Polimerazinė grandininė reakcija (PGR) ir elektroforezė

Polimerazinė grandininė reakcija (PGR) ir elektroforezė

Polimerazinė grandininė reakcija

  • PGR - DNR replikacijos procesas in vitro. Jo metu gaunami milijonai dominančio DNR regiono kopijų

  • Polimerazė - PGR dalyvaujantis fermentas

  • Thermus aquaticus (Taq)- karštuose šaltiniuose gyvenanti bakterija, iš kurios išskiriama polimerazė

  • Reakcijoje naudojama aukštai temperatūrai atspari polimerazė

Reakcijos dalys

  1. DNR grandinė - pradinis DNR šablonas, kurio informacija bus naudojama sintetinant naujus DNR fragmentus

  2. DNR polimerazė - DNR replikaciją vykdantis fermentas

  3. Pradmenys - trumpi DNR fragmentai, komplimentarūs DNR šablonui ir duodantys pradžia polimerazei prisijungti

  4. Nukleotidai (dNTP) - statybinė medžiaga, kuriuos polimerazė jungia prie naujo DNR.

  5. Buferinė sistema - užtikrina pastovų reakcijos pH

  6. Termocikleris - prietaisas, kuris periodiškai keičia reakcijos tirpalo temperatūra

Image.heic

  • DNR denatūracijos etapo metu tirpalas kaitinamas iki 95 laipsnių. Dviguba spiralė suyra į viengrandes DNR grandines

  • To reikia, kad naujos pradmenų sekos galėtų prisijungti prie DNR

  • Pradmenų prisijungimo stadijoje svarbiausia, kad pradmenys stabiliai prisitvirtintų

  • Elongacijos metu polimerazė prisijungia prie pradmenų ir pagal DNR seką komplimentariai sintetina naują DNR

  • PGR reakcija kartojama 25-40 ciklų, kurių metu grandinių skaičius dvigubėja

Elektroforezė

  • Elektroforezė - DNR vizualizavimo metodas grindžiamas DNR fragmentų atsiskyrimu pagal jų molekulinį dydį bei krūvį, agarozės arba poliakrilamido gelyje

  • DNR molekulės dėl fosforo rūgštie liekanos yra anijonai (onions:c), todėl veikiant elektriniam laukui šios molekulės gelyja juda anodo link

  • DNR molekulės gali skirtis savo dydžiu, mažesni fragmentai juda greičiau

Reagentai

  • Agarozės milteliai

  • Buferis (pvz. TAE) - elektroforezės vonelei užpildyti

  • Fluorescencinis dažas - geliui nudažyti

  • Leidimo dažas - šulinėliams nudažyti

  • Masės žymuo - skirtas įvertinti gautų DNR fragmentų ilgį

Įranga

  • Mikrobangų krosnelė - agarozės milteliams ištirpinti

  • Elektroforezės aparatas

  • Transiluminatorius - UV šaltinis

  • Buferiniai tirpalai palaiko pastovią PH reikšmę

  • Jų tirpale esančios druskos užtikrina elektros laidumą

  • Dažniausiai naudojiami TBE ir TAE buferiniai tirpalai (tris bazė, boro arba ledinė acto rūgštis, EDTA druska)

  • Etidžio bromidas - mutagenas, todėl dirbant su juo reikia mūvėti pirštines

  • Masės standartas - žinomo ilgio DNR fragmentai. Jis skirtas identifikuoti tiriamųjų nukleorūščių ilgį, kai gauti fragmentai lyginami su žinomais

  • Elektroforezė pavykusi, jei atitinka vieną iš tam tikrų vaizdų

Image_1.heic

Image_2.heic

Image_3.heic

PGR ir elektroforezę galima naudoti:

  • nustatyti genetines ligas

  • nustatyti polinkį į ligas/savybes

  • nustatyti infekcines ligas

  • identifikuoti rūšį/organizmą/asmenį

  • identifikuoti biologinius vaiko tėvus