interrogacion 1 bioquimica y genetica

Definiciones de vida

• F. Engels (1894): La vida es la existencia de estructuras proteicas que se autorenuevan constantemente.

• J.D. Bernal (1965): La vida es un sistema de reacciones orgánicas que se autoperpetúa, catalizadas por catalizadores orgánicos complejos.

• NASA (1994): La vida es un sistema químico autosustentable capaz de experimentar evolución Darwiniana.

• P.L. Luisi (2006): La vida transforma materia y energía externa en un proceso interno de automantención.

• Albert Gutberlet (2006): La vida es un todo corporal capaz de acción propia.

• Franklin Harold (2014): La vida es un estado singular de la materia con complejidad, autonomía, propósito y capacidad de reflexión.

Características de la vida

• Alta complejidad: El todo es más que la suma de sus componentes.

• Diversidad molecular: Principalmente basada en carbono.

• Misma estructura y lógica molecular: Quiralidad y código genético compartido.

• Alto nivel de organización: Jerarquizada en niveles molecular, supramolecular, celular y multicelular.

• Sistemas alejados del equilibrio: Mantienen concentraciones inusuales de ciertos elementos.

• Información hereditaria: El lenguaje de los genes está escrito en un alfabeto de cuatro letras.

Autopoiesis

Concepto de autopoiesis

• Humberto Maturana y Rodrigo Varela: Proceso de producción en el cual cada componente participa en la producción o transformación de los demás componentes, incluyendo la producción de un límite externo que especifica el dominio de la organización autopoiética.

Modelo teórico de autopoiesis

• Replicasa: Una vesícula contiene una replicasa que se autocopia y sintetiza los lípidos de la membrana, cerrando el circuito autopoiético.

Enzimas y Transformaciones

Función de las enzimas

• Transformaciones dirigidas: Específicas y altamente eficientes.

• Ejemplo: La glucosa se degrada en CO2 y agua rápidamente gracias a las enzimas.

Tipos de enzimas

• Transferasas: Transfieren grupos entre moléculas.

• Hidrolasas: Rompen moléculas mediante hidrólisis.

• Oxido-reductasas: Reacciones de óxido-reducción.

• Isomerasas: Cambian la orientación de enlaces dobles.

• Liasas: Rompen moléculas.

• Ligasas: Reacciones de condensación.

Organización Jerarquizada

Tamaño de componentes

• Célula, mitocondria, proteína, glucosa, agua: Diferentes tamaños y funciones en la vida.

Átomos de la vida

• C, H, O, N, P y S: Principales átomos en la masa celular, formando enlaces covalentes.

Propiedades del Agua

Características del agua

• Polaridad: Distribución externa de electrones en el oxígeno es casi tetrahédrica.

• Tensión superficial alta: Permite el paso del agua a través de capilares.

• Calor específico: Cantidad de calor necesaria para elevar la temperatura del agua.

• Calor de evaporación: Alta constante dieléctrica, buen solvente para moléculas polares.

Comportamiento del agua

• Moléculas hidrofílicas: Se disuelven en agua.

• Moléculas hidrofóbicas: Tienden a agregarse.

Posibilidad de Vida en Marte

Evidencia de agua en Marte

• Hielo y agua líquida: Posibilidad de vida basada en agua.

• Amonio: Alternativa como solvente para la vida, similar al agua.

Fuerzas que gobiernan interacciones entre biomoléculas

• Puentes de hidrógeno

• Interacciones electrostáticas

• Van der Waals

• Fuerzas hidrofóbicas

Composición y Función de las Proteínas

Funciones de las proteínas

• Motoras

• Anticuerpos

• De transporte

• Estructurales

• Receptores

• Almacenamiento

• Catálisis

Composición proteica: Aminoácidos

• Estructura básica: Un carbono quiral (α), un grupo carboxilato, un hidrógeno y un grupo R variable.

• Glicina: El aminoácido más simple, con un grupo R de hidrógeno, lo que hace que no sea quiral.

