten komen doorgaans eerder los dan sterker hydrofobe eiwitten.

Wat is het verschil tussen affiniteitschromatografie, IEX, SEC en HIC, en waar gebruik je ze voor?

Techniek	Scheidingsprincipe	Veelgebruikte toepassing
Affiniteit	Specifieke ligandbinding	Capture
IEX	Elektrische lading	Intermediate purification of polishing
SEC	Hydrodynamische grootte	Polishing, aggregaten verwijderen
HIC	Hydrofobiciteit	Aanvullende zuivering

Door verschillende scheidingsprincipes te combineren kun je verontreinigingen verwijderen die met één techniek moeilijk te scheiden zijn.

Hoe kun je een chromatografische zuivering optimaliseren om opbrengst en zuiverheid te verbeteren?

• Slechte binding: pH, zoutconcentratie of kolommateriaal aanpassen.

• Productverlies tijdens wassen: minder strenge wasomstandigheden gebruiken.

• Onvolledige elutie: elutiebuffer optimaliseren.

• Overbelaste kolom: minder monster laden of kolomcapaciteit verhogen.

• Slechte scheiding: gradiënt, pH, stroomsnelheid of kolombelasting aanpassen.

• Denaturatie/aggregatie: mildere omstandigheden kiezen en stabiliteit controleren.

Optimalisatie moet rekening houden met zowel zuiverheid, opbrengst als biologische activiteit.

Wat is het verschil tussen opbrengst en zuiverheid, en hoe bereken je beide?

Opbrengst: welk percentage van het gewenste eiwit is behouden?

Opbrengst = ((gewenst eiwit na) / (gewenst eiwit voor)) * 100%

Zuiverheid: welk percentage van de totale eiwitmassa is het gewenste eiwit?

Zuiverheid = ((gewenst eiwit) / (totaal eiwit)) * 100%

Voorbeeld: begin met 100 mg gewenst eiwit. Na zuivering heb je 80 mg gewenst eiwit en 20 mg andere eiwitten.

• Opbrengst: 80%.

• Zuiverheid: 80%.

Deze percentages beschrijven verschillende eigenschappen.

Waarvoor gebruik je SDS-PAGE bij de kwaliteitscontrole van eiwitten?

SDS-PAGE wordt gebruikt om de molecuulmassa en mogelijke verontreinigingen van eiwitten te controleren.

• SDS: ontvouwt eiwitten en geeft ze een ongeveer uniforme negatieve lading per massa-eenheid.

• Reducerende SDS-PAGE: verbreekt ook disulfidebruggen, bijvoorbeeld met DTT.

Hoe kun je de eiwitconcentratie bepalen met UV A280 en de BCA-assay?

UV A280: meet de absorptie van eiwitten bij 280 nm, vooral door tryptofaan en tyrosine.

BCA-assay: bepaalt de eiwitconcentratie via een paarse kleurreactie die bij 562 nm wordt gemeten.

Waarvoor wordt massaspectrometrie gebruikt bij de kwaliteitscontrole van eiwitten?

Massaspectrometrie wordt gebruikt om de identiteit van een eiwit te controleren.

Hiermee kun je informatie verkrijgen over de aminozuursequentie en bepaalde posttranslationele modificaties (PTM's), zoals glycosylering.

Waarom moet je naast de zuiverheid ook de biologische activiteit van een eiwit controleren?

Omdat een eiwit zuiver kan zijn, maar toch niet goed functioneert, bijvoorbeeld door verkeerde vouwing of beschadiging.

Met een activiteitstest controleer je of het eiwit zijn gewenste biologische functie uitvoert.

Je moet een nieuw therapeutisch eiwit produceren. Hoe bepaal je welke expressiehost het meest geschikt is?

Onderzoek eerst welke eigenschappen essentieel zijn voor de biologische functie:

1. Heeft het eiwit glycosylering nodig?

2. Hoe complex is de vouwing?

3. Zijn disulfidebruggen belangrijk?

4. Moet het eiwit uitgescheiden worden?

5. Welke opbrengst, kwaliteit en kosten zijn acceptabel?

Een eenvoudig eiwit zonder glycosylering kan geschikt zijn voor E. coli. Een complex humaan glycoproteïne is vaak beter geschikt voor zoogdiercellen.

Onderbouw je keuze altijd met de eigenschappen van het eiwit.

Je produceert een therapeutisch IgG-antilichaam in CHO-cellen. Hoe ontwerp je een geschikt zuiveringsproces?

1. Verwijder de CHO-cellen en celresten uit het kweekmedium.

2. Gebruik bijvoorbeeld Protein A-affiniteitschromatografie om het IgG op te vangen.

3. Gebruik IEX voor verwijdering van resterende verontreinigingen en bepaalde eiwitvarianten.

4. Gebruik een passende polishing-stap om de gewenste eindzuiverheid te bereiken.

5. Controleer zuiverheid, opbrengst, identiteit, aggregaten en activiteit.

Voor therapeutische productie zijn daarnaast geschikte verwijderings- en veiligheidsstappen nodig, bijvoorbeeld voor virussen.

