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1. Regulación Epigenética y Cromatina

1. ¿Qué es la cromatina y cuáles son sus componentes principales?

   • La cromatina es una compleja estructura de ADN y proteínas, principalmente histonas, que compacta el ADN en el núcleo celular. Sus componentes principales son el ADN y las proteínas histónicas que forman nucleosomas, la unidad básica de la cromatina.

2. Describe los diferentes niveles de compactación de la cromatina y su relevancia para la transcripción.

   • La cromatina puede estar en forma de eucromatina (menos compacta, accesible para la transcripción) o heterocromatina (más compacta, generalmente inactiva). La compactación controla la accesibilidad del ADN, regulando así la expresión génica.

3. ¿Qué tipos de modificaciones en histonas existen y cómo afectan la expresión génica?

   • Las modificaciones incluyen acetilación, metilación, fosforilación, y ubiquitinación. Estas modificaciones pueden activar o reprimir la transcripción génica al cambiar la estructura de la cromatina, haciéndola más o menos accesible para la maquinaria transcripcional.

4. ¿Cuál es la diferencia entre acetilación y metilación de histonas en cuanto a la regulación de la transcripción?

   • La acetilación suele relajar la cromatina y activar la transcripción, mientras que la metilación puede activar o reprimir la transcripción dependiendo del sitio específico en las histonas donde ocurra.

5. Explica el papel de las proteínas con bromodominio y cromodominio en la regulación epigenética.

   • Las proteínas con bromodominios se unen a histonas acetiladas y promueven la transcripción, mientras que las de cromodominios se unen a histonas metiladas, ayudando a regular la compactación de la cromatina y, por ende, la transcripción.

6. ¿Cómo contribuyen los complejos Polycomb (PcG) y Trithorax (TrxG) en el desarrollo de los organismos?

   • Polycomb (PcG) reprime genes durante el desarrollo para mantener estados de diferenciación, mientras que Trithorax (TrxG) activa genes necesarios para el desarrollo, manteniendo los genes en estado activo.

7. ¿Qué función tienen las DNMTs en la metilación del ADN y en qué procesos biológicos son esenciales?

   • Las DNMTs (ADN metiltransferasas) añaden grupos metilo al ADN, lo que generalmente silencia genes. Son esenciales para la impronta genética, diferenciación celular y mantenimiento de la identidad celular.

8. ¿Cómo influye la desmetilación en el ADN en la regulación génica, y qué enzimas participan en este proceso?

   • La desmetilación puede activar genes previamente silenciados y es mediada por las enzimas TET, que convierten la 5-metilcitosina en intermediarios oxidativos que luego son removidos.

9. ¿Qué significa que una marca epigenética sea heredable y cómo se conserva a través de la división celular?

   • Significa que las modificaciones epigenéticas (como la metilación) se replican junto con el ADN, conservando patrones de expresión génica en células hijas, lo cual es crucial para mantener la identidad celular.

10. Explica el concepto de “impronta genética” y cómo la metilación del ADN influye en este proceso.

    • La impronta genética es la expresión de un solo alelo de un gen dependiendo de su origen paterno o materno, regulado por la metilación diferencial de los alelos, lo que inactiva uno de ellos.

11. ¿Qué papel juega la inactivación del cromosoma X en el desarrollo y cómo se regula epigenéticamente?

    • En hembras de mamíferos, un cromosoma X es inactivado epigenéticamente para equilibrar la dosis génica con los machos. Este proceso incluye la metilación del ADN y modificaciones en histonas.

12. ¿Cómo afectan los intermediarios metabólicos, como el acetil-CoA y el SAM, en la actividad de los reguladores epigenéticos?

    • El acetil-CoA es un sustrato para la acetilación de histonas, mientras que SAM (S-adenosilmetionina) es una fuente de grupos metilo en la metilación. Ambos intermediarios afectan la regulación epigenética al influir en la actividad de enzimas epigenéticas.

13. ¿Qué se entiende por “código epigenético” y cómo contribuye a la diversidad celular en organismos multicelulares?

    • El “código epigenético” se refiere a la combinación de modificaciones epigenéticas que definen la identidad y función celular. Permite que células con el mismo ADN tengan diferentes funciones en un organismo multicelular.

14. ¿Cuál es la diferencia entre una célula en estado de eucromatina y otra en heterocromatina en términos de accesibilidad y actividad transcripcional?

    • La eucromatina está menos compactada y es accesible a la maquinaria transcripcional, favoreciendo la expresión génica. La heterocromatina es densa y generalmente inactiva en la transcripción.

15. Describe cómo los factores ambientales pueden modular la función epigenética.

    • Factores como la dieta, el estrés y la exposición a toxinas pueden modificar la actividad de enzimas epigenéticas, afectando marcas como la metilación del ADN y la acetilación de histonas, y alterando la expresión génica.

2. Splicing y Procesamiento del ARN

1. ¿Qué diferencias existen entre el mRNA en procariotas y eucariotas en términos de procesamiento?

