prednáška 3- aminokyseliny, peptidy a proteíny I

1. Aminokyseliny 2. Peptidy a proteiny 3. Primární struktura proteinů 4. Sekundární struktura proteinů

Aký počet AMK sa nachádza v každom živom organizme?

20

Aké spoločné štrukturálne rysy majú všetky aminokyseliny?

• alfa uhlík a štyry substituenty

  • karboxxylová skupina, aminová skupina, atóm vodíka a postranná skupina R

• alfa uhlík je chirálnym centrom

• tvorí tetraéder

Aké stereoisoméry sú aminokyselinové zbytky v proteínoch?

L-stereoisoméry

Do akých skupín (klasifikácií) vieme rozdeliť AMK na základe R-skupiny?

• nepolárne, alifatické (7)

• aromatické (3)

• polárne, nenabité (5)

• kladne nabité (3)

• záporne nabité (2)

Ktoré AMK majú nepolárne, alifatické skupiny R + vlastnosť ?

• hydrofóbny efekt stabilizuje štruktúru bielkovín

• glycín G

• alanín A

• prolín P

• valín V

• leucín L

• isoleucín I

• methionín M

Ktoré AMK majú aromatické R-skupiny + vlastnosti?

• absorbujú UV žiarenie pri vlnovej dĺžke 270-280nm

• môžu prispievať k hydrofóbnemu efektu

• fenylalanín F

• tyrosín Y

• tryptofán W

Ktoré AMK majú polárne, nenabité R-skupiny + vlastnosti?

• môžu tvoriť vodíkové väzby

• cysteín môže tvoriť disulfidové väzby

• serín S

• threonín T

• cysteín C

• asparagín N

• glutamín Q

Aké funkcie majú neštandartné AMK?

• modifikácie bežných AMK

  • modifikované po syntéze bielkovín (napr 4-hydroxyprolín, ktorý sa vyskytuje v kolagéne)

  • behom syntézy bielkovín (napr pyrrolysin, ktorý prispieva k biosyntéze metánu)

  • dočasne modifikované za účelom zmeny funkcie bielkovín (napr fosforylácia)

• voľné metabolity (napr ornitín, medziprodukt v biosyntéze arginínu)

• selenocysteín, pyrrolysín, 4-hydroxyprolín, gama-karboxyglutamát

Ktoré AMK majú kladne a záporne nabité skupiny R + vlastnosti?

• majú pri pH 7 významný kladný/záporný náboj

• lysín K

• arginín R

• histidín H

• aspartát D

• glutamát E

Čo vzniká pri neutrálnom pH?

zwitterion

Čo všetko vieme povedať o titrácii aminokyselín?

• katión ⇌ zwitterion ⇌ anion

• -COOH má kyslé pKa₁

• -NH₃⁺ má zásadité pKa₂

• pH, pri ktorom je celkový elektrický náboj nulový, je izoelektrický bod (pI)

• alfa-karboxylová skupina je kyslejšia než u karboxylových kyselín

• alfa-aminová skupina je menej zásaditá než u amínov

Čo robia pufry?

zabraňujú zmenám pH v blízkosti pK_a

Čo vieme povedať o glycíne a jeho pufrovacích oblastiach?

• s centrom okolo hodnoty pK_a alfa-karboxylovej skupiny (pK₁ = 2,34)

• s centrom okolo pK_aalfa-aminoskupiny (pK₂ = 9,6)

Ako vypočítame izoelektrický bod u aminokyselín bez ionizovateľných postranných reťazcov?

• pH=pI → celkový náboj je nulový (AMK je vo vode najmenej rozpustná, v elektrickom poli nemigruje)

• pH > pI → celkový záporný náboj

• pH < pI → celkový kladný náboj

Aké vlastnosti majú ionizovateľné postranné reťazce AMK?

• majú pK_A hodnotu

• pôsobia ako pufry

• ovplyvňujú pI aminokyselín

• vieme titrovať (titračná krivka má 3 ionizačné stupne)

Ako sa vypočíta pI pri troch hodnotách pK?

