Vectores de Clonación y Técnicas de ADN Recombinante

Introducción a los Vectores de Bacteriófagos

Los bacteriófagos, o simplemente fagos, son virus que infectan de manera específica a las bacterias. El proceso de infección comienza cuando la partícula del fago se adhiere a la superficie exterior de la bacteria e inyecta su ADN dentro de la célula host. Una vez dentro, el ADN del fago se replica y sus genes se expresan para sintetizar las proteínas de la cápside; posteriormente, las nuevas partículas de fago se ensamblan y se liberan de la bacteria.

Existen dos tipos principales de estructuras de fagos: los que poseen cabeza y cola, como el fago $\lambda$, y los fagos filamentosos, como el $M13$. En comparación con los plásmidos, los vectores de fago pueden acomodar fragmentos de ADN más grandes, alcanzando hasta los $25\,kb$, lo que los hace ideales para la preparación de bibliotecas genómicas. Además, presentan una eficiencia de transformación significativamente mayor que la de los plásmidos.

Ciclos de Infección: Lítico vs. Lisogénico

El patrón general de infección puede seguir dos rutas principales. El ciclo lítico se caracteriza porque la liberación de las nuevas partículas de fago está asociada con la lisis (ruptura) de la célula bacteriana. Por otro lado, la infección lisogénica se distingue por la retención de la molécula de ADN del fago dentro de la bacteria huésped, donde puede permanecer durante miles de divisiones celulares.

En este estado, la forma integrada del ADN del fago se denomina profago y se mantiene quiescente. La bacteria que porta un profago se conoce como lisógeno y suele ser fisiológicamente indistinguible de una célula no infectada. Eventualmente, el profago se libera del genoma del huésped y el fago revierte al modo lítico, lisando la célula. Un ejemplo clásico de este comportamiento es el fago lambda ($\lambda$).

Características del Fago Lambda ($\lambda$)

El fago lambda es un bacteriófago temperado con un tamaño de genoma de $48.5\,kb$, cuya secuencia de ADN es completamente conocida. Su estructura consta de una cabeza poliédrica que contiene el ADN y una cola que sirve para la adhesión a la superficie bacteriana y la inyección del material genético.

Aunque el genoma de $\lambda$ es lineal, los dos extremos naturales de la molécula poseen salientes de cadena sencilla de $12$ nucleótidos denominados sitios cos. Estos sitios tienen secuencias complementarias, lo que les permite aparearse entre sí para circularizar la molécula después de la entrada en la célula. Se han identificado posiciones críticas en el genoma, como las situadas a los $20\,kb$ y $35\,kb$. Si se eliminan fragmentos opcionales, se puede obtener una molécula de $\lambda$ de aproximadamente $15\,kb$, permitiendo la adición de hasta $18\,kb$ de ADN nuevo.

Clasificación de Vectores Lambda: Inserción y Reemplazo

Se han desarrollado dos tipos fundamentales de vectores basados en $\lambda$:

1. Vectores de inserción: En estos, parte o la totalidad del ADN opcional ha sido eliminada y se ha introducido un sitio de restricción único en una posición específica del genoma recortado. Pueden acomodar entre $6\,kb$ y $7\,kb$ de ADN. Ejemplos notables incluyen $\lambda gt10$, $\lambda gt11$ y $\lambda ZAP\,II$.

2. Vectores de reemplazo: Contienen el ADN opcional dentro de un fragmento denominado "stuffer" (fragmento de relleno), el cual está flanqueado por un par de sitios de restricción. Este fragmento se reemplaza cuando el ADN que se desea clonar se liga en el vector. Estos vectores tienen dos sitios de corte y pueden acomodar hasta $25\,kb$ de ADN. Ejemplos incluyen $EMBL3$, $EMBL3A$, $EMBL4$, $\lambda DASH$, $\lambda FIX$, $GEM11$ y $GEM12$.

Empaquetamiento In Vitro y Selección

El bacteriófago lambda puede reconstituirse en un tubo de ensayo mezclando el ADN del fago con una mezcla de proteínas de la cápside, produciendo una partícula viral infectiva en un proceso llamado empaquetamiento in vitro. Existe un requisito estricto de tamaño para el ADN que entra en la cabeza del fago: este debe medir entre $38\,kb$ y $52\,kb$. Esta característica garantiza que solo los recombinantes con el tamaño adecuado sean empaquetados.