• 20 aminoácidos: Las proteínas se componen de estos aminoácidos, aunque pueden modificarse postraduccionalmente.

Nomenclatura de aminoácidos

• D y L: Indican la capacidad de guiar la luz polarizada (D: derecha, L: izquierda).

• R y S: Indican la configuración (R: reloj, S: anti-reloj).

Clasificación de aminoácidos

1. No polares: Cadenas alifáticas o electronegativos neutralizados.

2. Aromáticos: Electrones en resonancia.

3. Polares: Átomos electronegativos con carga aparente.

4. Cargados (+): Aminos que pueden protonarse.

5. Cargados (-): Grupos carboxilo que pueden perder protones.

Propiedades ácido-base de los aminoácidos

• Pka: Asociado al ácido (pka1), al amino (pka2) y al grupo R (pkaR).

• Punto isoeléctrico: pH al que la molécula tiene carga neta 0.

• Zwitterion: Forma en la que el aminoácido tiene cargas netas internas pero carga neta 0.

Polimerización de aminoácidos

• Enlace peptídico: Formación de dipéptidos mediante condensación y su ruptura mediante hidrólisis.

Estructura de las Proteínas

Estructura primaria

• Secuencia de aminoácidos: Determina la estructura final del péptido.

Estructura secundaria

1. Alfa hélice:

   • Características: Estructura helicoidal con enlaces de hidrógeno que le dan estabilidad.

   • Interrupciones: Prolina y glicina pueden interrumpir la homogeneidad de la alfa hélice.

2. Hoja plegada beta:

   • Tipos: Paralela y antiparalela, estabilizada por puentes de hidrógeno.

3. Giro beta:

   • Características: Ocurre cuando el polipéptido revierte la dirección en 180°, contiene 4 aminoácidos, a menudo glicina y prolina.

Estructura terciaria

• Modelo de plegamiento: Primero se forman estructuras secundarias locales y luego relaciones más distantes.

• Interacciones importantes: Puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, puentes iónicos y estabilización covalente mediante puentes de disulfuro.

Propiedades de las Proteínas

Absorción de luz

• Tirosina y triptófano: Absorben luz a 280 nm, lo que permite extrapolar la concentración de proteínas en una solución.

Propiedades ácido-base

• Protonación y desprotonación: Dependiendo del pH, los grupos carboxilo y amino pueden ceder o captar protones, afectando la carga neta del aminoácido.

Ejemplos de Proteínas

Mioglobina

• Función: Lleva oxígeno a las células musculares.

• Estructura: Corroboró la existencia de la alfa hélice y los giros beta.

Hemoglobina

• Mutación: Una mutación de Glu a Val induce la formación de cristales de hemoglobina, afectando su funcionalidad.

Resumen de fuerzas en la estructura tridimensional de proteínas

1. Puentes de disulfuro

2. Puentes de hidrógeno

3. Fuerzas electrostáticas

4. Interacciones hidrofóbicas (Van der Waals)

Hidrofobicidad de aminoácidos

• Medida de hidropatía: Indica las tendencias hidrofóbicas e hidrofílicas de los aminoácidos.

• Perfil hidropático: Permite predecir la distribución de aminoácidos hidrofóbicos en la proteína.

Proteínas de membrana

• Canales: Formados por aminoácidos hidrofóbicos y filicos para el paso de moléculas cargadas.

Motivos y dominios

• Motivos: Estructuras secundarias pequeñas y repetitivas.

• Dominios: Motivos con función conocida.

Estructura y Función de Proteínas

Dominios de interacción proteína-ADN

1. Leucine zipper:

   • Segmentos de unos 30 aminoácidos con leucinas cada 7 residuos y aminoácidos básicos (arginina y lisina) en la zona de unión al ADN.

   • Las leucinas vecinas contribuyen a la dimerización mediante interacciones hidrofóbicas.

2. Zinc fingers:

   • Factores de transcripción con secuencias de unos 30 aminoácidos que unen zinc u otros iones.

   • Cada dedo se une a la cavidad mayor del ADN interactuando con unas 5 bases.