   • En eucariotas, el mRNA sufre capping, splicing y poliadenilación antes de su exportación al citoplasma. En procariotas, el mRNA generalmente no es modificado y está listo para la traducción inmediatamente.

2. Describe el proceso de splicing y el rol del spliceosoma.

   • El splicing elimina intrones y une exones en el pre-mRNA, realizado por el spliceosoma, un complejo de snRNPs que reconoce los sitios de corte y empalme para generar un mRNA funcional.

3. ¿Cuáles son las funciones de las proteínas SR en el splicing?

   • Las proteínas SR se unen a los enhancers de splicing exónicos (ESE) y ayudan a asegurar que los exones sean reconocidos y empalmados correctamente.

4. Explica qué es el splicing alternativo y cómo contribuye a la diversidad proteica.

   • El splicing alternativo permite la inclusión o exclusión de diferentes combinaciones de exones, generando múltiples variantes de proteínas a partir de un solo gen.

5. ¿Qué son los ESE, ESS, ISE e ISS en el splicing y cómo influyen en la regulación?

   • ESE (Exonic Splicing Enhancers) e ISE (Intronic Splicing Enhancers) promueven el splicing, mientras que ESS (Exonic Splicing Silencers) e ISS (Intronic Splicing Silencers) lo inhiben, regulando así el proceso de empalme.

6. ¿Cuál es la función de la marca EJC en el mRNA y en qué parte del proceso de splicing se incorpora?

   • El Exon Junction Complex (EJC) se deposita en cada unión exón-exón tras el splicing y ayuda en la exportación nuclear y control de calidad del mRNA, facilitando la degradación de mRNAs defectuosos.

7. ¿Cómo contribuye la cola poli-A a la estabilidad y exportación del mRNA?

   • La cola poli-A protege el mRNA de la degradación, facilita su exportación al citoplasma y promueve la traducción, mejorando la estabilidad del mensaje.

8. ¿Por qué los mRNAs de histonas no son poliadenilados y cómo se estabilizan?

   • Los mRNAs de histonas tienen una estructura de tallo-bucle en lugar de una cola poli-A para su estabilidad, siendo regulados durante el ciclo celular en función de la síntesis de ADN.

9. Describe las diferencias entre los intrones tipo U2 y U12 y su importancia en el splicing.

   • Los intrones tipo U2 son los más comunes y usan el snRNP U2 para su splicing, mientras que los intrones tipo U12 son raros y requieren el snRNP U12. Ambos sistemas son necesarios para la correcta expresión génica en algunos genes.

10. ¿Qué es un minigen y cómo se utiliza en el estudio del splicing?

    • Un minigen es un fragmento de ADN que incluye intrones y exones de un gen de interés, y se usa para analizar el splicing y otras regulaciones de procesamiento en sistemas experimentales.

1. Regulación Epigenética y Cromatina

1. ¿Qué factores de transcripción colaboran con los reguladores epigenéticos y por qué?

   • Factores de transcripción como las proteínas CTCF y YY1 colaboran con reguladores epigenéticos para abrir o cerrar regiones de la cromatina, facilitando el acceso de la maquinaria transcripcional a genes específicos.

2. ¿Qué es la heterocromatina constitutiva y cómo se diferencia de la facultativa?

   • La heterocromatina constitutiva es permanentemente compacta y genéticamente inactiva, como los centrómeros y telómeros, mientras que la facultativa puede activarse o desactivarse en respuesta a señales celulares.

3. ¿Cómo se relaciona la metilación del ADN con el cáncer?

   • La hipermetilación en promotores de genes supresores de tumores puede silenciarlos y contribuir al desarrollo del cáncer, mientras que la hipometilación global puede activar oncogenes y desregular el crecimiento celular.

4. ¿Qué función cumplen las enzimas TET en el desarrollo?

   • Las enzimas TET convierten la 5-metilcitosina en 5-hidroximetilcitosina y otros derivados, permitiendo la desmetilación activa del ADN, esencial para la diferenciación celular y la plasticidad epigenética en el desarrollo.

5. ¿Cuál es el papel de la fosforilación de histonas en la reparación del ADN?

   • La fosforilación de histona H2AX en sitios de daño de ADN es una señal clave que atrae proteínas de reparación y facilita la respuesta celular ante daños en el genoma.

2. Splicing y Procesamiento del ARN

1. ¿Cómo afectan las mutaciones en las secuencias de splicing a la expresión génica?

   • Las mutaciones en los sitios de splicing pueden causar errores en el empalme de exones, resultando en proteínas truncadas o no funcionales que contribuyen a enfermedades genéticas como la distrofia muscular.

2. ¿Qué es la edición del ARN y cómo se diferencia del splicing?

   • La edición del ARN modifica las bases de ARN después de la transcripción (por ejemplo, A a I), cambiando el mensaje genético, mientras que el splicing elimina intrones y une exones sin alterar las bases originales.

3. ¿Qué es la marca CAP y qué función tiene en el mRNA?

