6) intracelulární transport

Dvě formy organizace chemických reakcí v buňce

• Soustředění enzymů ke katalýze určitého sledu reakcí do jednoho proteinového komplexu (ribozom, proteazom, spliceozom, apod.)

• Soustředění metabolických dějů do buněčných oddílů ohraničených membránou - organel

Výhody kompartmentalizace

• V buňkách probíhá mnoho protichůdných chemických procesů, jejich oddělení zabrání chaosu.

• Vytvoření vhodného chemického mikroprostředí pro daný typ chemických procesů (řeší pomalost difúze substrátů, obsah iontů, pH) – reakce probíhají snadněji a rychleji.

• Izolace potenciálně nebezpečných rozkladných dějů

  • Hydrolytické enzymy – lysosomy

  • Oxidativní enzymy – peroxisomy

• Dělba práce mezi organelami

Nevýhody kompartmentalizace

• Dělba práce má mnoho výhod, ale také různé nároky.

• Biosyntéza organel

• Nutnost koordinace

• Třídění proteinů pro různé destinace...

Membránové organely

• Prokaryotická buňka: bez specializovaných vnitřních oddílů – jediný oddíl obklopený membránou = cytosol

• Eukaryotická buňka: bohatě strukturována do samostatných oddílů s vyhraněnou funkcí

  • Vysoká organizace na podbuněčné úrovni

  • Další organizační (nadbuněčné) úrovně: buňky – tkáně – orgány – orgánové systémy - organismy

Cytoplazma x cytosol

• Cytoplazma: tekutina složená z cytosolu a organel (vše mezi plazmatickou membránou a jádrem)

• Cytosol: omezen plazmatickou membránou a vnějším povrchem organel

Evoluce organel

• Předchůdci prvních eukaryot: mikroorganismy podobné bakteriím (žádné vnitřní membrány)

• Plazmatická membrána zřejmě zajišťovala všechny membránové funkce (vč. syntézy ATP)

• Umožněno malou velikostí původních buněk

• Velké eukaryotické buňky jsou závislé na vnitřních membránách

Vznik/evoluce organel

• Membrány jádra, ER a Golgiho aparátu, endozomů a lysozomů patrně vznikly vchlípením plazmatické membrány

• Vzájemná komunikace prostřednictvím váčků

• Vchlipování membrány pozorováno u dnešních fotosyntetizujících bakterií

• Mitochondrie a chloroplasty mají vlastní DNA – podobnost s bakteriálním genomem

• Patrně se vyvinuly z bakterií pohlcených primitivními eukaryotickými buňkami

• Nezapojí se do vezikulárního transportu

Zvětšování organel

• Běžné v průběhu buněčného cyklu

• Přidávání nových molekul: přísun lipidů a proteinů

• Nutnost správného třídění materiálu

Třídění proteinů

• Nastává po dokončení nebo v průběhu jejich syntézy

• Posttranslační transport z cytosolu do mitochondrií, chloroplastů, peroxisomů, vnitřního prostoru jádra

• Kotranslační transport přes ER do Golgiho aparátu, lysosomů, endosomů, jaderné membrány, plazmatické membrány, extracelulárního prostoru

Tři hlavní mechanismy importu proteinů do organel

• Syntéza všech proteinů začíná na ribozomech cytosolu (s výjimkou několika mitochondriálních a chloroplastových proteinů)

• Do vnitřního prostoru jádra: přes jaderné póry

• Do mitochondrií, chloroplastů, peroxisomů: přes proteinové translokátory

• Do ER, Golgiho aparátu, endosomů, lysosomů, membrán, vnějšího prostoru: vezikulárním transportem

Translokace proteinů z cytosolu do organel

• Import proteinů do organel určuje adresová sekvence – 15-60 aminokyselin - je součástí proteinu

• u ER zvaná signální sekvence

• Po navedení proteinů do cílových struktur odštěpena

• Absence adresové sekvence: protein zůstává v cytosolu

• Umělá výměna adresové sekvence mění lokalizaci proteinu

Jaderná membrána

• Dvě vrstvy

  • Vnitřní: vazebná místa pro chromozomy a jadernou laminu

  • Jaderná lamina: síť proteinových vláken poskytující vnitřní oporu

  • Vnější: složením velmi příbuzná membráně ER, ve kterou přechází

  • perinukleární prostor kontinuálně přechází v lumen ER

Transport jadernými póry

• Pór prostupuje vnější i vnitřní jadernou membránou

• Funguje jako selektivní branka, která aktivně přenáší specifické makromolekuly a zároveň umožňuje volnou difúzi menších molekul oběma směry

• Z cytosolu do jádra: jaderné proteiny, transkripční faktory, atd.