Je begint met 200 mg gewenst eiwit. Na capture heb je 160 mg en na polishing 120 mg. Wat is de totale opbrengst en wat is de opbrengst van de polishing-stap?

Totale opbrengst = (120 / 200) * 100% = 60%

Opbrengst polishing = (120 / 160) *100% = 75%

Dus:

• Totale opbrengst: 60%.

• Opbrengst polishing: 75%.

Bij elke stap kan gewenst eiwit verloren gaan.

Proces A heeft een opbrengst van 90% en een zuiverheid van 75%. Proces B heeft een opbrengst van 65% en een zuiverheid van 99%. Welk proces kies je en waarom?

Dat hangt af van de vereiste eindkwaliteit en de plaats van de stap in het proces.

• Proces A: meer gewenst eiwit behouden, maar meer verontreinigingen.

• Proces B: hogere zuiverheid, maar meer verlies van gewenst eiwit.

Voor een vroege capture-stap kan A interessant zijn, als de verontreinigingen later verwijderd kunnen worden.

Voor een eindzuivering kan B geschikter zijn als de hoge zuiverheid noodzakelijk is.

De beste keuze voldoet aan de kwaliteitseisen met een acceptabele opbrengst en behoud van activiteit.

Beschrijf hoe je van een humaan gen tot een zuiver, biologisch actief recombinant therapeutisch eiwit komt.

• Verkrijg de gewenste coderende DNA-sequentie, bijvoorbeeld cDNA.

• Plaats deze in een geschikte expressievector met passende regulerende elementen.

• Kies een expressiehost op basis van de vereiste eiwitvouwing, PTM's en productiekwaliteit.

• Breng de vector in de gastheercel.

• Selecteer een geschikte productiecellijn.

• Produceer het eiwit onder gecontroleerde kweekomstandigheden, bijvoorbeeld in een bioreactor.

• Isoleer het eiwit uit de cellen of het kweekmedium.

• Zuiver het eiwit met passende chromatografietechnieken.

• Controleer opbrengst, zuiverheid, identiteit, structuur en biologische activiteit.

Hoe ontwerp je een forward- en reverseprimer voor het amplificeren van een DNA-sequentie?

• Forwardprimer: neem een geschikte sequentie aan het 5'-begin van de gegeven DNA-streng.

• Reverseprimer: neem een geschikte sequentie aan het 3'-einde en bepaal hiervan de reverse complement.

Beide primers worden altijd van 5' naar 3' genoteerd.

Bij het ontwerpen controleer je ook onder andere primerlengte, smelttemperatuur en ongewenste secundaire structuren.

Waarom en hoe voeg je restrictiesites toe aan PCR-primers voor het kloneren van een gen?

Restrictiesites worden toegevoegd zodat het PCR-product en de expressievector met geschikte restrictie-enzymen kunnen worden geknipt.

Bijvoorbeeld:

• Forwardprimer: BamHI-site (GGATCC) aan het 5'-uiteinde.

• Reverseprimer: EcoRI-site (GAATTC) aan het 5'-uiteinde.

Door twee verschillende restrictiesites te gebruiken, kan het gen in de gewenste oriëntatie worden ingebouwd (directional cloning).

In de praktijk zijn vaak extra nucleotiden vóór de restrictiesite nodig voor efficiënt knippen.

Je ziet een plasmidekaart met een CMV-promotor, Kozak-sequentie, NeoR, AmpR en T7-promotor. Wat kun je hieruit afleiden?

• CMV-promotor + Kozak-sequentie: geschikt voor expressie in veel zoogdiercellen.

• NeoR: kan worden gebruikt voor selectie in zoogdiercellen.

• AmpR: maakt selectie van plasmidedragende bacteriën mogelijk.

• T7-promotor: kan worden gebruikt in een systeem met T7-RNA-polymerase.

Conclusie: De vector heeft onderdelen voor gebruik in verschillende systemen. Voor volledige functionaliteit moet je ook controleren of geschikte replicatie- en RNA-verwerkingselementen aanwezig zijn.

Welke expressiehost kies je voor humaan interferon alfa-2b en waarom?

E. coli is geschikt.

Interferon alfa-2b is een relatief klein eiwit waarvoor glycosylering niet noodzakelijk is voor de gewenste activiteit.

E. coli groeit snel, is goedkoop en kan veel eiwit produceren.

Aandachtspunt: Controleer of het eiwit correct is gevouwen en biologisch actief is.

Waarom is Pichia pastoris een geschikte expressiehost voor ocriplasmine?

Ocriplasmine is een recombinant enzym dat een correcte 3D-structuur nodig heeft.

Pichia pastoris (tegenwoordig ook Komagataella phaffii genoemd) is geschikt omdat deze gist:

• Eukaryotische eiwitvouwing ondersteunt.

• Disulfidebruggen kan vormen.

• Relatief snel groeit.

• Eiwitten kan uitscheiden, wat de zuivering vergemakkelijkt.