Algunos vectores incorporan el gen de la $\beta$-galactosidasa en el fragmento stuffer. Cuando este fragmento se elimina o el ADN foráneo se clona dentro del gen, la actividad de la $\beta$-galactosidasa se pierde. Esta pérdida de actividad se utiliza como marcador para seleccionar los clones recombinantes.

En experimentos de clonación, el tratamiento con endonucleasas produce brazos izquierdo y derecho del vector. Estos brazos tienen un extremo romo y un extremo con el saliente de sitios cos. El ADN a clonar, también con extremos romos, se inserta entre los brazos durante la ligación, formando un concatámero. Solo las partes del concatámero que comprenden "brazo izquierdo - ADN inserto - brazo derecho" y que cumplen con el rango de $37\,kb$ a $52\,kb$ de longitud son encapsuladas por la mezcla de empaquetamiento.

Cosmidos: Vectores para Insertos de Gran Tamaño

Los cosmidos son vectores híbridos que combinan características de los plásmidos y del fago lambda. Un cosmido típico, como el $pJB8$, tiene un tamaño de $5.4\,kb$ y contiene el gen de resistencia a la ampicilina ($amp^R$), un segmento de ADN de $\lambda$ con el sitio cos, y un origen de replicación ($ori$) de Escherichia coli.

Los cosmidos permiten clonar moléculas de ADN de hasta $45\,kb$ con una alta eficiencia de transformación. Otros ejemplos incluyen las series $pJB$, $pWE$ y $SuperCos$. El $SuperCos\,I$, por ejemplo, mide $7.6\,kb$ y contiene genes como $Neo$, $ori$, $Amp$, $SV40\,ori$ y sitios de clonación múltiple ($MCS$) flanqueados por sitios $EcoRI$, $NotI$, $T3$, $BamHI$, $T7$ y $XbaI$.

Bibliotecas Genómicas y Fórmulas de Probabilidad

Una biblioteca genómica es un conjunto de clones recombinantes que contiene todo el ADN presente en un organismo individual. Estas bibliotecas permiten estudiar cualquier gen deseado y pueden conservarse y propagarse durante años. Para determinar cuántos clones ($N$) son necesarios para asegurar que un gen esté presente con una probabilidad ($P$) determinada, se utiliza la siguiente ecuación:

$N = \frac{\ln(1 - P)}{\ln(1 - \frac{a}{b})}$

Donde:

• $N$ es el número de clones requeridos.

• $P$ es la probabilidad de que un gen específico esté presente (usualmente $95\%$ o $99\%$).

• $a$ es el tamaño promedio de los fragmentos de ADN insertados.

• $b$ es el tamaño total del genoma.

Por ejemplo, para una biblioteca genómica humana ($b \approx 3 \times 10^9\,pb$):

• Con vectores $\lambda$ de reemplazo (inserto de $18\,kb$), se requieren $532,500$ clones para $P = 95\%$ y $820,000$ para $P = 99\%$.

• Con cosmidos (inserto de $40\,kb$), se requieren $240,000$ clones para $P = 95\%$ y $370,000$ para $P = 99\%$.

• Con YACs (inserto de $600\,kb$), se requieren $16,000$ clones para $P = 95\%$ y $24,500$ para $P = 99\%$.

Colifagos Filamentosos y Vectores de ADN Monocatenario

Los colifagos filamentosos como $M13$, $f1$ y $fd$ contienen una molécula de ADN circular de cadena sencilla ($ssDNA$). El fago $M13$ tiene una longitud de $6407$ nucleótidos ($fd$ tiene $6408$). Estos fagos solo infectan bacterias entéricas que poseen pili F, ya que el extremo del pilus es el sitio de adsorción.

La biología de estos fagos es única: el ADN de cadena sencilla entra en la célula, se libera de la cápside y se convierte en una forma replicativa ($RF$) de doble cadena. La $RF$ se multiplica hasta alcanzar unas $100$ copias. Posteriormente, una proteína codificada por el virus se acumula, se une a la cadena viral y evita la síntesis de la cadena complementaria, haciendo que la replicación sea asimétrica y solo se sinteticen cadenas sencillas. A diferencia de otros fagos, no causan lisis; las células infectadas continúan creciendo y extruyen hasta $100$ partículas virales por generación.

Los vectores de la serie $M13mp$ han sido desarrollados con un polylinker dentro del gen $lacZ$ que complementa al huésped (como $JM103$ o $JM104$). La selección se basa en la formación de placas azules o blancas. Estos vectores son esenciales para la secuenciación mediante el método de terminación de cadena de Sanger y para la mutagénesis dirigida.

