Sintesi proteica e duplicazione del DNA

Duplicazione del DNA 

La duplicazione del DNA, nota anche come replicazione del DNA, è il processo attraverso il quale il materiale genetico viene copiato prima della divisione cellulare. La duplicazione del DNA avviene in modo simile sia negli eucarioti che nei procarioti, ma ci sono alcune differenze nella complessità e nei dettagli del processo.

Replicazione del DNA nei Procarioti:

Origine di Replicazione:

Nei procarioti, come batteri e archaea, la replicazione del DNA inizia da un singolo punto chiamato "origine di replicazione."

Elicasi e Formazione della Bolla di Replicazione:

• L'enzima elicasi separa i filamenti di DNA alla regione dell'origine, formando una bolla di replicazione. Questa bolla si espande in entrambe le direzioni, creando le forche di replicazione.

Formazione di RNA Iniziatore (RNA Primer):

• Un breve tratto di RNA, chiamato primer, viene sintetizzato da un enzima chiamato primasi. Il primer fornisce un punto di partenza per l'enzima DNA polimerasi.

Sintesi del Nuovo Filamento di DNA:

• L'enzima DNA polimerasi sintetizza il nuovo filamento di DNA aggiungendo nucleotidi complementari al filamento template. La sintesi procede nella direzione 5' → 3' e avviene contemporaneamente su entrambi i lati della bolla di replicazione.

Unione dei Frammenti di Okazaki:

• Poiché la sintesi avviene in direzione 5' → 3', è necessario unire i frammenti di Okazaki (piccoli frammenti di RNA e DNA) sul filamento lagging. L'enzima ligasi svolge questo compito, unendo i frammenti in un'unica catena continua.

Terminazione:

• La replicazione termina quando le forche di replicazione si incontrano o raggiungono una specifica sequenza di terminazione. La bolla di replicazione si chiude, e il nuovo DNA viene completato.

Replicazione del DNA negli Eucarioti:

Origini di Replicazione Multiple:

• Negli eucarioti, che includono piante, animali e funghi, ci sono molte origini di replicazione lungo ogni cromosoma.

Complessità della Struttura:

• La replicazione negli eucarioti è più complessa rispetto a quella nei procarioti. Coinvolge più enzimi e complessi proteici, inclusi la DNA polimerasi, l'elicasi, le topoisomerasi, e altri.

Inizio della Replicazione:

• L'elicasi separa i filamenti di DNA, formando le forche di replicazione. L'RNA primase sintetizza brevi primer RNA per iniziare la sintesi del nuovo filamento di DNA.

Sintesi del Nuovo Filamento:

• La DNA polimerasi aggiunge nucleotidi complementari al filamento template. Tuttavia, diversi enzimi, come la DNA polimerasi δ e la DNA polimerasi ε, partecipano alla sintesi nei filamenti leading e lagging.

Unione e Rimozione dei Primer:

• L'RNA primase crea primer su entrambi i filamenti. Dopo la sintesi, gli enzimi RNAasi H e DNA polimerasi rimuovono gli RNA primer e li sostituiscono con nucleotidi di DNA.

Unione dei Frammenti di Okazaki:

• I frammenti di Okazaki sul filamento lagging vengono uniti dall'enzima ligasi.

Terminazione:

• La replicazione procede fino a quando le forche di replicazione raggiungono le regioni di terminazione. Le forche di replicazione si fondono, completando il processo di replicazione.

Trascrizione

La trascrizione inizia quando l'enzima RNA polimerasi riconosce e si lega a una specifica regione del DNA chiamata promotore. Il promotore contiene sequenze di nucleotidi che indicano all'RNA polimerasi dove iniziare la trascrizione.

2. Apertura della Doppia Elica:

L'RNA polimerasi avvia la separazione delle due eliche del DNA nella regione del promotore, formando una bolla di trascrizione. Questa apertura consente all'RNA polimerasi di accedere al filamento di DNA a singola elica.