• Z jádra do cytosolu: RNA, ribosomální podjednotky (nesestřižená pre-mRNA jádro neopouští)

Struktura jaderného póru

• Velký počet proteinových vláken na obou stranách póru

• Vlákna neomezují průchodnost

• Nevyžadována změna konformace přenášených molekul

Transport jadernými póry

• Větší molekuly a makromolekulární komplexy nemohou póry přecházet bez signálu (tzv. jaderného lokalizačního signálu, NLS)

• Na NLS se vážou pomocné cytosolové proteiny (importiny), které navádějí protein k póru a zajišťují jeho translokaci

• Nutná energetická podpora hydrolýzou GTP

• Importiny se pórem vracejí do cytosolu

Export RNA z jádra

• rRNA, tRNA, mRNA vznikají v jádře, ale fungují v cytoplazmě

• Jadernou membránou prostupují póry, nutná energie

• Přenášené RNA se spojují s proteiny obsahujícími adresovou sekvenci pro export z jádra

• Translokace membránou probíhá v komplexu s proteiny (exportiny)

Translokace do mitochondrií a chloroplastů

• Obě organely specializovány na syntézu ATP

• Vymezeny vnitřní a vnější membránou

• U chloroplastů navíc třetí membránový systém – thylakoidní membrána

• Proteiny importované z cytosolu mají na N-konci adresovou sekvenci k přesunu dochází ve speciálních místech vzájemného dotyku membrán

• Během transportu se proteiny rozvíjejí

• Adresová sekvence se odštěpuje signální peptidázou

• Obnovení konformace uvnitř organely napomáhají chaperony

Endoplazmatické retikulum

• Cytoplazmatický systém membránově uzavřených tubulů a váčků

• Napojení na jadernou membránu

• Největší organela většiny eukaryotických buněk (10% celkového objemu)

• Tvoří přibližně polovinu všech buněčných membrán

Endoplazmatické retikulum

• Hladké ER

  • Není spojeno s ribozomy

• Drsné ER

  • Na vnějším povrchu pokryto ribozomy, které syntetizují proteiny pro ER, Golgiho aparát, lysosomy, plazmatickou membránu a sekreční proteiny

Hladké endoplazmatické retikulum

• Tvorba a odbourávání cukrů

• Metabolismus cholesterolu a lipoproteinů

• Detoxifikační reakce

• Místo syntézy membránových a zásobních lipidů, a dalších lipofilních sloučenin (steroidů)

• Zásobárna Ca2+

Vstup proteinů do endoplazmatického retikula

• Nastává ještě před dokončením jejich syntézy - kotranslačně

• Podmínkou je přítomnost signální sekvence pro ER na N-konci

• Z cytosolu se do ER přenášejí 2 druhy proteinů:

  • Rozpustné: jsou do lumen ER přeneseny úplně (určeny k sekreci nebo pro lumen ER nebo jinou organelu spojenou se sekreční drahou)

  • Membránové: zůstávají zanořeny v membráně ER (transmembránové proteiny ER, jiných organel nebo plazmatické membrány)

Vstup proteinů do endoplazmatického retikula

• Spojen s translací

• Ribozom syntetizující příslušný protein musí být v kontaktu s membránou ER

• Vznikající protein proniká membránou ER a nemůže se vrátit zpět do cytosolu

Proteosyntéza na ribozomech drsného ER

• Volné a ribozomy vázané na ER jsou nerozlišitelné, liší se jen proteiny, které zrovna syntetizují

• Syntéza všech proteinů je zahájena na volných ribozomech

• Signální sekvence na N-konci vznikajícího polypeptidu přitahuje ribozom k drsnému ER

• Signální sekvenci tvoří krátký úsek hydrofobních AK, který se odštěpuje během přenosu do lumen ER

Navádění ribozomů k membráně ER

• Zapojeny jsou nejméně dva proteiny:

  • SRP („signal recognition particle“) - přítomen v cytosolu

• Váže se k signální sekvenci

• Receptor pro SRP

  • Zanořen v membráně ER

  • Přitahuje komplex ribozom/peptid/SRP k membráně ER

Přenos proteinů do ER

• Translací vzniká polypeptidový řetězec se signální sekvencí na N-konci

• Signální sekvence je rozeznána a vázána SRP

• Zpomalení syntézy daného proteinu

• Komplex SRP-ribozom se váže k receptoru SRP v membráně ER

• Po uvolnění SRP (recyklace) signální sekvence otvírá translokační kanál, kterým se protein přesunuje přes membránu

• Zároveň se obnovuje jeho syntéza

Přenos proteinů do ER

• Po splnění své naváděcí role je signální sekvence odštěpena signální peptidázou

Syntéza transmembránových proteinů

• Nepřecházejí do lumen úplně, ale zůstávají zanořeny v membráně ER

• Translokace je přerušena pomocnou sekvencí hydrofobních aminokyselin, která ukotvuje protein v membráně (sekvence zastavující přenos)