   • La marca CAP, un nucleótido de 7-metilguanosina añadido al extremo 5’ del mRNA, protege el ARN de la degradación y facilita el inicio de la traducción en los ribosomas.

4. ¿Cómo actúa la proteína hnRNP en el splicing?

   • Las proteínas hnRNP se unen a silencers exónicos o intrónicos (ESS, ISS) para inhibir el splicing, regulando la inclusión o exclusión de exones específicos en el mRNA.

5. ¿Qué ventajas ofrece el splicing alternativo en organismos complejos?

   • El splicing alternativo permite a un solo gen producir múltiples proteínas, incrementando la diversidad proteica y adaptativa sin necesidad de un gran número de genes.

3. Levaduras como Organismo Modelo

1. ¿Por qué Saccharomyces cerevisiae es un buen modelo para estudiar enfermedades humanas?

   • Al compartir muchas rutas metabólicas y de regulación génica con los humanos, S. cerevisiae permite estudiar procesos celulares fundamentales y modelar enfermedades humanas como los desórdenes neurodegenerativos.

2. ¿Qué impacto tuvo Carl Lindegren en el estudio de Saccharomyces cerevisiae?

   • Carl Lindegren fue pionero en el uso de levaduras para mapear genes, desarrollando los primeros mapas genéticos de S. cerevisiae, lo cual fue fundamental para su uso como modelo en genética.

3. ¿Cómo se usa Saccharomyces cerevisiae en la producción de proteínas terapéuticas?

   • Al modificar su ADN para incluir genes humanos, S. cerevisiae se utiliza para sintetizar proteínas terapéuticas como la insulina y el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B.

4. ¿Cuál es el origen de la levadura lager y qué importancia tiene en la producción de cerveza?

   • La levadura lager es un híbrido entre S. cerevisiae y S. eubayanus, lo que le permite fermentar a bajas temperaturas, favoreciendo la producción de cervezas con características específicas como baja turbidez y sabor suave.

5. ¿Qué tipo de mutaciones inducen los investigadores en Saccharomyces cerevisiae y por qué?

   • Se inducen mutaciones en genes específicos para estudiar sus funciones, generando mutantes sensibles a la temperatura o resistentes a antibióticos, facilitando el análisis genético y bioquímico.

4. Expresión Génica en Organismos Modelo y Hongos

1. ¿Qué es la teoría de un gen-una enzima y cómo contribuyó Neurospora crassa a su desarrollo?

   • La teoría de “un gen-una enzima”, propuesta por Beadle y Tatum usando Neurospora crassa, sugiere que cada gen codifica una enzima específica, sentando las bases para comprender la relación entre genes y función celular.

2. ¿Qué es un promotor inducible y por qué es útil en el estudio de genes esenciales?

   • Un promotor inducible permite controlar la expresión de un gen en respuesta a un estímulo, útil para estudiar genes esenciales sin que su inactivación afecte la viabilidad celular.

3. ¿Cómo se puede utilizar la técnica de knockout en hongos para estudiar la función de genes?

   • El knockout elimina un gen específico, permitiendo observar los cambios fenotípicos que resultan de su ausencia, lo cual revela su función en procesos celulares y biológicos.

4. ¿Qué es el complejo White Collar y cuál es su rol en Neurospora crassa?

   • El complejo White Collar (WC-1 y WC-2) es un regulador de la respuesta a la luz en Neurospora, controlando la expresión de genes dependientes de luz y regulando el ritmo circadiano.

5. ¿Cómo se estudian los cambios en la expresión génica en respuesta a la luz?

   • Mediante RNA-Seq y microarrays se analizan los cambios en la expresión de genes tras la exposición a luz, identificando genes de respuesta rápida y tardía y su regulación jerárquica en el proceso de señalización luminosa.

5. Técnicas Genómicas y Metodologías de Análisis

1. ¿Qué ventajas ofrece el RNA-Seq sobre el microarray para analizar expresión génica?

   • El RNA-Seq permite identificar y cuantificar todos los transcritos presentes sin conocimiento previo del genoma, mientras que el microarray solo detecta genes conocidos y requiere sondas específicas.

2. ¿Cómo se realiza el ChIP-Seq y para qué sirve en el estudio de la regulación génica?

   • El ChIP-Seq combina inmunoprecipitación de cromatina con secuenciación para identificar sitios de unión de factores de transcripción en el genoma, proporcionando información sobre regulación génica.

3. ¿Qué es un cassette de knockout y cómo se construye?

   • Un cassette de knockout es una secuencia de ADN diseñada para reemplazar un gen específico en el genoma. Se construye usando fragmentos flanqueantes del gen y una secuencia de resistencia a antibióticos para selección.

4. ¿Para qué se utiliza la fluorescencia en el análisis de proteínas y qué importancia tiene?

   • La fluorescencia permite visualizar la localización y dinámica de proteínas etiquetadas (como GFP) en células vivas, facilitando el estudio de la función y los movimientos de las proteínas en tiempo real.