3.Allungamento:

L'RNA polimerasi inizia a sintetizzare l'RNA complementare al filamento di DNA. L'enzima aggiunge nucleotidi complementari al filamento di DNA, seguendo le regole dell'appaiamento delle basi (A con U, T con A, G con C, C con G).

L'RNA polimerasi si muove lungo il filamento di DNA, continuando a sintetizzare l'RNA nella direzione 5' → 3'. Nel frattempo, il DNA viene ricostruito nella sua forma originale di doppia elica dietro l'RNA polimerasi.

4. Terminazione:

La trascrizione termina quando l'RNA polimerasi raggiunge una sequenza di terminazione nel DNA. Questa sequenza segnala all'enzima di rilasciare sia l'RNA appena sintetizzato che il DNA. La bolla di trascrizione si chiude, e il nuovo RNA, chiamato pre-mRNA, è pronto per subire ulteriori modifiche prima di diventare un mRNA maturo.

5. Modifiche Post-Trascrizionali:

Il pre-mRNA subisce una serie di modifiche post-trascrizionali nel nucleo prima di uscire verso il citoplasma. Queste modifiche includono la rimozione degli introni (segmenti non codificanti) e l'aggiunta di un cappuccio di guanosina all'estremità 5' e una coda di poliadenina all'estremità 3'. Queste modifiche sono essenziali per la stabilità, il trasporto e la traduzione dell'mRNA.

In conclusione, la trascrizione è un processo altamente regolato che traduce l'informazione genetica del DNA in molecole di RNA. Questo RNA, dopo le opportune modifiche post-trascrizionali, diventa l'mRNA, che fungerà da modello per la produzione di proteine durante la successiva fase di traduzione.

Modifiche post-trascrizionali

Le modifiche post-trascrizionali si verificano dopo la fase di trascrizione, quando l'RNA messaggero (mRNA) è stato sintetizzato, ma prima che l'mRNA matura lasci il nucleo cellulare. Queste modifiche sono essenziali per la stabilità, il trasporto e la funzione ottimale dell'mRNA, contribuendo così alla regolazione dell'espressione genica. Ecco alcune delle principali modifiche post-trascrizionali:

Addizione del Cappuccio 5':

L'estremità 5' dell'mRNA viene modificata attraverso l'addizione di un cappuccio di guanosina (G) in una configurazione inversa. Questo cappuccio protegge l'mRNA dalla degradazione e facilita il suo trasporto attraverso il nucleo cellulare e verso i ribosomi nel citoplasma durante la fase di traduzione.

Aggiunta della Coda di Poliadenina 3':

All'estremità 3' dell'mRNA, viene aggiunta una lunga sequenza di adenine chiamata coda di poliadenina. Questa coda di poliadenina svolge un ruolo nella stabilità dell'mRNA e aiuta nella sua traduzione. Inoltre, contribuisce al processo di maturazione dell'mRNA.

Rimozione degli Introni:

Gli introni sono segmenti non codificanti di RNA presenti nell'mRNA precursore (pre-mRNA) che devono essere rimossi per produrre un mRNA maturo. Questa rimozione avviene attraverso un processo chiamato splicing, in cui gli esoni (regioni codificanti) sono uniti per formare la sequenza matura dell'mRNA.

Editing dell'RNA:

Alcuni geni possono subire modifiche dell'RNA in cui basi specifiche vengono modificate. Questo processo è noto come editing dell'RNA e può comportare la deaminazione o l'aggiunta di nucleotidi, influenzando la sequenza finale dell'mRNA e la proteina codificata.

Traduzione

Il processo di traduzione inizia quando il complesso di inizio, composto dall'mRNA, dalla subunità ribosomiale piccola e grande, e dall'iniziatore tRNA (che porta l'amminoacido metionina), si forma sul codone di inizio dell'mRNA. Questo complesso si ancorerà all'inizio del codone AUG, che specifica la metionina.

