Reakcja Łańcuchowa Polimerazy (PCR) i Enzymy w Biologii Molekularnej

Zestaw fiszek pojęciowych obejmujący zagadnienia techniki PCR (składniki, etapy, odmiany m.in. Nested, Multipleks, RT-PCR, RT-Q-PCR), enzymów restrykcyjnych oraz markerów molekularnych i metod analizy polimorfizmu DNA.

Substraty reakcji PCR

Komponenty niezbędne do przeprowadzenia reakcji amplifikacji DNA: matryca DNA, enzym (termostabilna polimeraza DNA), startery, dNTP (trifosforany nukleozydów), jony $Mg^{2+}$, bufor, woda oraz wzmacniacz reakcji.

Denaturacja (etap PCR)

Pierwszy etap cyklu reakcji PCR, polegający na rozdzieleniu podwójnej helisy matrycowego DNA na pojedyncze nici w temperaturze $95^\circ\text{C}$.

Hybrydyzacja / Annealing (etap PCR)

Etap cyklu reakcji PCR polegający na specyficznym przyłączaniu starterów (primerów) do matrycy DNA w obniżonej temperaturze wynoszącej $55\text{--}65^\circ\text{C}$.

Elongacja (etap PCR)

Etap wydłużania łańcucha DNA w reakcji PCR, w którym termostabilna polimeraza syntetyzuje nową nić komplementarną w optymalnej temperaturze wynoszącej $72^\circ\text{C}$.

Startery do PCR

Krótkie fragmenty jednoniciowego DNA o długości zwykle około $20$ nukleotydów. W reakcji stosuje się parę starterów komplementarnych do przeciwległych nici matrycy na obrzeżach powielanego fragmentu.

Rola jonów magnezu ($Mg^{2+}$) w PCR

Stanowią niezbędny kofaktor polimerazy warunkujący wiązanie enzymu do sekwencji prymującej (starter-matryca) oraz wydajną elongację. Zbyt małe stężenie obniża wydajność, natomiast nadmiar prowadzi do powstania niespecyficznych produktów i błędów wstawiania zasad.

dNTP (deoksyrybonukleotydotrifosforany)

Trifosforany deoksyrybonukleozydów wchodzące w skład mieszaniny reakcyjnej PCR oraz sekwencjonowania: dATP, dTTP, dGTP oraz dCTP.

Standardowa liczba cykli PCR

W typowej reakcji PCR powtarza się najczęściej około $40\text{--}45$ cykli amplifikacji.

Wektory genetyczne

Niewielkie cząsteczki DNA powszechnie stosowane w inżynierii genetycznej, zdolne do autonomicznej replikacji w komórce gospodarza po wprowadzeniu obcego DNA (np. plazmidy, bakteriofagi, kosmidy).

Kosmidy

Sztucznie utworzone wektory genetyczne będące hybrydą plazmidu oraz elementów DNA bakteriofaga.

Enzymy restrykcyjne (restryktazy)

Endonukleazy DNA pochodzące z komórek bakterii i sinic, przecinające cząsteczkę DNA w miejscach specyficznych sekwencji nukleotydowych w celu uzyskania ściśle zdefiniowanych fragmentów.

Podział enzymów restrykcyjnych według długości sekwencji

Klasyfikacja restryktaz na czwórkowe, szóstkowe oraz ósemkowe, odzwierciedlająca liczbę nukleotydów w sekwencji rozpoznawanej (np. szóstkowe rozpoznają sekwencję złożoną z $6$ nukleotydów).

Jednostka restrykcyjna

Ilość enzymu restrykcyjnego trawiąca kompletnie $1\,\mu\text{g}$ DNA faga lambda (o wielkości około $50\,\text{kb}$) w czasie $1$ godziny w temperaturze $37^\circ\text{C}$.

Izoschizomery

Enzymy restrykcyjne wyizolowane z odmiennych szczepów bakterii, które rozpoznają dokładnie tę samą sekwencję docelową w DNA.

Tępe końce DNA

Zakończenia podwójnej nici DNA powstałe po symetrycznym cięciu obu nici na tej samej wysokości, pozbawione niesparowanych, jednoniciowych nukleotydów.