3. Helix-loop-Helix:

   • Segmentos de unos 50 aminoácidos típicos de factores de transcripción.

   • Diméricos, con una hélice que une el ADN y otra hélice unida por un loop.

Estructura cuaternaria de proteínas

• Homodímero: Dos subunidades iguales.

• Heterodímero: Dos subunidades distintas.

• Multímero: Múltiples subunidades (tri, tetra, penta, etc.).

Proteínas globulares y fibrosas

1. Proteínas globulares:

   • Funciones diversas: citosólicas, enzimas, proteínas motoras, inmunoglobulinas, etc.

   • Ejemplo: Hemoglobina, formada por dos cadenas de globina α y dos cadenas de globina β.

2. Proteínas fibrosas:

   • Insolubles y adaptadas a funciones específicas.

   • Ejemplo: Colágeno, proteína helicoidal en tejido conectivo, y fibroína, proteína de la seda.

Modificaciones post-traduccionales

• Glicosilación: Añade carbohidratos a la superficie de la proteína.

• Lipidación: Permite anclaje de proteínas a membranas.

• Fosforilación: Induce cambios estructurales y funcionales.

Plegamiento de proteínas

• Importancia: Un plegamiento incorrecto puede causar enfermedades como la enfermedad de Creutzfeld-Jacob.

• Denaturación: Pérdida de estructura cuaternaria, terciaria o secundaria.

• Renaturación: Algunas proteínas pueden recuperar su conformación nativa al remover el agente denaturante.

Chaperonas

• Hsp70: Se unen a regiones ricas en aminoácidos hidrofóbicos en péptidos aún no plegados o denaturados.

• Protein Disulfide Isomerase (PDI): Corrigen puentes de disulfuro no funcionales.

Modelamiento bioinformático

• Predicción de estructuras: Basado en estructuras conocidas para deducir la estructura más cercana a la realidad.

Determinación empírica de la estructura de proteínas

Métodos principales:

1. Cristalografía de rayos X:

   • Proceso: Se forman cristales de proteínas mediante la variación de variables como el pH y la salinidad. Luego, estos cristales se llevan a un sincrotrón, donde se les incide un rayo X para generar un patrón de difracción.

   • Ventajas: Excelente resolución (0.1 angstrom).

   • Desventajas: No todas las proteínas forman cristales y la estructura observada puede no ser la misma en solución.

2. Resonancia Magnética Nuclear (NMR):

   • Proceso: Se aplica un campo magnético para orientar los protones de los átomos de hidrógeno en la proteína. Luego, se aplica radiación de alta frecuencia para desorientar estos protones y se mide el decaimiento inducido para reconstruir la estructura 3D.

   • Ventajas: Puede realizarse en proteínas en solución, acercándose más a su contexto fisiológico.

   • Desventajas: Resolución menor que la difracción por rayos X y datos difíciles de procesar.

3. Microscopía electrónica crio (crio-EM):

   • Proceso: La muestra se congela en un medio acuoso sólido y se toman imágenes 2D desde distintos ángulos. Un computador integra estas imágenes para formar una estructura 3D.

   • Ventajas: Permite resolver estructuras proteicas y macroestructuras, incluyendo proteínas con segmentos transmembrana.

   • Desventajas: La resolución depende de la cantidad de imágenes tomadas.

Purificación de proteínas

Razones para purificar proteínas:

1. Caracterización: Para conocer más sobre la proteína (cristalografía de rayos X, cinética enzimática, especificidad, etc.).

2. Uso práctico: Para utilizar sus propiedades en el laboratorio o la industria (anticuerpos, vacunas, enzimas, etc.).

Métodos de purificación:

1. Disrupción celular:

   • Métodos mecánicos: Mortero, sonicación, prensa francesa, etc.

   • Métodos químicos: Uso de detergentes, enzimas, agentes desnaturalizantes.

2. Solubilización de proteínas de membrana:

   • Uso de detergentes: No iónicos para solubilizar membranas y iónicos para desnaturalizar proteínas.