Durante l'allungamento, il ribosoma si muove lungo l'mRNA, leggendo i codoni e attirando tRNA contenenti gli amminoacidi corrispondenti. L'enzima peptidiltransferasi nel sito A del ribosoma catalizza la formazione di legami peptidici tra gli amminoacidi, creando così la catena polipeptidica. Il ribosoma avanza di tre nucleotidi alla volta, spostando l'mRNA attraverso i suoi siti A e P.

La traduzione continua finché un codone di terminazione (UAA, UAG, o UGA) raggiunge il sito A del ribosoma. A questo punto, non esistono tRNA corrispondenti per questi codoni, ma piuttosto proteine di rilascio che interrompono la sintesi. Il ribosoma libera la catena polipeptidica, che subirà successivamente il processo di piegamento e modifiche post-traduzionali per assumere la sua forma e funzione finale.

Il ribosoma possiede tre siti funzionali chiave:

Sito A (Accettazione): Dove il tRNA che trasporta il nuovo amminoacido si lega all'mRNA.

Sito P (Prolungamento): Dove il legame peptidico si forma tra gli amminoacidi.

Sito E (Uscita): Dove il tRNA senza amminoacido lascia il ribosoma.

Questi siti si combinano armoniosamente per coordinare la sequenza precisa di eventi durante la traduzione, garantendo la corretta sintesi delle proteine.

Modifiche post- traduzionali

Le modifiche post-traduzionali sono processi che avvengono dopo la sintesi delle proteine durante la traduzione, al fine di conferire alle proteine la loro conformazione tridimensionale corretta e di regolarne la funzione. Questi processi aggiuntivi sono essenziali per la diversificazione e la regolazione delle funzioni delle proteine. Alcune delle principali modifiche post-traduzionali includono:

Piegamento Proteico:

Dopo la sintesi della catena polipeptidica, le proteine subiscono un processo di piegamento intricato per ottenere la loro forma tridimensionale corretta. Questo piegamento è cruciale per la funzione delle proteine, poiché determina come le proteine interagiranno con altre molecole nel loro ambiente.

Glicosilazione:

La glicosilazione è il processo di aggiunta di catene di zuccheri alle proteine. Questa modifica può influenzare la stabilità, la solubilità e la funzione delle proteine. Inoltre, le proteine glicosilate svolgono spesso un ruolo chiave nelle interazioni cellulari e nei processi di riconoscimento molecolare.

Fosforilazione:

La fosforilazione coinvolge l'aggiunta di gruppi fosfato a specifici residui di amminoacidi all'interno delle proteine. Questa modifica è spesso utilizzata per regolare l'attività delle proteine, agendo come un interruttore molecolare che attiva o disattiva la funzione di una proteina. Gli enzimi chiamati chinasi aggiungono gruppi fosfato, mentre le fosfatasi li rimuovono.

Acetilazione e Metilazione:

L'acetilazione coinvolge l'aggiunta di gruppi acetile a residui specifici di amminoacidi. Questo può influenzare la stabilità della proteina e la sua capacità di interagire con altre molecole. La metilazione, d'altra parte, implica l'aggiunta di gruppi metile. Entrambe queste modifiche possono influenzare la funzione delle proteine.

Ubiquitinazione:

L'ubiquitinazione coinvolge l'aggiunta di piccole proteine chiamate ubiquitina alle proteine bersaglio. Questa modifica spesso segnala le proteine per la loro degradazione nei proteasomi, contribuendo così al controllo della concentrazione delle proteine cellulari.

Clivaggio Proteolitico:

Alcune proteine vengono sintetizzate come precursori più grandi e attive vengono generate tramite clivaggio proteolitico, dove parti specifiche della catena polipeptidica vengono rimosse. Questa modifica può essere cruciale per attivare o disattivare la funzione delle proteine.

Prenilazione e Farnesilazione:

Queste modifiche coinvolgono l'aggiunta di gruppi prenilici o farnesilici a proteine specifiche. Questi gruppi lipofili possono ancorare le proteine alla membrana cellulare, influenzando così la loro localizzazione e attività.