5. ¿Cómo se estudia la respuesta de un organismo a un estímulo mediante expresión génica?

   • Se exponen las células al estímulo y se mide el perfil de expresión génica a través de RNA-Seq o microarrays, identificando genes regulados positiva o negativamente y los cambios en rutas celulares.

6. ¿Qué es un promotor “tunable” y cómo se usa en experimentos de regulación génica?

   • Un promotor tunable permite ajustar el nivel de expresión de un gen mediante diferentes concentraciones del inductor. Es útil para estudiar la dosis-respuesta de un gen a condiciones específicas.

7. ¿Qué es el EMSA y cómo se usa para estudiar factores de transcripción?

   • El Ensayo de Movilidad Electrofórica de Gel (EMSA) detecta la unión de proteínas a ADN mediante la retardación de su movilidad en gel, utilizado para confirmar la interacción de factores de transcripción con secuencias específicas de ADN.

6. Regulación Transcripcional y Factores Metabólicos

1. ¿Cómo afecta el S-adenosilmetionina (SAM) a la regulación epigenética?

   • El SAM es un donador de grupos metilo para la metilación del ADN y las histonas, influyendo en la activación o represión de genes en función de su disponibilidad metabólica.

2. ¿Qué es el acetil-CoA y cómo afecta la regulación de la transcripción?

   • El acetil-CoA es un sustrato para la acetilación de histonas. Su aumento promueve la apertura de la cromatina y, en consecuencia, la activación de genes.

3. ¿Cómo interactúan las topoisomerasas con la cromatina durante la transcripción?

   • Las topoisomerasas alivian el superenrollamiento del ADN generado durante la transcripción y replicación, permitiendo que el ADN se mantenga accesible para la maquinaria de transcripción y replicación.

4. ¿Qué es el “pausing” de la ARN polimerasa y cómo regula la transcripción?

   • El “pausing” es una pausa en la actividad de la ARN polimerasa durante la transcripción, regulando la velocidad de transcripción y permitiendo la integración de señales regulatorias antes de la elongación completa.

5. ¿Cómo afectan las modificaciones en las histonas la estructura de la cromatina?

   • Las modificaciones en histonas alteran las interacciones entre histonas y ADN, así como entre nucleosomas adyacentes, regulando la accesibilidad de la cromatina para la maquinaria de transcripción.

• mRNA precursor: Es una molécula que codifica una proteína y proporciona múltiples copias de péptidos específicos tras la escisión en sitios específicos. Aún no sufre las modificaciones o procesamiento para ser exportado al núcleo y traducido.

• Capping y poliadenilación: Son modificaciones co-transcripcionales que sufre el ARNm en el núcleo.

• Intrón y exón: Intrón: secuencia que después de un proceso de splicing es eliminada del pre-mrna, estando ausente del mRNA maduro. Exón: Secuencia que en el proceso de splicing queda conservada en el mRNA. ¡NUNCA DEFINIR COMO ZONA CODIFICANTE!, se puede ser exón y aun así pertenecer al 5´ UTR o 3´UTR.

• Sitio de splicing: Sitio en el que sucedió un evento de splicing, en este se juntaron dos exones (s elimina un intrón entre medio) y se añade un Exon Junction Complex (EJC).

• snRNA y snRNP: RNA pequeño nuclear y Ribonucloproteína pequeña nuclear son secuencias cortas de ácidos nucleicos no codificantes y ribonucleoproteínas que, de forma principal, generan la maquianria splisosomal.

• Factor de splicing: Los factores de splicing son proteínas que son capaces de modular el splicing por medio de unión a sitios como ISE (intronic splicing enhancer), ESE (exonic splicing enhancer), ISS (intronic splicing silencer) y ESS (exonic splicing silencer). Lo que da como resultado splicing alternativo

• Splicing site 3´y 5´: El 3´ Splicing Site es siempre una Adenina y una Guanina (AG) y el 5´Splicing site es Guanina y uracilo (GU).

• Spliceosoma: Es un complejo de small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) que catalizan la reacción de splicing en cierto tipo de intrones. El spliceosoma se conforma de subunidades U1,U2,U4/U6 y U5.

• Direct reversal damage repair: La reparación directa del daño en el ADN es un mecanismo especializado que corrige ciertos tipos de lesiones mediante enzimas específicas. En lugar de eliminar y reemplazar nucleótidos, estas enzimas reconocen y revierten directamente el daño químico en las bases de ADN. Por ejemplo, la fotolisasa revierte los dímeros de pirimidina inducidos por la radiación ultravioleta. Esta reparación es rápida y precisa, abordando lesiones de manera específica sin la necesidad de una excisión extensa.

• Single strand damage repair: Reparación de daño en una única hebra. Se centra en corregir lesiones que afectan solo una de las hebras del ADN, como cortes o daños en una sola cadena. Este proceso puede involucrar la excisión y reemplazo de la porción dañada.