• zoradíme jednotlivé hodnoty pK

• sledujeme, ako sa pri postupnej deprotonácii mení celkový náboj

• nájdeme elektroneutrálnu formu a spriemerujeme dve hodnoty pK, medzi ktorými sa táto forma nachádza

Aká je peptidová väzba, ako vzniká a ako sa rozpadá?

• je kovalentná

• vzniká kondenzáciou

• rozpadá sa hydrolýzou

Aké typy proteínov poznáme?

• dipeptid → 2 AMK, 1 peptidová väzba

• tripeptid → 3AMK, 2 peptidové väzby

• oligopeptid→ niekoľko AMK

• polypeptid → mnoho AMK, molekulová hmotnosť < 10kDa

• proteín → tisíce AMK, molekulová hmotnosť >10kDa

Od akého konca začína číslovanie (a pomenovanie) AMK?

začína od aminoterminálneho zbytku (N-koniec )

Čo všetko sa dá v peptidoch ionizovať?

• jedna voľná alfa-aminová skupina

• jedna voľná alfa-karboxylová skupina

• niekoľko skupín R

Čo je to multipodjednotkový proteín?

2 a viacej polypeptidov spojených nekovalentne

Aký je to oligomerný proteín?

• aspoň 2 identické podjednotky

• identické jednotky - protoméry

Ako vieme odhadnúť počet aminokyselinových zbytkov?

• počet zbytkov = molekulová hmotnosť/110

• priemerná molekulová hmotnosť AMK = ~128

• molekula vody odstránená pri tvorbe peptidovej väzby 128-18 = 110

Aké sú to konjugované proteíny a uveďte príklady?

• sú to proteíny, ktoré obsahujú trvalo viazané chemické zložky a neaminokyselinovú časť, nazývame prostetická skupina

Do akých 4 úrovní vieme rozdeliť štruktúru proteínov?

• primárna štruktúra → kovalentné väzby spojujúce AMK zbytky v polypeptidovom reťazci

• sekundárna štruktúra → opakujúce sa štrukturálne vzory

• terciárna štruktúra → 3D skladanie polypeptidu

• kvartérna štruktúra → 2 a viacej polypeptidových podjednotiek

Čo určuje sekvencia AMK?

určuje 3D štruktúra, ktorá určuje funkciu

Väčšina ľudských proteínov sú polymorfné, čo to znamená?

majú varianty AMK sekvencií

Čo je to Edmanova degradácia?

klasická metóda sekvenovania AMK (od N-konca)

Ako sa študujú štruktúry proteínov pomocou značenia?

FDNB, dansylchlorid, dabsylchlorid = značenie aminového konca alfa-aminoskupiny a ε-aminoskupiny lysínových zbytkov

Ako vieme študovať štruktúru pomocou rozbitia väzby?

oxidácia kyselinou permravenčou alebo redukcia dithiothreitolem = rozbitie disulfidovej väzby, denaturuje proteíny

Čo sú to proteázy?

enzýmy, ktoré katalyzujú hydrolýzu peptidových väzieb

Aké proteázy poznáme a aké majú miesta štiepenia?

Ako vieme všeobecne charakterizovať hmotnostnú spektrometriu?

• meria molekulovú hmotnosť s vysokou presnosťou

• umožňuje sekvenovať krátke AMK sekvencie (20 až 30 AMK zbytkov)

• dokáže zmapovať celý bunkový proteome

Aké sú obecné kroky hmotnostnej spektrometrie?

1. ionizácia analytu vo vákuu

2. uvedenie nabitých molekúl do elektrického a/alebo magnetického poľa

3. nabité molekuly sa pohybujp v závislosti na pomeru hmotnosti k náboju, m/z

4. odvodenie hmotnosti (m) analyzovanej látky

Čo všetko vieme povedať o MALDI MS?

• Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry

• proteíny umiestnenie v matrici pohlcujúce energiu svetla

• impulz laserového svetla ionizuje a desorbuje ich z matrice

• matrica obsahuje kryštalizované molekuly (kyselina sinapová, alfa-kyano-4-hydroxyškoricová alebo 2,5-dihydroxybenzoová)

Čo všetko vieme povedať o ESI MS?

• Elektrospray ionization mass spectrometry

• makromolekuly sú priamo premenené z kvapalnej do plynnej fázy

Aké metódy analýzy pomeru m/z poznáme?

• doba letu (Time of Flight, TOF)

  • zrýchlenie iónov v elektrickom poli závisí na m/z

• orbitrap

  • zachycuje ióny na obežnej dráhe, trajektória elektrónov je prevedená na m/z

Aká je to tandemová MS?

dva hmotnostné filtre v tandemu

Ako vieme získavať informácie pomocou tandemovej MS?

• prvá = triedi peptidy vzniknuté štiepením, druhá = mieria m/z pomery nabitých fragmentov

• LC-MS/MS = kvapalinová chromatografia - tandemová MS

1. chromatografia komplexnej zmesi peptidov

2. rozdelené peptidy, ktoré sú postupne identifikované MS

3. identifikácia proteínov a ich množstva

Aké informácie môže poskytnúť sekvencia AMK?

• 3D štruktúra

• funkcia

• bunková lokalizácia

• evolúcia

Čo ukazuje konsenzuálna sekvencia?

odráža najčastejšiu AMK na každej pozícii

Čo je to horizontálny prenos génov?

prenos génu alebo skupiny génov z jedného organizmu do druhého - neposkytuje vhodné kandidáti na štúdium evolúcie

Čo sú to homológy a ako ich delíme?

• sú to homológne proteíny - členovia proteínových rodín

  • paralógy - homológy v rámci rovnakého druhu

  • ortológy - homológy u rôznych druhov

  • identifikovanie porovnaním proteínových sekvencií s databázou

Čím sú štruktúry proteínov stabilizované?

nekovalentnými interakciami a silami

Čo je to konformácia?

termodynamicky najstabilnejšia, s najnižšou voľnou energiou (G)

Aké proteíny sú natívne?

proteíny v akejkoľvek funkčnej, zloženej konformácii

Ako vieme vysvetliť stabilitu proteínov?

tendencia proteínu udržovať natívnu konformáciu

Čo vieme povedať o van der Waalsových interakciách u konformácie proteínov?

• dipól-dipólové interakcie na krátke vzdialenosti

• jednotlivé interakcie prispievajú k celkovej stabilite proteínov len málo

• vysoký počet interakcií môže mať podstatný vplyv

Čo je to solvatačná vrstva?

• vysoko štruktúrovaná vrstva H₂O okolo hydrofóbnej molekuly

• zmenšuje sa, keď sa zhlukujú nepolárne skupiny

• tento pokles spôsobuje priaznivý nárast čistej entropie

Čo robia opakujúce sa sekundárne štruktúry?

optimalizujú vodíkové väzby

Čo vieme povedať o interakcii skupín s opačným nábojom?

• iónový pár = soľný mostík

• pevnosť sa zvyšuje v prostredí s nižšou dielektrickou konštantou ε

• polárne vodné rozpúšťadlo ε ~ 80

• nepolárne vnútro proteínu ε ~4

Prečo nemôžu peptidové väzby rotovať?

• 6 atómov v peptidovej skupine leží v jednej rovine

• čiastočný charakter dvojnej väzby peptidovej väzby C-N bráni rotácii a obmedzuje rozsah konformácie

Aké tri dihedrálne uhly poznáme u peptidov?

• φ (phi) - v rozmedzí od -180 do +180 stupňov

• ψ (psi) - v rozmedzí od -180 do +180 stupňov

• ω (omega) - +- 180 stupňov pre trans

Prečo sú niektoré konformácie zakázané?

kvôli stérickej interferencii = φ a ψ nemôžu byť obidve 0 stupňov

Čo popisuje sekundárna štruktúra proteínu?

popisuje priestorové usporiadanie atómu hlavného reťazca v úseku polypeptidového reťazca

Ako vyzerajú torzné uhly v pravidelnej sekundárnej štruktúre?