3. Precipitación de proteínas:

   • Salting out: Uso de sales como sulfato de amonio para precipitar proteínas.

   • Precipitación con solventes orgánicos: Uso de acetona o etanol para disminuir la solubilidad de las proteínas.

4. Cromatografía líquida de proteínas (FPLC):

   • Similar a la HPLC pero a menor presión, utilizada para separar proteínas basándose en sus propiedades físicas y químicas.

Cuidado de la muestra

• Desfosforilación: Uso de inhibidores de fosfatasas para evitar la desfosforilación de proteínas.

• Protección contra la degradación: Uso de inhibidores de proteasas y trabajo a bajas temperaturas para evitar la degradación de proteínas.

1. Cromatografía de Intercambio Iónico

• Se basa en la diferencia de carga entre las proteínas y la resina de la columna.

• Hay dos tipos principales:

  • Catiónica: La resina es negativa y retiene cationes (proteínas cargadas positivamente).

  • Aniónica: La resina es positiva y retiene aniones (proteínas cargadas negativamente).

• Las proteínas de carga opuesta a la resina se enlazan a ella, mientras que las demás pasan sin interactuar.

• Para eluir las proteínas retenidas, se usa un gradiente de sales o un cambio de pH, lo que debilita las interacciones iónicas y permite su salida en orden de menor a mayor afinidad.

Aplicación: Ideal para separar proteínas con cargas diferentes a un pH específico.

2. Cromatografía de Exclusión por Tamaño (Filtración en Gel)

• Separa moléculas según su tamaño.

• La fase estacionaria es una matriz porosa:

  • Proteínas pequeñas entran en los poros y recorren un camino más largo, por lo que salen más tarde.

  • Proteínas grandes no pueden entrar en los poros y salen primero.

• Hay una relación lineal entre el logaritmo del peso molecular y el volumen de salida.

Aplicación: Útil para separar proteínas de tamaños distintos y para determinar pesos moleculares.

3. Cromatografía de Afinidad

• Basada en interacciones altamente específicas entre una proteína y su ligando (ejemplo: enzima-sustrato, anticuerpo-antígeno).

• La fase estacionaria contiene un ligando unido a la resina que captura solo la proteína de interés.

• Para la elución se puede:

  • Agregar un exceso del ligando libre para desplazar la proteína.

  • Cambiar el pH o la fuerza iónica para debilitar la interacción.

Ejemplo: La purificación de anticuerpos usando proteína A, que se une a la región Fc de los anticuerpos.

Aplicación: Técnica muy selectiva y eficaz para aislar proteínas con un ligando conocido.

4. Cromatografía de Interacción Hidrofóbica

• Se basa en las interacciones hidrofóbicas entre proteínas y la resina.

• Se realiza a alta concentración de sales, lo que reduce la solubilidad de las regiones hidrofóbicas de las proteínas, haciéndolas interactuar con la resina.

• La elución se logra reduciendo la concentración de sales o cambiando la temperatura.

Aplicación: Se usa para purificar proteínas con regiones hidrofóbicas prominentes.

5. Cromatografía de Afinidad con Etiqueta His (His-tag)

• Se basa en la afinidad de residuos de histidina por iones metálicos como níquel o cobalto.

• La proteína de interés se modifica genéticamente para incluir una cola de seis histidinas (His-tag), que permite su unión a la resina con níquel.

• Se eluye con imidazol, que compite con la His-tag por el níquel y libera la proteína.

Aplicación: Técnica muy utilizada en la biotecnología para producir proteínas recombinantes.

6. Técnicas Complementarias para la Purificación de Proteínas

• Salting out (precipitación con sales): Se usa sulfato de amonio para reducir la solubilidad de las proteínas y hacerlas precipitar selectivamente.

• Precipitación con solventes orgánicos: Se emplea etanol o acetona para alterar la constante dieléctrica del solvente y reducir la solubilidad de proteínas.

• Diálisis: Se usa una membrana semipermeable para remover sales o intercambiar buffers.