• Double strand damage repair: Aborda daños más extensos que involucran la ruptura de ambas hebras de la doble hélice de ADN. Hay dos principales vías para este tipo de reparación: la recombinación homóloga, que utiliza una hebra homóloga como molde para la reparación, y la unión de extremos no homólogos, que conecta los extremos rotos sin depender de una hebra homóloga

• Non homologous end joining: En este proceso, los extremos quebrados son ligados directamente sin depender de una hebra homóloga como molde. NHEJ es rápido y eficiente, pero puede introducir pequeñas inserciones o deleciones, lo que puede resultar en mutaciones. Este mecanismo es crucial para preservar la integridad genómica en situaciones de quiebres en el ADN, proporcionando una solución rápida para la reparación de daños extensos.

• Recombinación homologa Proceso fundamental que utiliza una hebra homóloga, generalmente la hebra hermana, como molde para la reconstrucción precisa de quiebres de doble cadena. Este mecanismo asegura una reparación fiel y sin pérdida de información genética, utilizando la copia intacta de la secuencia homóloga como guía para restaurar la integridad del ADN dañado

2. ¿Qué es un mRNA precursor? ¿Y un mRNA maduro? Mencione todos los procesos que sufre un mRNA precursor hasta convertirse en un mRNA maduro. ¿Dónde se llevan a cabo en la célula? Un pre-mRNA es el precursor de mensajero o mensajero prematuro. Este es el transcrito recién transcribido, el cual sufre en eucariontes al menos tres modificaciones: splicing (remoción de intrones), poliadenilación en el extremo 3’ y la adición de un 5’ cap de 7-metilguanilato. Estos tres procesos normalmente se llevan a cabo en en núcleo de la célula. Una vez maduro, el mRNA es exportado al citoplasma

3. Mencione y explique todas las etapas de la poliadenilación del mRNA y las enzimas que están involucradas en cada una ellas. ¿Cómo se relaciona el proceso de poliadenilación con el de transcripción? Para que la poliadenilación del extremo 3’ del mensajero comience, se requiere que se lea una señal dentro de la secuencia de DNA, la cual participa en el reclutamiento de proteínas al CTD de la polimerasa. Una vez leída estas proteínas (CstF y CPSF) se unen a esta misma señal en el mensajero y CstF corta la secuencia de RNA. Luego, la Poly-A-polimerase agrega los cientos de residuos de adenina. A esta cola poliA se van uniendo además distintas proteínas que ayudan a estabilizar el mensajero. La poliadenilación se le relaciona con la transcripción, ya que se cree que el término de esta depende de la desestabilzación de la polimerasa generada luego del corte del extremo 3’ y el inicio de la poliadenilación. En este sentido existen al menos dos modelos para explicar esta desestabilización, el modelo de torpedo vs. el modelo alostérico.

4. Describa la estructura del tRNA y todas las etapas/enzimas asociadas a su procesamiento:

-Transcripción: El tRNA se transcribe a partir del ADN por la ARN polimerasa III.

-Modificaciones: Se añaden y modifican bases nucleotídicas en el tRNA, incluyendo bases que no están presentes en el ADN original. Esto contribuye a la estabilidad y funcionalidad del tRNA. }

-Eliminación de Intron (si aplica): Algunos tRNA son transcritos con intrones (regiones no codificantes). Estos intrones son eliminados por endonucleasas y exonucleasas.

-Añadido de la Secuencia CCA: Una secuencia CCA es añadida al extremo 3' del tRNA. Esta secuencia es esencial porque actúa como el sitio de unión para el aminoácido específico.

-Plegamiento y Modificación de la Estructura: El tRNA se pliega en su estructura tridimensional característica. Se realizan modificaciones químicas adicionales en varias bases, contribuyendo a la estabilidad y función del tRNA.

-Carga del Aminoácido: El tRNA es "cargado" con un aminoácido específico por una enzima llamada aminoacil-ARNt sintetasa. Cada aminoacil

-ARNt sintetasa se encarga de un aminoácido particular y su correspondiente tRNA.

-Reconocimiento del Codón: Durante la síntesis de proteínas, el tRNA transporta el aminoácido al ribosoma y se empareja con el ARNm a través del reconocimiento del codón mediante el anticodón.

5. ¿Qué elementos (secuencias) posee el origen de replicación del E. coli? ¿Qué funciones cumplen dichos elementos? ¿Cómo son los orígenes de replicación en eucariontes? Compárelos con el origen de replicación de E. coli. En E. coli el origen de replicación es una secuencia de DNA que contiene dos tipos de elementos: elementos de unión a la proteína iniciadora (DnaA) y elementos ricos en nucleótidos AT que son capaces de separarse más fácilmente y también ayudan a reclutar otras proteínas del replisoma. En el cromosoma de E. coli existe un único origen de replicación llamado OriC. Además de estas secuencias también existen otros elementos mas específicos como las cajas R, la región DUE (DNA unwinding element), el IHF (Integration Host Factor) y Fis (Factor for inversion stimulation). En comparación, los orígenes de replicación eucariontes pueden ser varios, pero también contienen elementos que lo reconocen las proteínas iniciadoras y que permiten separar las dos hebras.

