5) cytoskelet

Funkční organizace buněk

• Paměťový systém

  • systém nukleových kyselin a proteinů (uchování a exprese genetické informace)

  • všechny typy buněk

• Membránový systém

  • systém biomembrán (tok látek, energie a informace)

  • všechny typy buněk (kvantitativní rozdíly)

• Cytoskeletální systém

  • systém vláknitých proteinových struktur (pohyb, prostorová organizace, komunikace)

  • eukaryontní buňky, analogie u prokaryot

Program přednášky:

• Komponenty a základní funkce cytoskeletu

• Vizualizace cytoskeletu

• Mikrotubuly

• Aktinová filamenta

• Intermediární filamenta

• Jaderný a membránový skelet

• Cytoskelet v prokaryontních buňkách

KOMPONENTY A ZÁKLADNÍ FUNKCE CYTOSKELETU

• U EUKARYOT

• aktinová filamenta (7 nm)

• intermediární filamenta (10 nm)

• mikrotubuly (25 nm)

• (jen u živočichů)

Funkce cytoskeletu:

• Morfologické / strukturní

  • tvar buněk včetně cytoplazmatických protruzí

  • odolnost vůči vnějším mechanickým vlivům

  • vnitřní organizace buňky

• Pohybové

  • intracelulární transport

  • pohyb chromosomů v anafázi

  • pohyb buněk po substrátu

  • pohyb buněk pomocí kinocilií

  • svalová kontrakce

VIZUALIZACE CYTOSKELETU

• Obvyklé metody vizualizace cytoskeletu

  • Mikroskopie v temném poli (DF)

  • klasická fluorescenční mikroskopie

  • konfokální mikroskopie

  • Značení fixovaných buněk:

    • fluorescenčně značená protilátka (přímá a nepřímá imunofluorescence)

    • phalloidin (alkaloid z Amanita phalloides) konjugovaný s fluorochromem - přímé značení AF (tzv. F-aktin)

  • Značení živých buněk:

    • GFP a jeho deriváty

Fluorescenční mikroskopie

• temné pole (dark-field, DF)

• excitační a emisní filtry

• barviva - fluorochromy

  • fluorescein (FITC), Cy3

  • rhodamin (TRITC), Cy5, Texas Red, ethidium bromid (EB), propidium jodid (PI)

  • kumariny, DAPI, bisbenzimid (Hoechst)

  • komerční: AlexaTM aj.

a-tubulin / F-aktin / DNA

Konfokální mikroskopie

Cytoskelet: animace z jednotlivých rovin ostrosti

Cytoskelet v myším fibroblastu: složený snímek

• a-tubulin / F-aktin / DNA

Imunofluorescence

• fluorochrom

• fluorochrom

• sekundární protilátka

• primární protilátka

• primární protilátka

• epitop

• epitop

• antigen

• antigen

• přímá

• nepřímá

• a-tubulin / F-aktin / DNA

Phalloidin

• toxin z Amanita phalloides

• mechanismus působení:

  • vazba na F-aktin, stabilizace filament

  • využití k vizualizaci aktinových filament – nutnost konjugovat molekulu s fluorochromem

• phalloidin - rhodamin

• phalloidin - fluorescein

GFP = Green Fluorescent Protein

Barevné modifikace GFP → YFP, RFP...

Růst mikrotubulů v rostlinných buňkách (lotos)

• GFP fúzováno s a-tubulinem

MIKROTUBULY

Mikrotubulární struktury v buňkách:

• síť cytoplazmatických mikrotubulů

• mitotický aparát (dělicí vřeténko)

• MTOC (mikrotubuly organizující centrum)

• kinocilie (primární cilie, řasinky, bičíky) živočišné buňky

• Funkce mikrotubulů:

  • intracelulární transport buněčných struktur

  • pohyb chromozomů při mitóze (meióze)

  • pohyb buněk pomocí kinocilií

  • tvorba axonů a axonový transport

Stavba mikrotubulů (MT)

• tubulin:

  • v MT heterodimer: a a b podjednotky

  • g-tubulin (pouze v MTOC)

  • MTOC = mikrotubuly organizující centrum (centrosom, bazální tělíska)

  • polarizace mikrotubulů: + a – konec

Struktura mikrotubulu:

• v mikrotubulu po obvodu

  • 13 protofilament

  • pravidelné střídání a a b podjednotky

MTOCs (Microtubule Organizing Centers)

• živočišná buňka – centrosom:

  • 2 centrioly + PCM (pericentriolární materiál)

  • struktura centriolu:

    • 9 fibril (svazky 3 MT: A, B, C), 1 centrální MT

Proteiny asociované s mikrotubuly

• Nemotorové

  • MAPs (Microtubule Associated Proteins)

    • MAP-1, MAP-2, ...