Hierdoor combineert gist relatief goedkope productie met de mogelijkheid om complexere eiwitten te maken.

Waarom kunnen Sf9-insectencellen geschikt zijn voor het produceren van recombinant HPV-L1-eiwit?

Het HPV-L1-eiwit is een capside-eiwit dat zich kan samenstellen tot virusachtige deeltjes (virus-like particles, VLP's).

Sf9-insectencellen kunnen met behulp van een baculovirusexpressiesysteem worden gebruikt om dit eiwit te produceren.

De gevormde VLP's lijken qua structuur op het virus, maar bevatten geen viraal genoom en zijn daardoor niet infectieus.

Dit maakt ze geschikt voor bepaalde vaccintoepassingen.

Hoe kun je de productie van een recombinant eiwit verhogen zonder de kwaliteit te verliezen?

Je kunt onder andere:

• Een geschikte sterke promotor gebruiken.

• De coderende sequentie optimaliseren voor het codongebruik van de host.

• Temperatuur, pH, zuurstof en voedingsstoffen optimaliseren.

• Het inductietijdstip aanpassen bij een induceerbare promotor.

Belangrijk: Controleer of een hogere expressie niet leidt tot verkeerde vouwing, aggregatie of verminderde activiteit.

Hoe werkt dialyse en wanneer gebruik je het tijdens eiwitzuivering?

Dialyse gebruikt een semipermeabel membraan dat kleine opgeloste stoffen doorlaat, terwijl grotere eiwitten achterblijven.

Je gebruikt dialyse om:

• Overtollig zout te verwijderen.

• De buffer te vervangen.

• Een monster voor te bereiden op de volgende zuiveringsstap.

Nadeel: Dialyse is relatief langzaam en scheidt verschillende eiwitten nauwelijks van elkaar.

Hoe werkt eiwitprecipitatie met ammoniumsulfaat ((NH₄)₂SO₄) en wat is het belangrijkste nadeel?

Bij toevoeging van voldoende ammoniumsulfaat neemt de oplosbaarheid van veel eiwitten af (salting out).

Omdat eiwitten bij verschillende zoutconcentraties neerslaan, kunnen eiwitfracties worden gescheiden.

Voordelen: Goedkoop, geschikt voor grote volumes en kan eiwitten concentreren.

Nadelen: Weinig specifiek en het overtollige zout moet vaak vóór een volgende zuiveringsstap worden verwijderd.

Ontwerp een zuiveringsproces voor Anakinra (pI = 5,46; 17,3 kDa), geproduceerd in E. coli.

Een mogelijke strategie is:

1. Cellysis: Anakinra uit de bacteriën vrijmaken.

2. Centrifugatie: celresten verwijderen.

3. Anionenwisseling (AEX): kies bijvoorbeeld pH 7, zodat Anakinra netto negatief geladen is en aan de positief geladen hars kan binden.

4. Eventueel HIC: aanvullende verontreinigingen verwijderen.

5. SEC: aggregaten en andere eiwitvormen scheiden.

Controleer tussendoor de opbrengst en zuiverheid om te bepalen of alle stappen nodig zijn.

Ontwerp een zuiveringsproces voor Adalimumab (pI = 8,25; 148 kDa), geproduceerd in CHO-cellen.

Een mogelijke strategie is:

1. Centrifugatie/filtratie: CHO-cellen uit het kweekmedium verwijderen.

2. Protein A-affiniteit: het IgG-antilichaam specifiek isoleren.

3. Kationenwisseling (CEX): bijvoorbeeld bij pH 6,5, waarbij Adalimumab netto positief geladen is.

4. Eventueel AEX of HIC: aanvullende verontreinigingen verwijderen.

5. SEC: indien geschikt, aggregaten verwijderen.

De exacte omstandigheden moeten experimenteel worden geoptimaliseerd.

Hoe kun je aan SDS-PAGE-resultaten herkennen welke fracties afkomstig zijn van vroege en late zuiveringsstappen?

Vergelijk het aantal banden en hun molecuulmassa.

• Ruw eiwitmengsel: meestal veel verschillende banden.

• Na capture: het gewenste eiwit is sterker vertegenwoordigd, maar er kunnen nog andere banden zichtbaar zijn.

• Na intermediate purification: meestal minder verontreinigende banden.

• Na polishing: vaak voornamelijk de band van het gewenste eiwit.

Let op: Met SDS-PAGE alleen kun je meestal niet met zekerheid vaststellen welke specifieke chromatografietechniek is gebruikt.

Je analyseert gezuiverd Adalimumab met SDS-PAGE en ziet banden rond 150 en 75 kDa. Hoe interpreteer je dit?

• 150 kDa: kan overeenkomen met het intacte antilichaam.

• 75 kDa: kan wijzen op een antilichaamfragment, gedeeltelijke dissociatie of afbraak.

Onder volledig reducerende omstandigheden verwacht je vooral zware ketens van ongeveer 50 kDa en lichte ketens van ongeveer 25 kDa.