6. Mencione las proteínas que son requeridas para el reconocimiento del origen de replicación de E.coli, su apertura y para la conformación del replisoma. Detalle paso a paso cómo es que estos componentes son reclutados en el origen. La proteína DnaA-ATP se une a las regiones R1, R2 y R4 junto con Fis. Fis luego es desplazado, lo que permite que otras proteínas (HU y IHF) promuevan la unión de la DnaA a los sitios de menor afinidad en el OriC (R2, R5, C1 al 3, I1 al 3 y t2), esto mediante la torsion del DNA, lo cual termina abriendo la doble hebra de DNA, gracias también a los sitios o regiones ricas en AT que desestabilizan la estructura de la doble hebra en la región necesaria. Posteriormente, DnaC promueve la unión al OriC de DnaB a cada hebra. DnaB es es una helicasa, la cual participa en desenrollar el DNA para su replicación, y además recluta a una primasa (DnaG), la cual sintetiza los primers de RNA necesarios para iniciar la duplicación. Luego, se recluta a la DNA polimerasa la cual comienza a sintetizar el DNA en ambas hebras en forma de holoenzyma. La replicación es bidireccional a partir del oriC. En la elongación también participan otras proteínas estabilizadoras de la hebra, como girasa y topoisomerasas y las single-strans binding protein monomers que ayudan a acomodar la hebra de la manera mas recta posible para que la polimerasa pueda avanzar.

7. ¿Cuántas DNA polimerasas se conocen en E.coli actualmente? ¿En qué procesos participan?

-DNA polimerasa I (Pol I): Participa en la síntesis de ADN durante la reparación y el mantenimiento del genoma. También tiene actividad de exonucleasa y es esencial para la eliminación de los cebadores de ARN durante la replicación.

-DNA polimerasa II (Pol II): Esta polimerasa se activa en respuesta a daños en el ADN y participa en la reparación del ADN.

-DNA polimerasa III (Pol III): Es la principal enzima replicativa en E. coli y desempeña un papel central en la replicación del ADN. Trabaja junto con otras proteínas para formar el replisoma, la maquinaria responsable de duplicar el ADN.

-DNA polimerasa IV (Pol IV) y DNA polimerasa V (Pol V): Estas polimerasas están involucradas en la tolerancia al daño del ADN. Son inducidas en respuesta a daños en el ADN y participan en la síntesis de ADN, permitiendo que la replicación continúe a pesar de los daños.

8. ¿Qué es la actividad “proofreading” de las DNA polimerasas?, ¿Cómo aporta a la fidelidad del proceso de replicación del DNA?, ¿Qué mecanismo utiliza la célula para mantener la fidelidad del proceso de replicación si la actividad “proofreading” falla? Hace referencia a la capacidad de algunas polimerasas, de retroceder y eliminar nucleótidos que fueron erróneamente colocados (que no coinciden con el templado complementario). Este mecanismo de proofreading aumenta significativamente la fidelidad de la replicación del ADN, reduciendo la tasa de errores en la secuencia de ADN. Sin embargo, si la actividad "proofreading" falla y se produce un error, las células tienen otros mecanismos de corrección de errores, como el sistema de reparación de la coincidencia (mismatch repair system). Este sistema escanea el ADN recién replicado y corrige los errores que puedan haber pasado desapercibidos durante la proofreading. Funciona reconociendo bases mal apareadas y eliminando la secuencia incorrecta para ser sintetizada nuevamente de manera precisa.

9. ¿Qué son las topoisomerasas? ¿Qué tipos hay? ¿Qué función cumplen en la replicación? Son enzimas que cortan las hebras de DNA para, en general, relajar la tensión de estas durante la replicación. Existen al menos dos tipos: - - Topoisomerasas Tipo I: Realizan cortes en una sola hebra de ADN, relajando la tensión generada durante la replicación y otros procesos. Topoisomerasas Tipo II: Producen cortes en ambas hebras de ADN, permitiendo la resolución de entrelazamientos y manipulando la topología del ADN durante la replicación. Requieren energía para llevar a cabo esta actividad.

10. ¿Cómo son procesados los fragmentos de Okazaki?, ¿En qué consiste el proceso de nick translation? Los fragmentos de Okazaki son procesados para formar una hebra continua en la dirección 5'- 3'. La ADN polimerasa I desempeña un papel crucial al retirar los cebadores de ARN presentes en la hebra rezagada y, al mismo tiempo, sintetizar ADN complementario. Este proceso, conocido como "nick translation", implica la eliminación de los cebadores y la síntesis de ADN en segmentos cortos. Posteriormente, la ADN ligasa se encarga de llenar las brechas entre los fragmentos de Okazaki mediante la unión covalente, resultando en una hebra continua que completa la replicación precisa de ambas hebras del ADN

11. Describa el mismatch repair, base excision repair y el nucleotide excision repair. Mismatch repair (MMR): Mecanismo de reparación del DNA en el que se subsanan errores de apareamiento. Se detectan porque la proteína MutS esta constantemente revisando el DNA. Al detectar un mismatch, recluta MutL y MutH, las cuales cortan la hebra recién sintetizada (COMO SE DISTINGUÍA DE LA MOLDE --> METILACION (que no posee adeninas metiladas) y desintegran parte de la hebra para su reparacion y luego la polimerasa y la ligasa se encargan de rellenar y cerrar correctamente el corte.