Formazione di Legami Disolfuro:

I legami disolfuro tra i residui di cisteina stabilizzano la struttura tridimensionale delle proteine. La formazione e la rottura di questi legami contribuiscono alla conformazione e alla funzione delle proteine.

Enzimi

Un’enzima è una proteina che agisce da catalizzatore accelerando le reazioni abbassando l’energia di attivazione. (Urti efficaci; Modifica del substrato; Microambiente più idoneo; Partecipazione degli amminoacidi).

Il reagente su cui agisce l’enzima è definito substrato, quando l’enzima si lega nel sito attivo, si forma il complesso enzima-substrato. Una volta che il substrato ha legato l’enzima, induce in esso un cambiamento della forma che innesca l’attività catalitica. Quando i substrati entrano nel sito attivo l’enzima modifica la sua forma in modo da aderire perfettamente; il substrato è trattenuto nel sito attivo da interazioni deboli; I gruppi R degli amminoacidi trasformano i substrati nei prodotti che vengono liberati.

Gli enzimi si classificano in:

• Ossidoreduttasi: reazioni di ossidoriduzione

• Transferasi: reazioni di trasferimento dei gruppi funzionali

• Idrolasi: reazioni di idrolisi

• Liasi: rottura di doppi legami

• Isomerasi: formazione di isomeri

• Ligasi: formazione di legami

L’attività enzimatica può essere regolata da variazioni del pH, di temperatura, di concentrazione del substrato e concentrazione dell’enzima.

Respirazione cellulare

• Metabolismo: insieme delle reazioni chimiche che avvengono in un organismo.

• Vie cataboliche: liberano energia demolendo molecole complesse

• Vie anaboliche: consumano energia per creare molecole complesse

L’ATP (adenosina trifosfato) è la molecola implicata per la maggior parte dei processi per creare energia. Contiene il ribosio a cui sono legati l’adenina e tre gruppi fosfato. I legami del fosfato si rompono per idrolisi, e quando viene rotto l’ultimo diventa ADP (adenosina difosfato).

La respirazione cellulare fornisce energia necessaria per le attività volontarie e quelle involontarie. Le molecole di glucosio vengono demolite grazie all’ossigeno e l’energia viene usata per produrre ATP. Le altre molecole usate come fonte di energia devono essere prima trasformate in glucosio. Le vie cataboliche ricavano energia trasportando gli elettroni. Nella respirazione cellulare, molte delle reazioni sono reazioni redox in cui il glucosio si ossida (perde elettroni) e l’ossigeno di riduce (acquista elettroni). Nel processo di ossidazione del glucosio sono coinvolti il NAD+ e il FAD, due coenzimi che trasferiscono gli elettroni. Questo avviene perché un enzima delle deidrogenasi separa due atomi di H dalla molecola organica ossidandola. L’enzima trasporta 2 elettroni e 1 protone al coenzima mentre l’altro protone viene liberato in forma di H+.

Glicolisi

1. L’esochinasi (parte di un gruppo di isoenzimi che agiscono nelle stesse reazioni ma sono specifici per tessuto e regolati in maniera diversa GOT, CK, CKMB; viene inibita dal suo prodotto a differenza della glucochinasi presente nel fegato) trasferisce un gruppo fosfato dall’ATP al glucosio rendendolo più reattivo. 

2. Il glucosio 6-fosfato subisce un’isomerizzazione dalla fosfoglucoisomerasi, la funzione chetonica viene spostata in posizione 2 e diventa fruttosio 6-fosfato. La sua regolazione regola tutta la via.

3. La fosfofruttochinasi (enzima chiave, esercita il controllo di tutta la via metabolica. Si tratta di un’enzima allosterico cioè con più siti che lo regolano. È regolato dal suo prodotto e attivato dalle chinasi e dall’aggiunta di gruppi fosfato da un nucleotide trifosfato alla molecola) trasferisce un gruppo fosfato dall’ATP all’estremità opposta dello zucchero, idrolizzando una seconda molecola di ATP.  Lo zucchero diventa fruttosio 1,6-bifosfato. 