    • tau-protein

• Motorové

  • ATP-ázová aktivita

    • dyneiny (pohyb od + konce k – konci)

    • kinesiny (pohyb od – konce k + konci)

Motorové proteiny asociované s MT

Pohyb pomocí kinocilií

• struktura kinocilie:

  • princip 9+2 (dublety: 13+10 protofilament)

  • změna konformace dyneinových ramen

Pohyb kinocilie

Typy kinocilií

• řasinky

• bičíky

Primární cilie

• senzorická organela, účast v mezibuněčné signalizaci

• organizační princip 9+0 (nepohyblivá)

AKTINOVÁ FILAMENTA (MIKROFILAMENTA)

Aktinové struktury v buňkách:

• síť aktinových filament v cytoplazmě

• membránový skelet (buněčný kortex)

• stresová vlákna

• Živočišné buňky:

  • formování cytoplazmatických protruzí:

    • microvilli (= mikroklky)

    • lamellipodia, filopodia

    • kontraktilní prstenec (ring)

Stavba aktinových filament (AF)

• aktin:

  • cca 5% všech buněčných proteinů

  • G-aktin (globulární aktin)

    • nepolymerizovaná forma aktinu (zásobní pool v cytoplazmě)

  • F-aktin (fibrilární aktin)

    • polymerizovaný aktin - helikální struktura

    • molekuly (2 navzájem se obtáčející vlákna)

    • AF tenčí, pružnější, kratší (ve srovnání s MT)

    • celková délka AF v buňce ~30x větší (ve srovnání s MT)

Větvení AF - ARP proteiny

Typy aktinových struktur v živočišných buňkách

• A. microvilli (mikroklky)

• B. stresová vlákna

• C. lamellipodia, filopodia

• D. kontraktilní prstenec

microvilli

lamellipodia, filopodia

Stresová vlákna v živočišné buňce

• F-aktin

Neonatální fibroblasty

• F-aktin / DNA

Kořenový meristém kukuřice

• F-aktin

Larva drozofily, III. instar

• F-aktin

Funkce aktinových filament:

• cytokineze (kontraktilní prstenec = ring)

• fagocytóza

• lokomoce (stresová vlákna, lamellipodia)

• interakce buněk se substrátem (fokální adheze)

• změny tvaru buňky (lamellipodia, filopodia)

• růst axonů při vytváření nervových synapsí

• zvětšení buněčného povrchu

• mikroklky (microvilli) - střevní epitel

• světločivné výběžky - tyčinky sítnice

• perforace vajíčka při fertilizaci (polymerace aktinu v akrosomech)

Nemotorové asociované proteiny:

• polymerace a prostorové uspořádání AF

• nukleační proteiny: actin related proteins = ARPs

Proteiny zajišťující pool G-aktinu:

• thymosiny

Proteiny regulující délku AF blokováním jednoho konce vlákna:

• b-aktinin

• Cap Z protein

• capping protein

Proteiny stimulující polymeraci:

• profilin

Proteiny depolymerující AF:

• cofilin

• ADF

• depactin

Proteiny spojující AF:

• filamin

• ABP

• gelactin

• villin

• fascin

• a-aktinin

Proteiny schopné štěpit AF:

• gelsolin

• brevin

Motorové asociované proteiny:

• pohybové funkce AF

• myosiny

  • konvenční (typ II)

    • cytokineze, svalová kontrakce

  • nekonvenční (typ I, III až XV)

    • pohyb membránových veziklů v blízkosti plazmatické membrány

    • tvorba vnitřní struktury protruzí plazmatické membrány

Konformační změna myosinu

Pohyb pomocí AF (améboidní pohyb)

Polymerace aktinu v leading edge (u buněk pohybujících se po podkladu)

Princip svalové kontrakce

F-aktin / myosin

INTERMEDIÁRNÍ FILAMENTA

Stavba intermediárních filament (IF)

• pouze v živočišných buňkách

• stavební protein se liší podle histogenetického typu tkáně

• fibrilární molekula, vždy IF-doména na N-konci

• homodimery nebo heterodimery

• tetramery → protofilamentum

• vlákno 10 nm = 8 protofilament (rope-like struktura)

Živočišné buňky - buněčná linie Ptk2

• cytokeratin

Funkce intermediárních filament:

• zvýšení odolnosti buňky vůči mechanickému poškození

• determinace tvaru buňky, lokalizace organel

• integrace komponent cytoskeletu

Třídy intermediárních filament:

• (I) a (II) cytokeratiny

  • epiteliální buňky

  • AP: filagrin, plectin, dermoplakin

• (III) vimentin, desmin, GFAP, synemin, peripherin

  • pojivová tkáň, svalové buňky, neuroglie

  • AP: plectin, filensin, epinemin, paranemin

• (IV) neurofilamenta, a-internexin

  • neurony

  • AP: plectin

• [(V) jaderné laminy]

• (VI) nestin

  • neuronální kmenové buňky, nádorově transformované buňky, endotelie

JADERNÝ A MEMBRÁNOVÝ SKELET

Jaderný skelet (nukleoskelet):

• Soustava proteinů uvnitř jádra

• vlákna o průměru 3-5 nm - matrixin (matricin) a sekundární proteiny matrix

• jadérkový skelet - nukleolin

• Fibrózní vrstva/lamela (nuclear lamina) připojena k vnitřní straně jaderného obalu

• laminy (třída V IF):

  • lamin B - připojení fibrózní vrstvy na integrální proteiny vnitřní membrány jaderného obalu

  • laminy A a C - připojení interfázních chromosomů

Fibrózní vrstva jaderného skeletu

Membránový skelet (kortex):

• vnitřní strana plazmatické membrány na povrchu buněk (zejm. živočišné buňky)

• spektrin - erytrocyty

• fodrin (nonerytroidní spektrin) - ostatní typy buněk

• asociované proteiny:

  • ankyrin - připojení k transmembránovým proteinům

  • protein 4.1. - připojení na oligomery aktinu

• Funkce:

  • udržování tvaru buňky - erytrocyty

  • změny tvaru, lokomoce - ostatní typy

CYTOSKELET V PROKARYONTNÍCH BUŇKÁCH

Protein FtsZ:

• ortolog tubulinu u prokaryot

• ve střední části buňky vytváří prstencovitou strukturu = Z-ring , která se účastní buněčného komponenty a základní funkce cytoskeletu; metody vizualizace cytoskeletu; mikrotubuly; aktinová filamenta; intermediární filamenta; jaderný a kortikální skelet; cytoskelet u prokaryot

• Funkční organizace buněk

  • Paměťový systém

    • systém nukleových kyselin a proteinů (uchování a exprese genetické informace)

    • všechny typy buněk

  • Membránový systém

    • systém biomembrán (tok látek, energie a informace)

    • všechny typy buněk (kvantitativní rozdíly)

  • Cytoskeletální systém

    • systém vláknitých proteinových struktur (pohyb, prostorová organizace, komunikace)

    • eukaryontní buňky, analogie u prokaryot

• KOMPONENTY A ZÁKLADNÍ FUNKCE CYTOSKELETU U EUKARYOT

  • aktinová filamenta (7 nm)

  • intermediární filamenta (10 nm, jen u živočichů)

  • mikrotubuly (25 nm)

  • (jen u živočichů)

• Funkce cytoskeletu:

  • Morfologické / strukturní

    • tvar buněk včetně cytoplazmatických protruzí

    • odolnost vůči vnějším mechanickým vlivům

    • vnitřní organizace buňky

  • Pohybové

    • intracelulární transport

    • pohyb chromosomů v anafázi

    • pohyb buněk po substrátu

    • pohyb buněk pomocí kinocilií

    • svalová kontrakce

VIZUALIZACE CYTOSKELETU

• Obvyklé metody vizualizace cytoskeletu

  • Mikroskopie v temném poli (DF)

    • klasická fluorescenční mikroskopie

    • konfokální mikroskopie

  • Značení fixovaných buněk:

    • fluorescenčně značená protilátka (přímá a nepřímá imunofluorescence)

    • phalloidin (alkaloid z Amanita phalloides) konjugovaný s fluorochromem - přímé značení AF (tzv. F-aktin)

  • Značení živých buněk:

    • GFP a jeho deriváty

• Fluorescenční mikroskopie

  • temné pole (dark-field, DF)

  • excitační a emisní filtry

  • barviva - fluorochromy

    • fluorescein (FITC), Cy3

    • rhodamin (TRITC), Cy5, Texas Red, ethidium bromid (EB), propidium jodid (PI)

    • kumariny, DAPI, bisbenzimid (Hoechst)

    • komerční: AlexaTM aj.