• Ultrafiltración: Permite concentrar proteínas usando membranas con diferentes tamaños de poro.

1. Variaciones en Cromatografía de Afinidad con Níquel (Ni-NTA)

La cromatografía de afinidad con níquel es una técnica específica utilizada para purificar proteínas recombinantes con una etiqueta de histidina (His-tag). Existen varias modificaciones y optimizaciones para mejorar su eficiencia:

• IMAC (Cromatografía de Afinidad a Metales Inmovilizados): Usa iones metálicos como níquel (Ni²⁺), cobalto (Co²⁺), cobre (Cu²⁺) o zinc (Zn²⁺) para interactuar con residuos de histidina.

  • Ni-NTA (Nitrilotriacetato de Níquel): La más común, tiene una gran especificidad para las colas His-tag de proteínas recombinantes.

  • Co-Talon (Cobalto-IMAC): Más selectiva, con menor afinidad para proteínas no deseadas.

  • Cu-IMAC: Menos selectiva, pero útil para proteínas con múltiples histidinas naturales.

• Estrategias de elución:

  • Imidazol: Se usa en un gradiente para desplazar la proteína de interés.

  • Cambio de pH: Se puede disminuir el pH para debilitar la interacción de histidina con el níquel.

  • Competencia con agentes quelantes: Como EDTA, que remueve los iones metálicos.

Aplicación: Técnica estándar en biotecnología para purificación de proteínas recombinantes.

2. Cromatografía en Capa Fina (TLC - Thin Layer Chromatography)

Es un método de separación que utiliza una fase estacionaria sólida (placa de vidrio, aluminio o plástico recubierta con sílica gel, alúmina o celulosa) y una fase móvil líquida (solvente).

Procedimiento:

1. Se aplica una pequeña cantidad de muestra cerca del borde inferior de la placa.

2. Se sumerge la placa en un disolvente que asciende por capilaridad.

3. Las moléculas de la muestra se separan según su afinidad por la fase móvil y estacionaria.

4. Se revelan los compuestos con luz UV o reactivos químicos.

Tipos de detección:

• Luz UV: Para compuestos fluorescentes.

• Reactivos químicos: Como ninhidrina (detecta aminoácidos) o anisaldehído.

Aplicación:

• Análisis de pureza de compuestos.

• Separación rápida de mezclas en química orgánica y bioquímica.

• Identificación de metabolitos y lípidos.

3. Cromatografía en Columna

Es una técnica ampliamente utilizada en laboratorios de bioquímica para purificar proteínas, péptidos y otros biomoléculas. Se basa en el paso de una fase móvil líquida a través de una fase estacionaria empacada en una columna.

Tipos de cromatografía en columna:

• Columna de Sílice (Cromatografía de adsorción clásica): Se usa para separar compuestos orgánicos.

• Columna de Gel (Filtración por tamaño): Separa biomoléculas según su tamaño molecular.

• Columna de Intercambio Iónico: Retiene moléculas según su carga eléctrica.

• Columna de Afinidad: Se basa en interacciones altamente específicas (enzima-sustrato, anticuerpo-antígeno, etc.).

• HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Resolución):

  • Reversa (RP-HPLC): Se usa para moléculas hidrofóbicas (fase estacionaria apolar y fase móvil polar).

  • Normal (NP-HPLC): Fase estacionaria polar y fase móvil apolar.

Aplicación:

• Separación de proteínas y péptidos.

• Purificación de compuestos en investigación farmacéutica.

• Análisis de metabolitos en bioquímica clínica.

Preguntas Tipo Examen sobre Técnicas Cromatográficas

Preguntas de Opción Múltiple

1. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre la cromatografía de exclusión por tamaño es correcta?
a) Las moléculas más grandes eluyen más tarde porque quedan atrapadas en los poros de la matriz.
b) Se basa en interacciones electrostáticas entre la fase móvil y la fase estacionaria.
c) Las moléculas pequeñas entran en los poros de la matriz y recorren un trayecto más largo, eluyendo más tarde.
d) Solo se puede usar para separar proteínas, no otros tipos de biomoléculas.