4. L’aldolasi scinde la molecola di zucchero in due diversi zuccheri a 3 atomi di carbonio, si ottengono così G3P e DHAP che non raggiungono mai un equilibrio tra loro.

5. Lo zucchero è ossidato dal trasferimento di elettroni al Nad che diventa NADH, e con questa energia un gruppo fosfato viene legato al substrato ossidato trasformandolo in un intermedio ad alta energia diventando 1,3-bifosfoglicerato.

6. Il gruppo fosfato viene trasferito all’ADP dalla fosfoglicerochinasi e il gruppo carbonilico viene ossidato a gruppo carbossilico di un acido organico.

7. La fosfogliceromutasi riposiziona il gruppo fosfato

8. L’enolasi catalizza la formazione di un doppio legame nel substrato eliminando acqua. Si ottiene fosfoenolpiruvato (PEP)

9. Il gruppo fosfato è trasferito dal PEP all’ADP e si forma piruvato.

Nelle cellule eucariote in assenza di ossigeno avvengono le fermentazioni, processi che non portano guadagno energetico. La fermentazione lattica (globuli rossi e muscoli scheletrici) trasforma il piruvato, il NADH e gli H* in lattato (acido lattico non dissociato), Non si ha un guadagno in ATP ma si libera il NAD. La fermentazione alcolica invece decarbossilizza il piruvato, ottenendo acetaldeide e CO2 che diventa etanolo.

Prima del ciclo di Krebs

Il piruvato deve essere trasportato all’interno dei mitocondri, il coenzima A reagisce con il piruvato formando acetilcoenzima A + CO2. Deve superare la membrana interna  e quella eucariote utilizzando il metilcoenzima A.

Ciclo di Krebs (Ciclo degli acidi tricarbossilici)

Viene definito ciclo poiché il prodotto finale è anche il reagente della reazione iniziale. 

1. L’acetilcoenzima A viene unito all’ossalacetato formando citrato grazie alla citratosintasi. Il coenzima A si stacca e le due catene si condensano. I primi prodotti hanno 3 gruppi carbossilici

2. L’aconitasi sposta il gruppo ossidrile nel citrato formando l’isocitrato.

3. L’isocitrato deidrogenasi catalizza la decarbossilizzazione ossidativa dell’isocitrato formando ∝-chetoglutarato eliminando CO2 e riducendo NADH a NAD*

4. L’∝-chetoglutarato deidrogenasi catalizza la decarbossilizzazione ossidativa dell’∝-chetoglutarato eliminando CO2 e formando NADH. Si forma così succinil-coA.

5. L’enzima succinil-coA sintasi stacca il coA liberando energia che si immagazzina nel legame tra GDP e un gruppo fosfato  formando GTP. Si genera succinato.

6. La succinato deidrogenasi ossida il succinato che diventa fumarato (FAD diventa FADH2)

7. La fumarasi trasforma il fumarato in malato

8. La malato deidrogenasi ossida il malato a ossalacetato

Fosforilazione ossidativa

La fosforilazione ossidativa comprende la catena di trasporto degli elettroni e la chemiosmosi. Gli elettroni vengono spostati nello spazio intermembrana, assieme agli H* e passano per effetto collaterale tra gli accettori che si accumulano nello spazio intermembrana. Lo spostamento avviene contro gradiente di concentrazione, l’energia non si consuma perché passano passivamente affiancati agli elettroni. Si forma una ΔV, gli H* cercano di rientrare nella matrice ma la membrana è impermeabile e il passaggio non può essere facilitato per gli ioni che devono passare per canali ionici facilitati. La proteina canale per gli H* è nel mitocondrio associato alla proteina ATP sintasi che fa entrare in rotazione l’enzima, la vibrazione lo attiva e lega i gruppi fosfato all’ATP. Si ottengono fino a 2,15 ATP per il NADH e 2 per il FADH. 