De twee banden zijn dus reden voor aanvullend onderzoek naar de identiteit en intactheid van het eiwit.

Waarom moet je bij een BCA-assay een onbekende eiwitconcentratie bepalen binnen het lineaire gedeelte van de ijklijn?

Omdat in het lineaire gebied de absorbantie ongeveer evenredig is met de eiwitconcentratie.

Bij hogere concentraties kan de kleurreactie verzadigen, waardoor de concentratie minder nauwkeurig wordt bepaald.

Ook kunnen reducerende stoffen de BCA-reactie verstoren en een te hoge concentratie veroorzaken.

Conclusie: Gebruik een geschikte ijklijn en verdun het monster indien nodig.

Hoe bereken je een onbekende eiwitconcentratie met een lineaire BCA-ijklijn?

De vergelijking van de ijklijn is: A = a * C + b

Om de concentratie te berekenen, herschrijf je dit naar: C = (A - b) / a

Waarbij:

• A = gemeten absorbantie.

• a = helling.

• b = snijpunt met de y-as.

• C = eiwitconcentratie.

Voorbeeld uit je werkcollege: Bij een absorbantie van 0,68 wordt ongeveer 367 µg/mL gevonden met de gebruikte lineaire ijklijn.

Hoe bereken je de eiwitconcentratie in mg/mL uit een A280-meting?

Begin met de wet van Lambert-Beer: c = A / (e * l)

Hiermee bereken je de molaire concentratie in mol/L.

Om naar mg/mL om te rekenen: c(mg/mL) = (A / (e * l)) x MW

Hierbij is \(MW\) de molecuulmassa in g/mol.

Belangrijk: Je hebt de extinctiecoëfficiënt en molecuulmassa van het juiste eiwit nodig. Deze kunnen bijvoorbeeld via UniProt en ProtParam worden bepaald of voorspeld.

Hoe interpreteer je meerdere pieken in een SEC-chromatogram van een gezuiverd eiwit?

Bij een normale SEC-scheiding:

• Vroege pieken: grotere componenten, mogelijk aggregaten.

• Hoofdpiek: mogelijk het gewenste eiwit.

• Late pieken: kleinere eiwitten, fragmenten of andere componenten.

Meerdere pieken kunnen wijzen op een heterogeen preparaat.

Belangrijk: Met de piekpositie alleen kun je de identiteit van een component niet met zekerheid vaststellen. Daarvoor zijn standaarden of aanvullende analyses nodig.

Waarop moet je letten wanneer je een SEC-kolom kiest voor de analyse van een eiwit?

Controleer:

• Scheidingsbereik: valt de hydrodynamische grootte van het eiwit binnen het geschikte bereik?

• Monsterkwaliteit: is het monster helder, opgelost en vrij van deeltjes?

• Buffer: is deze geschikt voor de kolom en de eiwitstabiliteit?

• Monstervolume: past dit bij de gewenste scheidingsresolutie?

Een eiwit dat te groot is voor de poriën kan rond het void volume elueren. Een zeer klein molecuul kan bijna alle poriën binnengaan en daardoor laat elueren.

De specifieke eisen zijn afhankelijk van de gebruikte kolom.

Waarom worden diermodellen gebruikt voor onderzoek naar humane ziekten?

Diermodellen helpen om ziekteprocessen, genetische oorzaken en mogelijke behandelingen te onderzoeken.

Bij dieren kun je bijvoorbeeld ziekteontwikkeling in een volledig organisme bestuderen, inclusief de interacties tussen organen en het immuunsysteem.

Beperking: Dieren verschillen biologisch van mensen. Resultaten zijn daarom niet altijd rechtstreeks vertaalbaar naar humane patiënten.

Wat is het verschil tussen een experimenteel diermodel en een spontaan ziek diermodel?

• Experimenteel diermodel: de ziekte of genetische verandering wordt bewust veroorzaakt, bijvoorbeeld in een genetisch gemodificeerde muis.

• Spontaan ziek diermodel: het dier ontwikkelt de ziekte van nature, zoals een Dobermann met DCM.

Spontane modellen kunnen de natuurlijke ziekteontwikkeling beter weerspiegelen, maar geven onderzoekers minder controle over de genetische achtergrond en het ontstaan van de ziekte.

Waarom zijn honden interessante genetische modellen voor humane erfelijke ziekten?

Door rasvorming en selectieve fokkerij hebben honden binnen één ras vaak relatief weinig genetische variatie.

Hierdoor kunnen bepaalde ziektevarianten binnen een ras vaker voorkomen en gemakkelijker worden opgespoord.

Bovendien ontwikkelen honden sommige ziekten spontaan, waardoor hun natuurlijke ziekteontwikkeling kan worden onderzocht.

Hoe beïnvloeden inteelt en selectie de bruikbaarheid van honden als genetisch ziektemodel?

Voordeel voor onderzoek: Door inteelt zijn dieren binnen een ras genetisch vergelijkbaar, waardoor erfelijke ziektevarianten soms gemakkelijker te vinden zijn.