Respuesta:
c) Las moléculas pequeñas ingresan en los poros de la matriz y recorren un trayecto más largo, por lo que eluyen más tarde.

2. En la cromatografía de afinidad con níquel (Ni-NTA), la proteína de interés es eludida típicamente con:
a) Imidazol
b) SDS
c) Sulfato de amonio
d) Beta-mercaptoetanol

Respuesta:
a) El imidazol compite con la histidina de la proteína, desplazándola de la columna.

3. ¿Cuál es la principal fuerza que permite la separación en la cromatografía de intercambio iónico?
a) Diferencias en el peso molecular
b) Interacciones hidrofóbicas
c) Cargas eléctricas de las moléculas
d) Diferencias en la solubilidad en solventes polares

Respuesta:
c) En la cromatografía de intercambio iónico, las moléculas se separan según su carga eléctrica y la interacción con la resina cargada de la columna.

Preguntas de Desarrollo Corto

4. Explique la diferencia entre cromatografía en fase reversa (RP-HPLC) y cromatografía en fase normal (NP-HPLC).

Respuesta:

• RP-HPLC (Fase Reversa): Usa una fase estacionaria hidrofóbica (apolar, como sílice modificada con grupos C18) y una fase móvil más polar (agua con metanol o acetonitrilo). Se emplea para separar compuestos hidrofóbicos.

• NP-HPLC (Fase Normal): Usa una fase estacionaria polar (como sílice sin modificar) y una fase móvil apolar (hexano, cloroformo). Se usa para separar compuestos polares.

5. ¿Por qué la cromatografía de afinidad es una de las técnicas más selectivas para purificar proteínas?

Respuesta:
La cromatografía de afinidad se basa en interacciones altamente específicas entre una proteína y un ligando inmovilizado en la columna. Esto permite la captura eficiente de la proteína de interés mientras que las impurezas pasan sin retenerse. La elución se realiza con cambios en el pH, concentraciones de sales o agregando un exceso de ligando libre para desplazar la proteína de la columna.

Preguntas de Desarrollo Largo

6. Compare y contraste la cromatografía de exclusión por tamaño y la cromatografía de interacción hidrofóbica. Incluya principios, aplicaciones y ventajas/desventajas de cada una.

Respuesta:

7. Usted está trabajando en un laboratorio de biotecnología y debe purificar una proteína de interés que tiene un peso molecular de 50 kDa, carga neta negativa a pH fisiológico y una etiqueta His-tag. ¿Qué combinación de técnicas usaría para obtener la proteína con alta pureza? Justifique su respuesta.

Respuesta:

1. Cromatografía de Afinidad con Níquel (Ni-NTA): La proteína tiene una etiqueta His-tag, por lo que puede purificarse selectivamente usando una resina con Ni²⁺. Se eluye con imidazol.

2. Cromatografía de Intercambio Iónico: La proteína es negativa a pH fisiológico, por lo que puede purificarse con una columna de intercambio aniónico. Se eluye aumentando la concentración de sal.

3. Cromatografía de Exclusión por Tamaño: Para eliminar agregados y refinar la pureza final.

Esta combinación permite obtener una proteína con alta pureza y bioactividad.

8. Un investigador está analizando una muestra con proteínas de diferentes pesos moleculares: 10 kDa, 20 kDa, 50 kDa, 100 kDa y 200 kDa. Utiliza cromatografía de exclusión por tamaño. ¿En qué orden eluirán estas proteínas y por qué?

Respuesta:
En la cromatografía de exclusión por tamaño, las proteínas más grandes no ingresan en los poros de la matriz y eluyen primero, mientras que las más pequeñas quedan atrapadas en la matriz y eluyen más tarde.

Orden de elución (de primero a último):

1. 200 kDa (más grande, eluye primero)

2. 100 kDa

3. 50 kDa

4. 20 kDa

5. 10 kDa (más pequeña, eluye última)

Este principio se basa en la relación entre el volumen de exclusión y el tamaño de las proteínas.