Vectores de Clonación en Levaduras

El descubrimiento del plásmido de $2\,\mu m$ ($6\,kb$, $50-100$ copias/célula) en Saccharomyces cerevisiae permitió el desarrollo de vectores de clonación en levadura. Existen cuatro tipos principales:

1. Plásmidos episomales de levadura (YEps): Derivados del plásmido de $2\,\mu m$. Ejemplo: $YEp13$. Es un vector lanzadera (shuttle) que replica en E. coli y levadura. Contiene el origen de $2\,\mu m$, el gen de selección $leu2$ y la secuencia de $pBR322$. Tienen alta frecuencia de transformación ($10,000$ a $100,000$ transformantes).

2. Plásmidos integrativos de levadura (YIps): Plásmidos bacterianos que portan un gen de levadura (ej. $ura3$ en $YIp5$). Carecen de origen de replicación de levadura y sobreviven integrándose en el ADN cromosómico por recombinación homóloga. Su eficiencia de transformación es baja (< $100$ transformantes/$\mu g$ DNA).

3. Plásmidos replicativos de levadura (YRps): Portan una parte del ADN cromosómico con un origen de replicación y marcadores seleccionables.

4. Plásmidos centroméricos de levadura (YCps): Se comportan como pequeños cromosomas y replican solo una vez por ciclo celular. Contienen secuencias $ARS$ (origen), $CEN$ (segregación cromosómica) y marcadores seleccionables.

Cromosomas Artificiales de Levadura (YACs)

Los YACs son estructuras artificiales diseñadas para replicar en levadura y transportar fragmentos de ADN extremadamente grandes (hasta $3000\,kb$). Sus características clave son:

• Secuencia de replicación autónoma ($ARS$).

• Telómeros ($TEL$) para la estabilidad de los extremos.

• Centrómero ($CEN$) para la correcta segregación.

• Marcadores seleccionables (ej. $TRP1$, $URA3$, $SUP4$) y sitios únicos de restricción.

El vector $pYAC3$, por ejemplo, se digiere con $BamHI$ y $SnaBI$. $SnaBI$ corta dentro del gen $SUP4$, donde se inserta el nuevo ADN. Las células huésped suelen tener versiones inactivas de los genes marcadores, por lo que solo los transformantes crecen en medios carentes de los nutrientes específicos. La presencia del inserto se verifica mediante la inactivación del gen $SUP4$.

Comparativa de Capacidades de Inserto

Vectores Retrovirales y Lentiviral

Los retrovirus son virus con genoma de ARN de cadena sencilla y membrana lipídica. Su ciclo incluye la transcripción inversa del ARN a ADN de doble cadena, que se integra aleatoriamente en el genoma del huésped. Los componentes genéticos clave son:

• LTR (Long Terminal Repeat): Necesario para la integración.

• $\psi$ (Psi): Señal de empaquetamiento.

• gag: Proteínas de empaquetamiento.

• pol: Polimerasa viral.

• env: Proteínas de la envoltura (determinan el tropismo).

Los vectores lentivirales de tercera generación se diseñan para ser incompetentes para la replicación. Se utilizan múltiples plásmidos (Vector de transferencia, Vector de empaquetamiento y Vector de envoltura) para asegurar que no se produzca lisis viral libre. Se emplean LTR modificados ($\Delta$) para crear vectores "auto-inactivantes" que impiden más de una ronda de transcripción inversa.

A través del pseudotipado, se puede alterar la proteína de la envoltura viral para modificar su tropismo (capacidad de infectar células específicas). Por ejemplo:

• Ecotrópico: Infecta ratón/rata (receptor $mCAT-1$).

• Anfotrópico: Infecta mamíferos (receptor $Ram-1$).

• Pantrópico: Infecta todos los animales (receptor $VSV-G$; requiere precaución extrema por riesgo humano).

Riesgos y Consideraciones Bioéticas

El uso de retrovirus conlleva riesgos significativos:

1. Mutagénesis insercional: La integración aleatoria puede interrumpir genes endógenos del huésped, como los protooncogenes, aumentando el riesgo de cáncer.

2. Transducción viral: Los individuos infectados accidentalmente pueden expresar el gen insertado en el sitio de infección.

3. Rescate de virus: Un virus deficiente en replicación puede ser "rescatado" mediante superinfección con un virus silvestre por complementación (el virus silvestre aporta las proteínas faltantes) o por recombinación (generando un nuevo virus con virulencia alterada).