Nadeel: Inteelt vergroot het risico op homozygotie van schadelijke recessieve varianten en vermindert de genetische diversiteit.

Een resultaat uit één ras is daardoor niet automatisch representatief voor andere hondenrassen of me

Waarom zijn veterinaire patiënten bruikbaar voor translationeel onderzoek?

Veterinaire patiënten, zoals honden en katten, ontwikkelen bepaalde ziekten spontaan en leven in een natuurlijke omgeving.

Hierdoor kun je de ziekteontwikkeling en mogelijke behandelingen onderzoeken onder omstandigheden die soms beter aansluiten bij menselijke patiënten dan kunstmatig opgewekte diermodellen.

Translationeel onderzoek probeert onderzoeksresultaten te vertalen naar de klinische praktijk.

Waarom is DCM bij de Dobermann een nuttig model voor onderzoek naar humane hartziekten?

Dobermanns hebben een verhoogd risico op dilated cardiomyopathy (DCM).

Ze kunnen al hartveranderingen ontwikkelen voordat duidelijke klachten ontstaan.

Door risicohonden jarenlang te volgen met bijvoorbeeld echocardiografie, Holterregistraties en bloedonderzoek, kun je vroege ziekteveranderingen en biomarkers onderzoeken.

Beperking: De genetische oorzaken van DCM kunnen verschillen tussen hondenpopulaties en mensen.

Waarom is één genetische variant vaak onvoldoende om een complex ziektebeeld te voorspellen?

Complexe aandoeningen worden vaak beïnvloed door meerdere genen en omgevingsfactoren.

Ook leeftijd en genetische achtergrond spelen een rol.

Bij DCM kan een jonge hond bijvoorbeeld nog gezond lijken, maar later alsnog ziek worden.

Daarom voorspelt één genetische variant niet altijd betrouwbaar of en wanneer de ziekte ontstaat.

Waarom kan een genetische associatie uit één dierenpopulatie niet zomaar worden toegepast op een andere populatie?

Omdat populaties kunnen verschillen in genetische achtergrond en de frequentie van risico-allelen.

Bijvoorbeeld: een genetische associatie met DCM kan bij Europese Dobermanns sterker zijn dan bij Noord-Amerikaanse Dobermanns.

Daarom moet een genetische test worden gevalideerd in de populatie waarin deze wordt gebruikt.

Welke voor- en nadelen hebben spontaan zieke honden vergeleken met genetisch gemodificeerde muizen bij onderzoek naar complexe ziekten?

Spontaan zieke honden:

• Voordeel: natuurlijke ziekteontwikkeling en genetische diversiteit tussen individuen.

• Nadeel: minder experimentele controle en vaak langduriger onderzoek.

Genetisch gemodificeerde muizen:

• Voordeel: specifieke genetische veranderingen kunnen gecontroleerd worden onderzocht.

• Nadeel: een genetisch vereenvoudigd model weerspiegelt niet altijd de complexiteit van humane ziekten.

De beste keuze hangt af van de onderzoeksvraag.

Wat is een transgeen of genetisch gemodificeerd diermodel?

Een dier waarvan het genetisch materiaal doelgericht is veranderd om een bepaalde genfunctie of ziekte te onderzoeken.

Dit kan bijvoorbeeld door een gen uit te schakelen, te veranderen of een extra gen in te brengen.

Hiermee kunnen onderzoekers bestuderen hoe genetische veranderingen bijdragen aan een ziektebeeld.

Wat is het verschil tussen een knockout-, knock-in- en conditioneel muismodel?

• Knockout (KO): een bepaald gen wordt uitgeschakeld.

• Knock-in (KI): een specifieke DNA-verandering of nieuwe sequentie wordt ingebracht op een gekozen plek in het genoom.

• Conditioneel model: een genetische verandering wordt alleen in specifieke cellen/weefsels of op een bepaald moment geactiveerd.

Onthouden: Knockout = uitschakelen, knock-in = gericht veranderen, conditioneel = gericht bepalen waar of wanneer.

Wanneer gebruik je een knockout-muis en wat is een belangrijke beperking?

Je gebruikt een knockout-muis om te onderzoeken wat er gebeurt als een bepaald gen niet functioneert.

Zo kun je bepalen of het gen belangrijk is voor een bepaalde biologische functie of ziekte.

Beperking: Het uitschakelen van een gen in het hele lichaam kan leiden tot ontwikkelingsproblemen of embryonale sterfte. Hierdoor kun je de functie van het gen op latere leeftijd soms niet onderzoeken.

Wanneer gebruik je een knock-in-muis en waarom kan deze geschikter zijn dan een knockout-muis?

Een knock-in-muis gebruik je wanneer je het effect van een specifieke genetische verandering wilt onderzoeken, bijvoorbeeld een ziekteveroorzakende mutatie bij mensen.

Bij een knockout ontbreekt de genfunctie, terwijl bij een knock-in het gen ook veranderd of afwijkend actief kan zijn.