1. Métodos de Concentración y Eliminación de Sales

• Diálisis: Se usa una membrana semipermeable con microporos que permite el paso de moléculas pequeñas como sales e iones, pero no de proteínas grandes. Se busca equilibrar la concentración de sales con el solvente externo.

• Ultrafiltración: Se emplean membranas con poros de distinto tamaño para concentrar proteínas o eliminar sales. Al centrifugar, las moléculas pequeñas atraviesan la membrana, mientras que las proteínas más grandes quedan retenidas.

• Concentración con polímeros inertes: Se utiliza polietilenglicol (PEG) para extraer agua de la muestra, reduciendo su volumen y aumentando la concentración de proteínas.

2. Criterios de Pureza

• Un solo pico de absorbancia a 280 nm en cromatografía.

• Una sola banda en gel de electroforesis.

• Espectrometría de masas mostrando una única proteína.

• Pureza mayor al 90-98%.

3. Métodos de Análisis de Proteínas

• SDS-PAGE: Técnica de electroforesis en gel que separa proteínas según su peso molecular. Se usa un detergente (SDS) que las recubre de carga negativa para que migren proporcionalmente a su tamaño.

• Isoelectroenfoque (IEF): Separa proteínas según su punto isoeléctrico (pI), moviéndolas en un gradiente de pH hasta que su carga neta sea cero.

• Electroforesis bidimensional (2D-PAGE): Combina IEF y SDS-PAGE para separar proteínas tanto por carga como por tamaño.

4. Técnicas de Detección y Visualización

• Tinción con azul de Coomassie: Se usa para detectar proteínas en gel de poliacrilamida.

• Tinción de plata: Más sensible que Coomassie, adecuada para proteínas en baja concentración.

• Western Blot: Se transfiere la proteína a una membrana y se detecta con anticuerpos específicos.

5. Técnicas Avanzadas

• Zimograma: Se evalúa la actividad enzimática en geles nativos sin desnaturalización.

• Espectrometría de masas (MALDI-TOF): Determina la relación masa/carga de proteínas ionizadas en fase gaseosa, permitiendo su identificación precisa.

Aquí tienes algunas preguntas de desarrollo sobre purificación y análisis de proteínas, junto con sus respuestas detalladas:

1. Explica el principio de la diálisis y su utilidad en la purificación de proteínas.

Respuesta:
La diálisis es una técnica de purificación de proteínas basada en el uso de una membrana semipermeable que permite el paso de moléculas pequeñas como sales e iones, mientras retiene macromoléculas como las proteínas. Se sumerge una bolsa de diálisis con la muestra en un solvente de diferente composición iónica, permitiendo la difusión de los solutos hasta alcanzar el equilibrio.
Utilidad:

• Remueve sales o compuestos pequeños de una solución proteica.

• Permite el intercambio de buffers sin afectar la estructura de la proteína.

• Se usa antes de etapas de concentración o cromatografía para evitar interferencias.

2. ¿Cómo funciona la electroforesis en gel SDS-PAGE y qué información proporciona?

Respuesta:
SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio) separa proteínas según su peso molecular. SDS es un detergente que desnaturaliza las proteínas y las recubre con carga negativa, eliminando la influencia de su carga nativa. Al aplicar un campo eléctrico, las proteínas migran a través de la malla del gel, donde las de menor peso molecular avanzan más rápido que las de mayor peso.
Información que proporciona:

• Peso molecular estimado de la proteína.

• Pureza de la muestra, observando si hay una sola banda o varias.

• Comparación con estándares de peso molecular para identificar proteínas desconocidas.

3. ¿Qué diferencia hay entre electroforesis en gel nativo (Native PAGE) y SDS-PAGE?

Respuesta:

• Native PAGE separa proteínas en su estado nativo, sin desnaturalizarlas, permitiendo que mantengan su estructura y actividad enzimática. La migración depende tanto del tamaño como de la carga de la proteína.

• SDS-PAGE desnaturaliza las proteínas y las recubre con SDS, eliminando la influencia de su carga nativa y separándolas solo por peso molecular.