Lepkie końce DNA

Końce DNA powstałe po niesymetrycznym przecięciu nici, posiadające wystające, jednoniciowe fragmenty (koniec $5'$ ma $2\text{--}6$ nukleotydów, a koniec $3'$ ma $2\text{--}4$ nukleotydy).

Markery molekularne

Sekwencje nukleotydowe niebędące genami, występujące w co najmniej dwóch allelach, których polimorfizm pozwala ustalać różnice genetyczne pomiędzy osobnikami; podlegają dziedziczeniu mendlowskiemu i są niezależne od czynników środowiska.

Marker genetyczny

Wskaźnik stanowiący genetycznie kontrolowaną cechę fenotypową lub dowolną różnicę genetyczną (np. fragment DNA, białko) ujawniającą polimorfizm osobniczy.

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych; metoda oparta na trawieniu amplifikowanego DNA enzymami restrykcyjnymi i rozdziale elektroforetycznym powstałych fragmentów o charakterystycznym wzorze prążkowym.

Przyczyny nieprawidłowego wzoru restrykcyjnego w RFLP

Świadczą o zajściu mutacji: uzyskanie o $1$ fragment za mało oznacza zniszczenie miejsca restrykcyjnego przez mutację, natomiast uzyskanie o $1$ fragment za dużo oznacza utworzenie nowego miejsca cięcia enzymu.

Podstawowe etapy kolumienkowej izolacji DNA

Procedura składająca się z czterech kroków: wstępne przygotowanie materiału, nałożenie preparatu na kolumnę, płukanie preparatu oraz wymywanie (elucja) kwasów nukleinowych.

Trudności w izolacji RNA w porównaniu z DNA

Znaczna wrażliwość RNA na degradację z powodu wszechobecnych, aktywnych i stabilnych rybonukleaz (RNaz), jak również wymóg usunięcia towarzyszącego DNA oraz innych frakcji RNA.

Metoda spektrofotometryczna w analizie kwasów nukleinowych

Technika wykorzystująca pochłanianie promieniowania przez cząsteczki DNA lub RNA w celu oceny ich stężenia, tożsamości oraz stopnia czystości próbki.

Metody przesiewowe PCR

Techniki laboratoryjne (np. PCR-SSCP, PCR-DGGE) umożliwiające wykrywanie mutacji poprzez ocenę zmian właściwości fizykochemicznych DNA wynikających z odmiennego składu zasad.

Polimeraza Taq

Wysoce termostabilna polimeraza DNA pierwotnie wyizolowana z bakterii termofilnych, nieulegająca denaturacji w wysokich temperaturach PCR.

RT-Q-PCR (Quantitative Real-Time PCR)

Ilościowa reakcja PCR monitorowana w czasie rzeczywistym poprzez pomiar narastającej fluorescencji, najczęściej z użyciem sondy molekularnej TaqMan zaopatrzonej w reporter na końcu $5'$ i wygaszacz na końcu $3'$.

Wewnętrzna / gniazdowa PCR (Nested PCR)

Modyfikacja reakcji PCR wykorzystująca dwie pary starterów: startery zewnętrzne do amplifikacji wstępnej oraz startery wewnętrzne w drugim etapie, co znacząco zwiększa swoistość i czułość oznaczenia.

PCR-SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)

Metoda badania polimorfizmu konformacji pojedynczej nici DNA; po denaturacji pojedyncze nici tworzą specyficzne struktury przestrzenne, przez co fragmenty ze zmutowaną sekwencją uzyskują odmienną ruchliwość elektroforetyczną w żelu.

ASA-PCR (Amplifikacja allelo-specyficzna)

Odmiana PCR służąca do detekcji polimorfizmów oraz mutacji punktowych za pomocą starterów zaprojektowanych tak, aby wybiórczo wydłużać tylko wariant prawidłowy lub zmutowany poza miejscami restrykcyjnymi.

RT-PCR (Reverse Transcription PCR)

Reakcja amplifikacji, w której matrycowy RNA jest uprzednio przepisywany na komplementarny DNA ($\text{cDNA}$) przez enzym odwrotną transkryptazę, a uzyskany produkt ulega dalszemu powielaniu w klasycznym PCR.

Multipleks PCR

Jednoczesna amplifikacja wielu różnych fragmentów DNA w jednej probówce reakcyjnej przy użyciu kilku par specyficznych starterów; brak powielenia konkretnego prążka świadczy o delecji genu.