Een knock-in kan daardoor een specifiek humaan ziektebeeld nauwkeuriger nabootsen.

Waarom gebruik je een conditioneel knockout-muismodel en hoe werkt het Cre-loxP-systeem?

Een conditionele knockout wordt gebruikt om een gen alleen in bepaalde cellen/weefsels of op een bepaald moment uit te schakelen.

Bij het Cre-loxP-systeem wordt het doelgen omgeven door loxP-sequenties. Het enzym Cre-recombinase kan het DNA tussen deze sequenties verwijderen.

Door Cre specifiek in een bepaald weefsel of op een gekozen moment actief te maken, wordt het gen gericht uitgeschakeld.

Dit helpt om effecten in andere weefsels of tijdens de embryonale ontwikkeling te vermijden.

Welk muismodel kies je voor de volgende onderzoeksvragen en waarom?

• Wat gebeurt er als gen X volledig ontbreekt? → Knockout.

• Wat is het effect van een specifieke humane mutatie in gen X? → Knock-in.

• Wat doet gen X uitsluitend in hartspiercellen? → Conditionele knockout.

• Wat gebeurt er als gen X pas op volwassen leeftijd wordt uitgeschakeld? → Induceerbaar conditioneel model.

De keuze hangt af van welk effect je precies wilt onderzoeken.

Wat zijn de belangrijkste beperkingen van transgene muismodellen bij complexe humane ziektebeelden?

• Muizen verschillen fysiologisch en genetisch van mensen.

• Complexe ziekten worden vaak door meerdere genen en omgevingsfactoren veroorzaakt.

• Eén gemodificeerd gen kan het volledige humane ziektebeeld niet nabootsen.

• Genetische achtergrond, leeftijd en geslacht kunnen resultaten beïnvloeden.

• Compensatiemechanismen kunnen het effect van een genetische verandering verminderen of veranderen.

Daarom moeten resultaten voorzichtig naar mensen worden vertaald.

Wat is somatische celkerntransplantatie (SCNT)?

SCNT (somatic cell nuclear transfer) is een techniek waarbij de kern van een lichaamscel (somatische cel) wordt overgebracht naar een eicel waarvan de eigen kern is verwijderd.

De eicel kan vervolgens worden geactiveerd en zich gaan delen.

Hiermee kan een embryo worden gevormd dat vrijwel hetzelfde kern-DNA heeft als de donor van de somatische cel.

Welke stappen worden doorlopen bij somatische celkerntransplantatie?

1. Neem een somatische cel van een donor.

2. Verwijder de kern uit een onbevruchte eicel (enucleatie).

3. Breng de somatische celkern in de ontkernde eicel.

4. Activeer de eicel, bijvoorbeeld met een elektrische of chemische prikkel.

5. De eicel begint zich te delen en kan een embryo vormen.

6. Afhankelijk van het doel wordt het embryo verder gekweekt of in een draagmoeder geplaatst.

Wat gebeurt er tijdens de herprogrammering van de somatische celkern bij SCNT?

De kern van een lichaamscel is gespecialiseerd en heeft een bepaald genexpressiepatroon.

Na transplantatie zorgen factoren in het cytoplasma van de eicel ervoor dat de genexpressie en epigenetische toestand van de kern worden veranderd.

Hierdoor kunnen genen die nodig zijn voor de embryonale ontwikkeling opnieuw actief worden en kan de kern weer een vroege ontwikkeling ondersteunen.

Welke rol spelen epigenetische veranderingen bij de herprogrammering tijdens SCNT?

Epigenetische modificaties bepalen mede welke genen actief of inactief zijn, zonder de DNA-sequentie te veranderen.

Tijdens SCNT moeten onder andere DNA-methylering en histonmodificaties worden aangepast.

Hierdoor kan het gespecialiseerde genexpressiepatroon van de somatische cel worden omgezet naar een patroon dat embryonale ontwikkeling ondersteunt.

Onvolledige epigenetische herprogrammering kan leiden tot ontwikkelingsproblemen.

Waarom heeft een dier dat via SCNT ontstaat niet volledig hetzelfde DNA als de donor van de somatische cel?

Het kern-DNA is in principe vrijwel gelijk aan dat van de somatische celdonor.

Maar de eicel levert doorgaans het mitochondriale DNA, dat afkomstig is van de eiceldonor.

Daarnaast kunnen epigenetische verschillen en mutaties ontstaan.

Daarom is een gekloond dier niet noodzakelijk volledig genetisch identiek en heeft het niet automatisch hetzelfde fenotype als de kerndonor.

Wat is het verschil tussen reproductief en therapeutisch kloneren met SCNT?

• Reproductief kloneren: het SCNT-embryo wordt in een draagmoeder geplaatst met als doel de geboorte van een nieuw dier.

• Therapeutisch kloneren: het SCNT-embryo wordt gebruikt om embryonale stamcellen te verkrijgen voor onderzoek en mogelijk toekomstige medische toepassingen.