Aplicaciones:

• Native PAGE se usa cuando se necesita estudiar la funcionalidad o interacciones de proteínas.

• SDS-PAGE se usa principalmente para análisis de pureza y determinación de peso molecular.

4. Explica cómo funciona el Western Blot y su importancia en la detección de proteínas específicas.

Respuesta:
El Western Blot es una técnica de detección de proteínas basada en SDS-PAGE y transferencia a una membrana de nitrocelulosa o PVDF, donde se incuban anticuerpos específicos para la proteína de interés. Se realiza en los siguientes pasos:

1. Separación por SDS-PAGE.

2. Transferencia a membrana mediante electrotransferencia.

3. Bloqueo de la membrana con proteínas inespecíficas (leche o caseína) para evitar interacciones no deseadas.

4. Incubación con un anticuerpo primario que reconoce la proteína específica.

5. Incubación con un anticuerpo secundario acoplado a una enzima que permite su detección (quimioluminiscencia o colorimetría).

6. Revelado y análisis de la banda detectada.

Importancia:

• Permite detectar proteínas específicas en una mezcla compleja.

• Se usa en diagnóstico clínico, investigación biomédica y control de calidad en biotecnología.

5. Describe el principio del isoelectroenfoque (IEF) y su aplicación en electroforesis bidimensional (2D-PAGE).

Respuesta:
El isoelectroenfoque (IEF) separa proteínas según su punto isoeléctrico (pI) en un gradiente de pH aplicado en un gel. Las proteínas migran en respuesta a un campo eléctrico hasta alcanzar el pH donde su carga neta es cero, momento en el que dejan de moverse.
En electroforesis bidimensional (2D-PAGE), primero se separan proteínas por carga (IEF) y luego por peso molecular (SDS-PAGE) en una segunda dimensión.
Aplicaciones:

• Análisis proteómico detallado.

• Identificación de proteínas con el mismo peso molecular pero diferente carga.

• Estudio de modificaciones post-traduccionales.

6. ¿Qué criterios se utilizan para determinar la pureza de una proteína?

Respuesta:
La pureza de una proteína se evalúa mediante varios criterios experimentales:

• Un solo pico en cromatografía de exclusión molecular o intercambio iónico.

• Una sola banda en SDS-PAGE tras tinción con Coomassie o plata.

• Espectrometría de masas (MS), que muestra un solo pico asociado a la proteína de interés.

• Pureza cuantificada en términos de porcentaje (>90%, >95%, >98%).

7. ¿Cómo funciona la espectrometría de masas (MALDI-TOF) en la identificación de proteínas?

Respuesta:
MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization – Time of Flight) es una técnica de espectrometría de masas que permite identificar proteínas midiendo la relación masa/carga (m/z) de sus fragmentos ionizados.
Proceso:

1. La muestra se mezcla con una matriz que absorbe energía láser.

2. Un láser ioniza la muestra, convirtiéndola en fase gaseosa.

3. Los iones aceleran en un campo eléctrico y su tiempo de vuelo (TOF) hasta el detector depende de su masa.

4. Se genera un espectro con picos que corresponden a fragmentos peptídicos.

Aplicaciones:

• Identificación de proteínas en proteómica.

• Determinación de peso molecular con alta precisión.

• Análisis de modificaciones post-traduccionales.

8. Explica cómo la ultrafiltración permite la concentración de proteínas y eliminación de sales.

Respuesta:
La ultrafiltración usa membranas con poros de un tamaño determinado para retener proteínas grandes y permitir el paso de solutos pequeños.

• Para concentrar proteínas: Se centrifuga la muestra en un tubo con membrana, forzando la salida del solvente y aumentando la concentración proteica.

• Para eliminar sales: Se reemplaza gradualmente el solvente con agua o un buffer sin sal, reduciendo su concentración por dilución y filtración.

Ventajas:

• Método rápido y eficiente.

• No requiere aditivos químicos que puedan alterar la proteína.

• Se puede combinar con otras técnicas de purificación.