• Po odštěpení signální sekvence a umístění proteinu v lipidové dvojvrstvě proteosyntéza pokračuje na cytosolové straně membrány

Vezikulární transport

• Obousměrný dopravní systém mezi ER a plazmatickou membránou

• Zajištěn váčky, které pučí z membrán a zase s nimi fúzují

• Forma komunikace mezi vnitřkem buňky a okolím

• Sekreční dráha (z ER -> GA ->) a endocytóza (do buňky)

Sekreční dráha: ER – Golgi – lysosom/membrána

• Biosyntéza proteinů, vstup do ER

• Přesun do Golgiho aparátu k buněčnému povrchu nebo přes endosomy k lysosomům

• Vstup proteinů do ER je hlavní křižovatkou v dopravě proteinů eukaryotickou buňkou

Endocytická dráha: membrána - lysosom

• Molekuly z vnějšího prostředí uzavřeny do váčků plazmatické membrány

• Přesun k raným endosomům a lysosomům

• Při „dálkovém“ transportu jsou váčky vedeny pomocnými proteiny, které se pohybují podél vláken cytoskeletu, jinak difúze

• Hydrolytické enzymy v lysosomech zajistí rozklad přijatého materiálu

Transportní váčky

• Malé organely vymezené lipidovou membránou, které se pohybují buňkou

• Zajišťují přepravu materiálu mezi oddíly sekreční/endocytické dráhy

• Molekuly se dostávají do váčků odvozených z vnitřních organelových membrán (ER, Golgi) (sekreční dráha) nebo z plazmatické membrány, která zaškrcením obklopuje část mimobuněčného prostoru (endocytóza)

• Náklad se vyloží v jiném buněčném oddílu splynutím membrány váčku s membránou cílové organely nebo membránou plazmatickou

• Systém je využíván membránovými lipidy i proteiny

Specifita váčků

• Přijímají jen proteiny určené pro příslušný cíl

• Fúzují jen s příslušnou cílovou membránou

• Podmínka: každá organela udržuje identitu – má charakteristické zastoupení proteinů a lipidů v plazmatické membráně

• Mezi organelami zajišťují kyvadlovou dopravu různé typy váčků, každý z nich nese specifický náklad

Vchlipování váčků

• Poháněno skládáním proteinového pláště

• Specifický proteinový plášť obklopuje váčky na cytosolové straně

• Po ukončení vchlípení váček plášť ztrácí (usnadnění následné fúze s membránou cílové organely)

• Existují různé typy opláštěných váčků se specifickými obaly

Dvě hlavní funkce plášťů:

• Tvarování membrány do váčku

• Zachytávání molekul určených k transportu

Klathrinové váčky

• Nejlépe popsanél

• Pučí z Golgiho aparátu v rámci sekreční dráhy a z plazmatické membrány na počátku endocytické dráhy

• Hlavní plášťový protein – klathrin

• Molekuly klathrinu se na cytosolové straně membrány skládají do sítě

• Membránu tak nutí k zaškrcení do podoby váčku

• Klathrinové váčky pučící z vnitřního povrchu plazmatické membrány kožních buněk

• Vazbu klathrinu k membráně zajišťují adaptiny

• Malý GTP-vázající protein dynamin se obtáčí kolem vchlípeného váčku

• Hydrolýzou GTP se dynamin utáhne a odškrtí váček od membrány

Specifita klathrinových váčků

• Vyplývá z existence specifických transportních signálů na molekulách určených k přepravě a receptech v membráně, které k nim mají afinitu

• Receptory pro molekuly nákladu jsou ve spojení s klathrinem prostřednictvím adaptinu

Typy váčků

• Klathrinové s nejméně dvěma typy adaptinu

• Váčky COP („coat proteins“ - coatomer COPI, COPII)

Pohyb váčků

• Na krátké vzdálenosti (ER - Golgi): prostá difúze

• Delší vzdálenosti (Golgi – plazmatická membrána u velkých buněk): využití motorových proteinů pohybujících se podél vláken cytoskeletu

Rozeznání cílové struktury

• Zprostředkováno molekulárními značkami, které transportní váčky nesou na svém povrchu

• Označují původ váčku a náklad

• Tyto značky musí být rozeznány receptory na cílových membránách

• Klíčovými složkami jsou transmembránové proteiny SNARE

• Proteiny SNARE váčků (v-SNARE; vesicle) interagují s komplementárními proteiny SNARE na povrchu cílových membrán (t-SNARE; target)

• Každá organela má svou typickou variantu proteinu SNARE

Splynutí membrán

• SNARE zajišťují rozpoznání, nikoliv fúzi

• Ke splynutí membrán nedochází okamžitě po navázání váčku

• Požadováno velmi těsné přiblížení

• Z hydrofilního povrchu membrány musí být odstraněna voda (energeticky nevýhodné)