Bij therapeutisch kloneren is de geboorte van een individu niet het doel.

Waarom heeft SCNT vaak een lage efficiëntie en welke problemen kunnen hierdoor ontstaan?

Omdat de somatische celkern niet altijd volledig wordt geherprogrammeerd.

Mogelijke gevolgen zijn:

• Embryonale sterfte.

• Miskramen.

• Afwijkende ontwikkeling van de placenta.

• Groei- en ontwikkelingsproblemen.

• Gezondheidsproblemen bij geboren dieren.

Ook zijn veel eicellen en soms meerdere draagmoeders nodig, wat belangrijke dierenwelzijnsvragen oproept.

Welke toepassingen heeft somatische celkerntransplantatie?

SCNT kan worden toegepast voor:

• Reproductief kloneren van dieren.

• Vermeerderen van dieren met waardevolle genetische eigenschappen.

• Onderzoek naar embryonale ontwikkeling en epigenetische herprogrammering.

• Verkrijgen van embryonale stamcellen voor onderzoek.

• Mogelijke ondersteuning van het behoud van bedreigde diersoorten.

Per toepassing moeten het verwachte nut en de risico's worden afgewogen.

Wat zijn de voordelen en nadelen van SCNT voor de veehouderij?

Voordelen:

• Waardevolle eigenschappen van fokdieren kunnen behouden worden.

• Genetisch waardevolle dieren kunnen worden vermeerderd.

Nadelen:

• Lage efficiëntie.

• Gezondheidsrisico's voor embryo's, nakomelingen en draagmoeders.

• Hoge kosten.

• Bij veelvuldig gebruik van dezelfde genetische lijnen kan de genetische diversiteit afnemen.

Het economisch voordeel moet dus worden afgewogen tegen dierenwelzijn en genetische diversiteit.

Wat is de mogelijke relevantie van SCNT voor het behoud van bedreigde diersoorten en welke beperkingen zijn er?

SCNT kan mogelijk helpen om genetisch materiaal van zeldzame dieren te behouden of te gebruiken voor het creëren van nakomelingen.

Beperkingen:

• Lage slagingskans.

• Mogelijk gebrek aan geschikte eicellen en draagmoeders.

• Risico's voor het dierenwelzijn.

• Het kloneren van een beperkt aantal individuen vergroot de genetische diversiteit niet automatisch.

Het beschermen van leefgebieden en bestaande populaties blijft daarom belangrijk.

Welke mogelijke voordelen en ethische bezwaren heeft therapeutisch kloneren via SCNT voor mensen?

Mogelijke voordelen:

• Onderzoek naar menselijke ziekten.

• Onderzoek naar celontwikkeling en herprogrammering.

• Mogelijkheid om patiëntspecifieke stamcellijnen te maken.

Ethische bezwaren:

• Gebruik en vernietiging van menselijke embryo's.

• Verkrijging van menselijke eicellen en mogelijke belasting van donoren.

• Risico op misbruik voor reproductief kloneren.

Daarom is de toepassing maatschappelijk en ethisch omstreden.

Welke gevolgen van SCNT moet je beoordelen voor dier, mens, milieu en samenleving?

• Dier: risico op mislukte zwangerschappen, afwijkingen en gezondheidsproblemen.

• Mens: mogelijke medische kennis en behandelingen, maar ook ethische bezwaren.

• Milieu: mogelijke bijdrage aan soortbehoud, maar risico op verminderde genetische diversiteit.

• Samenleving: hoge kosten, toegankelijkheid, wetgeving en maatschappelijke acceptatie.

Een toepassing is pas goed onderbouwd als het verwachte nut wordt afgewogen tegen deze gevolgen.

Een onderzoeker wil met SCNT een waardevol fokdier kloneren. Hoe beoordeel je of dit verantwoord is?

Onderzoek eerst het doel: welke voordelen biedt het gekloonde dier?

Weeg vervolgens af:

1. Dierenwelzijn: hoeveel dieren worden belast en welke gezondheidsrisico's zijn er?

2. Genetische diversiteit: leidt herhaald kloneren tot meer inteelt?

3. Economisch nut: wegen de voordelen op tegen de kosten?

4. Alternatieven: kan hetzelfde doel met reguliere fokkerij worden bereikt?

Conclusie: Alleen economische waarde is onvoldoende om de risico's van SCNT te rechtvaardigen.

Wat is het verschil tussen genetische modificatie en kloneren?

• Genetische modificatie: het DNA van een organisme wordt doelgericht veranderd, bijvoorbeeld door een gen toe te voegen, uit te schakelen of te wijzigen.

• Kloneren: het maken van genetisch (vrijwel) identieke kopieën van DNA, cellen of organismen.

Bij SCNT is het doel een kopie van het kern-DNA te verkrijgen, niet om de DNA-sequentie doelgericht te wijzigen.

Genetische modificatie en kloneren kunnen wel gecombineerd worden.

Wat is een overexpressiemuis en wanneer is dit model nuttig?