• a-tubulin / F-aktin / DNA

• Konfokální mikroskopie

• Cytoskelet: animace z jednotlivých rovin ostrosti

• Cytoskelet v myším fibroblastu: složený snímek

  • a-tubulin / F-aktin / DNA

• Imunofluorescence

• Phalloidin

  • toxin z Amanita phalloides

  • mechanismus působení:

    • vazba na F-aktin, stabilizace filament

  • využití k vizualizaci aktinových filament – nutnost konjugovat molekulu s fluorochromem

• GFP = Green Fluorescent Protein

• Barevné modifikace GFP → YFP, RFP...

• Růst mikrotubulů v rostlinných buňkách (lotos)

  • GFP fúzováno s a-tubulinem

MIKROTUBULY

• Mikrotubulární struktury v buňkách:

  • síť cytoplazmatických mikrotubulů

  • mitotický aparát (dělicí vřeténko)

  • MTOC (mikrotubuly organizující centrum)

  • kinocilie (primární cilie, řasinky, bičíky) živočišné buňky

• Funkce mikrotubulů:

  • intracelulární transport buněčných struktur

  • pohyb chromozomů při mitóze (meióze)

  • pohyb buněk pomocí kinocilií

  • tvorba axonů a axonový transport

• Stavba mikrotubulů (MT)

  • tubulin:

    • v MT heterodimer: α a β podjednotky

    • γ-tubulin (pouze v MTOC)

    • MTOC = mikrotubuly organizující centrum (centrosom, bazální tělíska)

    • polarizace mikrotubulů: + a – konec

• Struktura mikrotubulu:

  • v mikrotubulu po obvodu

    • 13 protofilament

    • pravidelné střídání α a β podjednotky

• MTOCs (Microtubule Organizing Centers)

  • živočišná buňka – centrosom:

    • 2 centrioly + PCM (pericentriolární materiál)

    • struktura centriolu:

      • 9 fibril (svazky 3 MT: A, B, C), 1 centrální MT

• Proteiny asociované s mikrotubuly

  • Nemotorové

    • MAPs (Microtubule Associated Proteins)

      • MAP-1, MAP-2, ...

    • tau-protein

  • Motorové

    • ATP-ázová aktivita

      • dyneiny (pohyb od + konce k – konci)

      • kinesiny (pohyb od – konce k + konci)

• Motorové proteiny asociované s MT

• Pohyb pomocí kinocilií

  • struktura kinocilie:

    • princip 9+2 (dublety: 13+10 protofilament)

  • změna konformace dyneinových ramen

• Pohyb kinocilie

• Typy kinocilií

  • řasinky

  • bičíky

• Primární cilie

  • senzorická organela, účast v mezibuněčné signalizaci

  • organizační princip 9+0 (nepohyblivá)

• AKTINOVÁ FILAMENTA (MIKROFILAMENTA)

• Aktinové struktury v buňkách:

  • síť aktinových filament v cytoplazmě

  • membránový skelet (buněčný kortex)

  • stresová vlákna - stabilizují buňku ve směru pohybu

  • Živočišné buňky:

    • formování cytoplazmatických protruzí:

      • microvilli (= mikroklky)

      • lamellipodia, filopodia

    • kontraktilní prstenec (ring)

• Stavba aktinových filament (AF)

  • aktin:

    • cca 5% všech buněčných proteinů

    • G-aktin (globulární aktin)

      • nepolymerizovaná forma aktinu (zásobní pool v cytoplazmě)

    • F-aktin (fibrilární aktin)

      • polymerizovaný aktin - helikální struktura

      • molekuly (2 navzájem se obtáčející vlákna)

    • AF tenčí, pružnější, kratší (ve srovnání s MT)

    • celková délka AF v buňce ~30x větší (ve srovnání s MT)

• Větvení AF - ARP proteiny

• Typy aktinových struktur v živočišných buňkách

  • A. microvilli (mikroklky)

  • B. stresová vlákna

  • C. lamellipodia, filopodia

  • D. kontraktilní prstenec

• Funkce aktinových filament:

  • cytokineze (kontraktilní prstenec = ring)

  • fagocytóza

  • lokomoce (stresová vlákna, lamellipodia)

  • interakce buněk se substrátem (fokální adheze)

  • změny tvaru buňky (lamellipodia, filopodia)

  • růst axonů při vytváření nervových synapsí

  • zvětšení buněčného povrchu

    • mikroklky (microvilli) - střevní epitel

    • světločivné výběžky - tyčinky sítnice

  • perforace vajíčka při fertilizaci (polymerace aktinu v akrosomech)

• Nemotorové asociované proteiny:

  • polymerace a prostorové uspořádání AF

  • nukleační proteiny: actin related proteins = ARPs

• Proteiny zajišťující pool G-aktinu:

  • thymosiny

• Proteiny regulující délku AF blokováním jednoho konce vlákna:

  • b-aktinin

  • Cap Z protein

  • capping protein

• Proteiny stimulující polymeraci:

  • profilin

• Proteiny depolymerující AF:

  • cofilin

  • ADF

  • depactin

• Proteiny spojující AF:

  • filamin

  • ABP

  • gelactin

  • villin

  • fascin

  • a-aktinin

• Proteiny schopné štěpit AF:

  • gelsolin

  • brevin

• Motorové asociované proteiny:

  • pohybové funkce AF

  • myosiny

    • konvenční (typ II)

      • cytokineze, svalová kontrakce

    • nekonvenční (typ I, III až XV)

    • tvorba vnitřní struktury protruzí plazmatické membrány

    • pohyb membránových veziklů v blízkosti plazmatické membrány

    • tropomyosin, troponin

• Konformační změna myosinu

• Pohyb pomocí AF (améboidní pohyb)

• Polymerace aktinu v leading edge (u buněk pohybujících se po podkladu)

• Princip svalové kontrakce

• F-aktin / myosin

• INTERMEDIÁRNÍ FILAMENTA

• Stavba intermediárních filament (IF)

  • pouze v živočišných buňkách

  • stavební protein se liší podle histogenetického typu tkáně

  • fibrilární molekula, vždy IF-doména na N-konci (můžou se spojovat různé stavební proteiiny)

  • homodimery nebo heterodimery

  • tetramery → protofilamentum

  • vlákno 10 nm = 8 protofilament (rope-like struktura - mimořádná pevnost)

• Funkce intermediárních filament:

  • zvýšení odolnosti buňky vůči mechanickému poškození

  • determinace tvaru buňky, lokalizace organel

  • integrace komponent cytoskeletu

• Třídy intermediárních filament:

  • (I) a (II) cytokeratiny

    • epiteliální buňky

    • AP: filagrin, plectin, dermoplakin

  • (III) vimentin, desmin, GFAP, synemin, peripherin

    • pojivová tkáň, svalové buňky, neuroglie

    • AP: plectin, filensin, epinemin, paranemin

  • (IV) neurofilamenta, a-internexin

    • neurony

    • AP: plectin

  • [(V) jaderné laminy]

  • (VI) nestin

    • neuronální kmenové buňky, nádorově transformované buňky, endotelie

JADERNÝ A MEMBRÁNOVÝ SKELET

• Jaderný skelet (nukleoskelet):

  • Soustava proteinů uvnitř jádra

  • vlákna o průměru 3-5 nm - matrixin (matricin) a sekundární proteiny matrix

  • jadérkový skelet - nukleolin

  • Fibrózní vrstva/lamela (nuclear lamina) připojena k vnitřní straně jaderného obalu

  • laminy (třída V IF):

    • lamin B - připojení fibrózní vrstvy na integrální proteiny vnitřní membrány jaderného obalu

    • laminy A a C - připojení interfázních chromosomů

• Fibrózní vrstva jaderného skeletu

• Membránový skelet (kortex):

  • vnitřní strana plazmatické membrány na povrchu buněk (zejm. živočišné buňky)

  • spektrin - erytrocyty

  • fodrin (nonerytroidní spektrin) - ostatní typy buněk

  • asociované proteiny:

    • ankyrin - připojení k transmembránovým proteinům

    • protein 4.1. - připojení na oligomery aktinu

  • Funkce:

    • udržování tvaru buňky - erytrocyty

    • změny tvaru, lokomoce - ostatní typy

CYTOSKELET V PROKARYONTNÍCH BUŇKÁCH

• Protein FtsZ:

  • ortolog tubulinu u prokaryot

  • ve střední části buňky vytváří prstencovitou strukturu = Z-ring , která se účastní buněčného dělení

  • (vs. eukaryota: aktin/myosin)

• Proteiny MreB, MbI, MreBH:

  • ortology aktinu u prokaryot

  • podílejí se na udržování tvaru buňky zejména u G- bakterií (Escherichia coli, Bacillus subtilis atd.)

  • vytvářejí dvojitá filamenta (paralelní nebo helikální) lokalizovaná v blízkosti plazmatické membrány

• Protein CreS:

  • homolog proteinů IF u eukaryot

  • tvorba denzní sítě v cytoplazmě v blízkosti p-chromosomu

  • Caulobacter crescentus, Helicobacter pylori

• CreS / DNA