• Fúze katalyzována zvláštními proteiny, které se musí seskupit do komplexu a zajistit energeticky náročnou fúzi

Sekreční dráha

• Zajišťuje uvolnění materiálu do mimobuněčného prostředí (exocytózu)

• Proteiny, lipidy a sacharidy určené k sekreci procházejí drahou ER Golgiho aparát – plazmatická membrána

• Průběžná modifikace přenášených molekul, např. v lumen ER dochází díky oxidaci postranních řetězců cysteinu k tvorbě disulfidových můstků (v redukujícím prostředí cytosolu k této modifikaci nedochází)

• V Golgiho aparátu – proteolýza, glykosylace..

• Následkem je vyšší stabilita molekul a odolnost ke změnám pH ve vnějším prostředí

Exocytóza řízená a konstitutivní

Řízená sekrece z buňky

• Funguje jen v buňkách zaměřených na sekreci (např. hormonů, trávicích enzymů, atd.)

• Transportní váčky se zvětšují v sekreční váčky

• Sekreční váčky se shromažďují v blízkosti plazmatické membrány

• Přenášená molekula se uvolní jen po přijetí signálu

• Signál je zachycen receptorem

• Přijetí signálu vyvolá exocytózu

Konstitutivní (neřízená) sekrece

• Neustálý proud váčků, které pučí z Golgiho aparátu a plazmatickou membránou (základní dráha exocytózy)

• Dodává nově tvořené lipidy a proteiny do plazmatické membrány

• Zodpovídá za růst plazmatické membrány před buněčným dělením

• Sekretované proteiny přilnou k membráně z vnějšku nebo se stávají součástí extracelulární matrix

• Běžná u všech buněk eukaryot

Endocytické dráhy

• Způsob příjmu kapaliny spolu s molekulami z vnějšího prostředí

• Pro malé molekuly využívají všechny eukaryotické buňky

• Příjem velkých částic nebo celých buněk zajišťují specializované fagocytické buňky

Průběh endocytózy:

• Obklopení pohlcovaného materiálu plazmatickou membránou

• Vchlípení membrány dovnitř buňky spolu s pohlcovaným materiálem

• Odškrcení membrány a vznik nitrobuněčného endocytického váčku

• Předání pohlceného materiálu lysosomům, kde je stráven

• Metabolity vzniklé trávením v lysosomu se přenášejí do cytosolu, kde je buňka může dále využít

Typy endocytózy

• Dle velikosti endocytických váčků

  • Fagocytóza: trávení velkých částic, např. mikroorganismů a zbytků buněk prostřednictvím velkých váčků zvaných fagosomy

  • Pinocytóza: pohlcování kapaliny a molekul malými váčky

Fagocytické buňky pohlcují velké částice

• Ochrana proti infekci

• Zajištují např. makrofágy, neutrofily

• Mechanismus:

  • Na povrch infekční částice se vážou protilátky

  • Infekční částice s navázanými protilátkami se váže na povrch fagocytické buňky a aktivuje ji

  • Následkem je tvorba listovitých výběžků plazmatické membrány – pseudopodií, které částici pohltí

  • Vzniká fagosom

Lysosomy: organely pro buněčné trávení

• Membránové váčky s hydrolytickými enzymy

• Zajišťují řízené nitrobuněčné trávení původně mimobuněčných materiálů a opotřebovaných organel

Lysosomy: trávení zajišťují enzymy

• Obsahují asi 40 typů hydrolytických enzymů (kyselé hydrolázy) odbourávajících proteiny, nukleové kyseliny, oligosacharidy a fosfolipidy

• Optimální aktivita v kyselém prostředí (pH 5), které je udržováno uvnitř lysosomů – bezpečnost pro cytozolové struktury

• Kyselé pH udržuje vodíková pumpa poháněná ATP, která do lysosomu čerpá H+

• Složky lysosomální membrány jsou chráněny před vlastními enzymy glykosylací

Lysosomy odbourávají materiál z různých zdrojů

• Větší extracelulární částice jsou přijímány fagosomy, které s lysosomy fúzují

• Extracelulární kapalina je přijímána menšími endocytickými váčky, které je předávají lysosomům přes endosomy

• Lysosom někdy tráví i složky vlastní buňky (autofagie)

Shrnutí

• Vnitřní prostor eukaryotických buněk je bohatě strukturován

• Do každého oddělení buňky se transportují specifické proteiny

• Dopravu zajišťují transportní váčky nebo proteinové translokátory

• Materiály přijímané z mimobuněčného prostředí jsou přenášeny k lysosomům, kde jsou podrobeny enzymatickému rozkladu