Een overexpressiemuis bevat een genetisch construct waardoor een bepaald gen in verhoogde mate tot expressie komt.

Hierdoor wordt extra eiwit geproduceerd.

Toepassing: Onderzoeken wat er gebeurt wanneer een eiwit meer aanwezig is dan normaal, bijvoorbeeld of dit de groei van tumoren beïnvloedt.

Beperking: Kunstmatig hoge eiwitniveaus komen niet altijd overeen met de menselijke ziektesituatie.

Hoe maak je een transgene muis met pronucleaire micro-injectie?

1. Maak een DNA-construct met het gewenste transgen.

2. Verzamel bevruchte muizeneicellen (zygotes).

3. Injecteer het DNA in een pronucleus.

4. Plaats de embryo's in een schijnzwangere draagmoeder.

5. Onderzoek de geboren muizen op aanwezigheid van het transgen.

6. Fok positieve muizen verder om een transgene lijn te verkrijgen.

Niet alle nakomelingen bevatten het transgen of brengen het daadwerkelijk tot expressie.

Waarom betekent de aanwezigheid van een transgen niet automatisch dat een muis het gewenste eiwit overproduceert?

De expressie kan afhangen van:

• De plaats waar het transgen in het DNA is geïntegreerd.

• Het aantal geïntegreerde kopieën.

• De activiteit van de promotor.

• Epigenetische onderdrukking van de expressie.

Daarom moet je zowel de aanwezigheid van het transgen als de daadwerkelijke RNA- of eiwitexpressie controleren.

Waarom worden genetisch gemodificeerde muizen gegenotypeerd en wat is het verschil tussen heterozygoot, homozygoot en mozaïek?

Genotypering wordt gebruikt om vast te stellen welke DNA-verandering een muis heeft.

• Heterozygoot: één van de twee allelen is veranderd.

• Homozygoot: beide allelen hebben de betreffende verandering.

• Mozaïek: niet alle cellen van het dier hebben dezelfde genetische verandering.

Dit is belangrijk omdat de genetische toestand invloed kan hebben op het fenotype en de betrouwbaarheid van het diermodel.

Hoe werkt CRISPR-Cas9 bij het gericht aanpassen van het DNA van muizen?

CRISPR-Cas9 bestaat uit twee belangrijke onderdelen:

• sgRNA: leidt Cas9 naar een specifieke DNA-sequentie.

• Cas9: knipt het DNA op de doelplaats en kan een dubbelstrengsbreuk veroorzaken.

Vervolgens probeert de cel de DNA-breuk te repareren.

Afhankelijk van de reparatieroute kan hierdoor een gen worden uitgeschakeld of een specifieke DNA-verandering worden aangebracht.

Wat is het verschil tussen NHEJ en HDR bij DNA-reparatie na CRISPR-Cas9?

NHEJ (Non-Homologous End Joining):

• Verbindt de DNA-uiteinden zonder homologe template.

• Kan kleine inserties of deleties veroorzaken.

• Wordt vaak gebruikt om een knockout te maken.

HDR (Homology-Directed Repair):

• Gebruikt homologe DNA-informatie, eventueel een aangeboden DNA-template.

• Maakt gerichte DNA-veranderingen mogelijk.

• Kan worden gebruikt voor een knock-in.

NHEJ veroorzaakt niet altijd een knockout en HDR is niet de enige mogelijke methode voor gerichte veranderingen.

Wat is het verschil tussen CRISPR-Cas9 in zygotes en conventionele gene targeting via embryonale

RISPR-Cas9:

• DNA wordt rechtstreeks aangepast in een zygote of vroeg embryo.

• Vaak sneller en minder arbeidsintensief.

• Kan leiden tot mozaïcisme of ongewenste veranderingen.

Conventionele gene targeting:

• DNA wordt eerst veranderd in embryonale stamcellen.

• Correct gemodificeerde stamcellen worden geselecteerd.

• Deze worden in een blastocyst gebracht om chimere muizen te maken.

Beide methoden kunnen genetisch gemodificeerde muizen opleveren.

Wat is een chimere muis en waarom is kiembaantransmissie belangrijk?

Een chimere muis bestaat uit cellen met verschillende genetische achtergronden, bijvoorbeeld afkomstig van een oorspronkelijke blastocyst en geïnjecteerde embryonale stamcellen.

Kiembaantransmissie betekent dat de genetisch aangepaste cellen bijdragen aan de geslachtscellen.

Dit is belangrijk omdat de gewenste DNA-verandering dan aan de nakomelingen kan worden doorgegeven.

Wat betekent het dat een gen 'floxed' is en waarom is dit nuttig?

Een floxed gen bevat twee loxP-sequenties rondom een gekozen DNA-fragment, bijvoorbeeld een belangrijk exon.

Zolang Cre-recombinase niet actief is, kan het gen normaal blijven functioneren.

Wanneer Cre actief wordt, kan het DNA tussen de loxP-sites worden verwijderd.

Dit maakt het mogelijk om een gen gericht uit te schakelen, bijvoorbeeld alleen in de lever.