φ a ψ zostávajú v celom segmente rovnaké

Aké typy sekundárnych štruktúr poznáme?

• alfa šroubovice

• β konformace

• β ohyby

• náhodné smyčky

Ako vieme charakterizovať alfa šroubovici?

• najjednoduchšie usporiadanie s maximálnym počtom vodíkových väzieb

• hlavný reťazec je ovinutý okolo pomyselnej pozdĺžnej osi

• R-skupina vyčnieva z hlavného reťazca

• každá otočka = 3,6AMK, ∼5,4 Å

• zvýšený obsah Ala, Leu, Glu, Lys, Met

Čo všetko vieme povedať o Intrahelikálných vodíkových väzbách?

• medzi atómom vodíka viazaným na elektronegatívnym atóm dusíka zbytku n a elektronegatívnym karbonylovým atómom kyslíka zbytku n+4

• zaisťuje značnú stabilitu

• amfipatická šroubovica - hydrofóbne aminokyseliny v pozíciách n, n+3 alebo n+4

Ako a prečo sekvencia ovplyvňuje stabilitu alfa šroubovice?

• AMK zbytky majú prirodzenú tendenciu tvoriť α šroubovicu

• interakcie medzi reťazcami R, ktoré sú od seba vzdialené 3-4 zbytky, môžu stabilizovať alebo destabilizovať α šroubovicu

  • náboj, veľkosť a tvar reťazcov R môže destabilizovať

  • tvorba iónových párov a hydrofóbny efekt môžu stabilizovať

Čo spôsobuje prolín v α šroubovici a prečo?

• spôsobuje destabilizujúci zlom v šroubovici

• atóm dusíka je súčasťou rigidného pyrolového kruhu

• rotácia okolo N-Cα nie je možná

Ako sa glycín správa v α šroubovici?

má vysokú konformačnú flexibilitu, zaujíma špirálovú štruktúru

Ako zbytky v blízkosti konca α šroubovice ovplyvňujú stabilitu?

• malé elektrické dipóly v každej peptidovej väzbe sa vyrovnávajú prostredníctvom vodíkových väzieb

• záporne nabité AMK sa často vyskytujú v blízkosti NH³⁺konca

• kladne nabité AMK sa často vyskytujú v blízkosti COO^- konca

Ako vieme charakterizovať β konformáciu?

• hlavná kostrč sa rozprestiera do cik-cak tvaru

Aké dva základné typy β konformácie poznáme?

• β-reťazec = jediný proteínový segment

• β-list= niekoľko reťazcov v β konformácii vedľa seba

Ako vieme popísať antiparalélny a paralélny β list?

• antiparalélny - opačná orientácia, ktorá sa vyskytuje častejšia

• paralelný - rovnaká orientácia

  • medzi atómami kostrče susedných reťazcov sa tvoria vodíkové väzby

Ako vieme opísať β ohyby?

• bežné v proteínoch

• spájajú C-konce dvoch susedných segmentov antiparalelného β-listu

  • 180 stupňov otočenie

  • zahrňuje 4 zbytky

  • medzi prvým a štvrtým zbytkom sa vytvára vodíková väzba

  • často sa v β zlomoch vyskytuje Gly (zbytok 2) a Pro (zbytok 3)

Aké charakteristické torzné uhly majú sekundárne štruktúry?

torzné uhly φ(phi) a ψ (psi), ktoré sú spojené s každým zbytkom, popisujú sekundárnu štruktúru

Čo sú to Ramachandranove grafy?

• zobrazujú všetky φ a ψ uhly

• overujú možnosti trojrozmerných štruktúr proteínov

Ako vieme analyzovať sekundárne štruktúry?

• spektroskopia cirkulárneho dichroismu (CD)

  • meria elipticitu - rozidiely v molárnej absorpcii ľavotočivého a pravotočivého kruhovo polarizovateľného svetla

• chromofor = peptidová väzba