Base excision repair (BER): Es un mecanismo de reparación del ADN que se enfoca en corregir daños que afectan individualmente a una base específica en lugar de alterar la estructura general de la cadena de ADN. Se inicia con la acción de una glicosilasa que reconoce y elimina la base dañada en conjunto con una AP endonucleasa. Esto crea un sitio apurínico o apirimidínico (un lugar sin la base nitrogenada) en la cadena de ADN. Luego, una endonucleasa corta la cadena de ADN en el sitio apurínico o apirimidínico, eliminando el fragmento dañado. La ADN polimerasa rellena la brecha con las bases correctas, y finalmente, la ADN ligasa sella la nueva cadena de ADN, restaurando la integridad de la secuencia.

Nucleotide excision repair (NER): Mecanismo de reparación del ADN que aborda daños más extensos, como dímeros de pirimidinas inducidos por la radiación ultravioleta. Este proceso es crucial para corregir lesiones que afectan la estructura global de la doble hélice de ADN. La NER se inicia con el reconocimiento de la lesión por parte de complejos de reconocimiento específicos. Estos complejos escanean el ADN en busca de anormalidades estructurales y las marcan. Luego, una endonucleasa excinde una porción de la cadena de ADN que contiene la lesión. La ADN polimerasa rellena la brecha utilizando la cadena complementaria como molde, y finalmente, la ADN ligasa sella la nueva cadena de ADN.

12. ¿Qué es la recombinación homóloga? ¿Qué funciones cumple en los organismos vivos? Explique la relación que existe entre la recombinación homóloga y la reparación del DNA. En el contexto de la reparación del ADN, la recombinación homóloga es un proceso fundamental que utiliza una hebra homóloga, generalmente la hebra hermana, como molde para la reconstrucción precisa de quiebres de doble cadena. Este mecanismo asegura una reparación fiel y sin pérdida de información genética, utilizando la copia intacta de la secuencia homóloga como guía para restaurar la integridad del ADN dañado. La recombinación homóloga desempeña un papel esencial en la preservación de la estabilidad genómica y la prevención de mutaciones durante la reparación del ADN.

13. ¿Cómo se podría demostrar experimentalmente que una proteína regula directamente la inclusión/exclusión de un exón? Con ensayos in vitro de splicing como los vistos en el paper y ayudantía, así como también la utilización de minigenes + ensayos de splicing in vitro o in vivo.

1. En relación con el proceso de elongación en procariontes, menciones los eventos y componentes que median el proceso de elongación Durante la elongación en procariontes, varios eventos permiten el avance del frente de replicación. La helicasa DnaB desenrolla la doble hélice de ADN, generando una horquilla de replicación. La primasa sintetiza cebadores de RNA en las hebras de ADN, proporcionando puntos de inicio para la síntesis de nuevas cadenas. La ADN polimerasa III, principal enzima replicativa, agrega nucleótidos complementarios en dirección 5' a 3', extendiendo las cadenas de ADN. El complejo τ-γ, donde la subunidad γ se asocia con τ, es esencial. La subunidad γ, como parte del complejo de carga de abrazadera deslizante, interacciona con la abrazadera deslizante, mejorandola eficiencia de la ADN polimerasa III. Además, la proteína RFA se une a las hebras de ADN recién sintetizadas, estabilizando la horquilla de replicación y facilitando las actividades enzimáticas.

2. En replicación del DNA existe la síntesis de una hebra retardada en forma discontinua ¿Qué significa esta afirmación? ¿cómo se lleva a cabo la síntesis de esta hebra? Refiérase especialmente a la formación de los fragmentos de Okazaki. Durante la replicación del ADN, la hebra rezagada es la cadena de ADN que se sintetiza en dirección opuesta a la horquilla de replicación, lo que significa que la ADN polimerasa III no puede sintetizarla de manera continua en la misma dirección que la horquilla. Esta hebra requiere la síntesis de pequeños fragmentos llamados fragmentos de Okazaki. El proceso comienza con la primasa, que sintetiza un cebador de ARN en la hebra rezagada. La ADN polimerasa III luego utiliza estos cebadores como puntos de inicio para sintetizar segmentos cortos de ADN, conocidos como fragmentos de Okazaki. Este enfoque discontinuo es necesario debido a la orientación antiparalela de las hebras de ADN y garantiza la replicación precisa y completa de ambas hebras del ADN.