Ci sono proteine ferro-zolfo B, C1, C2, A, A3; La caduta di energia più alta si ha dal NAD al FAD, B-C1; A-A3. Si vedono delle granulazioni nella membrana che sono i complessi di trasporto degli elettroni. Gli elettroni dopo il citocromo A si spostano su A3 dove trovano l’ossigeno che lega gli H*.

Il complesso della proteina canale e dell’ATP sintasi è il complesso F0, F1Da questi processi si ottengono dalle 28 alle 32 molecole di ATP.

Sostanze bloccanti della respirazione cellulare

• Rotenone, cianuro, monossido di carbonio: bloccano la catena di trasporto degli elettroni

• Sostanze velenose (oligomicina): inibiscono la sintesi dell’ATP

• Agenti disaccoppianti: rendono la membrana mitocondriale permeabile agli ioni idrogeno, bloccando la sintesi di ATP perché si annulla il gradiente di concentrazione. L’ossigeno consumato viene dunque non utilizzato.

Reazioni anaplerotiche

Il ciclo può essere usato per rifornire le reazioni di sintesi, tutti i prodotti possono essere usati come reagenti per la sintesi. Alcuni servono per gli amminoacidi ossalacetato. I lipidi per betaossidazione diventano acetilcoenzima A.

Metabolismo del glicogeno

• Glicogenosintesi: avviene nel citoplasma delle cellule del fegato e dei muscoli e si tratta della polimerizzazione del glucosio a una catena di glicogeno ramificato; il glucosio si scioglie nel citoplasma creando una soluzione ipertonica che richiede acqua. Il composto che si crea è dunque osmoticamente attivo, il glicogeno non è solubile e la pressione osmotica aumenta la molarità attirando acqua. Avviene dal glucosio-6-fosfato che si unisce alla glicogenina (proteina). La glicogenosintasi è l’enzima che sintetizza ed è UTP dipendente. 

• Gluconeogenesi: Produce il glucosio da altre sostanze, come il glicerolo, prodotto dalla decomposizione dei grassi o da aminoacidi glucogenetici.  Il processo è endoergonico e anabolico, quindi si produce energia. (Il glucosio è l’unico, oltre ai gruppi chetonici, a fornire energia ai neuroni). La reazione viene attivata nel fegato quando si è in uno stato ipoglicemico. I reticoli endoplasmatici svolgono la funzione di immagazzinare in una soluzione meno concentrata negli eucarioti. Nelle cellule procarioti la concentrazione è più alta e l'acqua entra per l'alta pressione osmotica. 

• Glicogenolisi: Il glucosio 1 fosfato viene staccato dalla catena principale attraverso la glicogeno fosforilasi che rompe i legami fra i residui di glucosio inserendo un gruppo fosfato in posizione 1. In seguito diventa glucosio 6 fosfato grazie all’isomerasi. Il glicogeno fosforilasi demolisce i legami.

• Via dei pentoso fosfati: nel fegato gli zuccheri esosi vengono trasformati in pentosi e si produce NADPH dal potere riducente. (fegato, adipe, ghiandole). Si susseguono una fase ossidativa e una non ossidativa. 

Metabolismo dei lipidi

Durante il ciclo di Krebs la molecola dei lipidi si divide grazie alla lipasi separando il glicerolo e gli acidi grassi. I lipidi non si sciolgono nel sangue ma vengono trasportati dalle lipoproteine che li depositano . (HDL; LDL; VLDL). Gli acidi grassi vengono demoliti con la β-ossidazione. Quest’ultima avviene nella matrice mitocondriale e si tratta di una serie di 4 reazioni che si ripetono ciclicamente. Trasforma gli acidi grassi in acetil-CoA. Nel fegato avviene la lipogenesi (liposintesi) attraverso la quale a partire dall’acetil-CoA si sintetizzano gli acidi grassi.

Metabolismo delle proteine

Gli amminoacidi non possono essere immagazzinati come riserva di energia ma possono essere demoliti per ricavarne energia. Il processo è catabolico e attraverso la deaminazione ossidativa si ottiene una molecola di ione ammonio e un ∝-chetoglutarato.