3. ¿Cómo termina la replicación en procariontes? ¿Y en eucariontes? ¿Qué importancia tienen las topoisomerasas y telomerasas en este contexto? En procariontes las secuencias terminadoras desempeñan un papel esencial al actuar como puntos de detención para la maquinaria de replicación. Estas secuencias específicas en el ADN detienen temporalmente el avance de la horquilla de replicación al unirse a las proteínas Tus, actuando como barreras. Este mecanismo asegura la replicación coordinada y la correcta segregación de las hebras de ADN recién replicadas. Además, las topoisomerasas, especialmente las tipo II, contribuyen al proceso al aliviar la tensión generada durante la replicación, facilitando la separación eficiente de las hebras de ADN. En conjunto, estas interacciones garantizan una terminación precisa y coordinada de la replicación en procariontes. En eucariontes, la replicación del ADN es más compleja. Múltiples orígenes de replicación se activan simultáneamente a lo largo de los cromosomas, y la replicación es semidiscontinua. La terminación implica la fusión de las horquillas de replicación y la resolución de tensiones cromosómicas. Las topoisomerasas desempeñan un papel fundamental en la resolución de estas tensiones, permitiendo la formación de cromosomas individuales. Además, las telomerasas tienen un papel crucial en la conservación de los extremos cromosómicos, evitando la pérdida progresiva de información genética.

4. ¿Qué fuentes de daño al DNA endógenas y exógenas se conocen? Mencione ejemplos e indique que sistemas participan en la reparación de cada tipo de daño. Las fuentes de daño al ADN pueden ser tanto endógenas como exógenas. Entre las fuentes endógenas se encuentran errores durante la replicación, desaminación espontánea de bases, formación de radicales libres durante procesos metabólicos y productos químicos intracelulares. Ejemplos incluyen la desaminación de citosina a uracilo y la formación de 8-oxoguanina por radicales libres. Los sistemas de reparación endógenos incluyen la reparación por escisión de nucleótidos (NER) y la reparación por escisión de bases (BER). Las fuentes exógenas abarcan radiación ultravioleta (UV), radiación ionizante, productos químicos carcinógenos ambientales y agentes físicos como el humo del tabaco. Ejemplos específicos incluyen dímeros de pirimidina causados por la radiación UV y quiebres de doble cadena inducidos por radiación ionizante. Los sistemas de reparación involucrados son la reparación por escisión de nucleótidos (NER) para dímeros de pirimidina y la recombinación homóloga.

5. Refiérase a la procesividad de cada una de las polimerasas en presencia de una mutación. Proponga el rol celular que podría tener cada una de estas polimerasas en los organismos vivos. - ADN Polimerasa de Alta Fidelidad (por ejemplo, ADN Polimerasa III): Las ADN polimerasas de alta fidelidad tienden a ser altamente procesivas y, en presencia de una mutación, pueden ser más propensas a pausarse o detenerse. Estas polimerasas son menos tolerantes a errores y t ienden a realizar una corrección de prueba de errores (proofreading) para mantener la f idelidad del proceso de replicación. - - ADN Polimerasa Translesional (por ejemplo, ADN Polimerasa II y IV): Las ADN polimerasas translesionales, como la Polimerasa II y IV, son menos procesivas pero más tolerantes a las lesiones en el ADN. En presencia de mutaciones o daño en el templado de ADN, estas polimerasas pueden replicar a través de estas regiones anómalas, aunque con una mayor propensión a la generacion de errores. ADN Polimerasa de Reparación (por ejemplo, ADN Polimerasa I): ADN Polimerasa I, que participa en procesos de reparación, también tiene una procesividad limitada. Su función principal es rellenar brechas en la cadena de ADN durante la reparación, y en presencia de una mutación, puede participar en la eliminación y sustitución de segmentos dañados.

6. ¿Qué herramientas experimentales puede utilizar para detectar splicing alternativo? De las más importantes es la generación de cDNA, técnica que usa la transcriptasa reversa para “pasar” de RNA a cDNA, con lo que técnicas de amplificación (PCR, qPCR, etc.) pueden ser usadas para experimentar con variantes de mRNA. Otras técnicas serían el uso de minigenes que explico el Dr. Munita en clases.

7. El fármaco antiviral Aclicovir se utiliza para tratar infecciones causadas por virus deDNA bicatenario como el del herpes simple. El aciclovir actúa en el nivel de la síntesis del DNA. ¿El aclicovir funciona como análogo de qué desoxinucleósido?. Este fármaco no puede incorporarse en el DNA salvo que sea modificado por una cinasa codificada por el virus. Explique por qué se requieres de esta enzima para que aciclovir se incorpore durante la síntesis de DNA. Funciona como análogo de la dexosiguanosina. Sin el grupo trisfosfato, este fármaco no puede incorporarse en una cadena de DNA en crecimiento. Las cinasas fosforilan su sustrato por lo cual, en este caso la cinasa agrega los grupos fosfato que le faltan al Aciclovir.