lekarska-mykologie

Charakteristika hub a houbových organizmů

• heterogenní, polyfyletická skupina eukaryotických jednobuněčných a mnohobuněčných organizmů
• mají blíže k živočichům (říše Animalia) než k rostlinám (říše Plantae), se kterými byly v minulosti tradičně spojovány
• nepřítomnost plastidů
• produktem metabolismu je polysacharid glykogen
• lyzozómy v buňkách hub
• buněčnou stěnu nejčastěji tvoří polysacharidy (mannany, galaktomannany, glukany, chitin a chitosan nebo celulóza)
• přítomnost sterolů v cytoplasmatické membráně vláknitých hub, jejichž blokování se využívá například při antimykotické léčbě

Mikroskopické houby

• „mikromycety“
  • tvoří mikroskopické vegetativní či rozmnožovací struktury pozorovatelné pod mikroskopem.
  • Porosty a některé jejich struktury mohou být viditelné i pouhým okem.
  • „plísně“ – mikroskopické vláknité houby (vidíme mycelium)
  • zástupci říše Fungi

Dle morfologie rozeznáváme: Kvasinky, Vláknité houby, Dimorfní houby

• Kvasinky - tvoří blastokonidie, pseudomycelium, chlamydospory (rýžový nebo kukuřičný agar)
• Vláknité houby - základní stavební jednotkou je hyfa a soubor hyf tvořící mycelium
  • mycelium vegetativní – ukotvující houbu v substrátu
  • mycelium generativní – nesoucí rozmnožovací struktury (pohlavní, nepohlavní)
• Dimorfní houby - tatáž houba může vytvářet hyfy i kvasinkovité útvary

Vegetativní stélka:

• přehrádkované mycelium
• coenocytické mycelium (nepřehrádkované)
• pseudomycelium – pučící elipsoidní buňky
• jednobuněčná nemyceliální stélka
• v životním cyklu se střídá anamorfa (nepohlavní stádium) s teleomorfou (pohlavní stádium)
• obě stádia jsou morfologicky, časově a prostorově oddálené
• holomorfa = anamorfa + teleomorfa (houba v celém životním cyklu)
• synanamorfa – více forem nepohlavních stádií
• u některých zástupců není teleomorfa/anamorfa známa (vzácná, nenalezená, nebo se vůbec netvoří)
• některé teleomorfní rody jsou spojeny s několika typy anamorfy (anamorfní rody s odlišnými typy konidiogeneze)

Nepohlavní rozmnožování

• anamorfa (mitosporní, imperfektní, dříve Deuteromycota)
• rozmnožují se mitózou za vzniku konidií (nepohlavní buňky)
• Terminologie:
  • mikrokonidie – malé, jedno- či dvoubuněčné konidie (u hub tvořící dva typy konidií)
  • makrokonidie – velké, mnohobuněčné konidie
  • chlamydospory (chlamydokonidie) – silnostěnné buňky
  • blastokonidie (blastospora) – buňka kvasinek oválného či kulovitého tvaru
  • arthrokonidie (arthrospory) – vznikají segmentací hyf
  • sporangiospory (sporangiokonidie) – vznikají endogenně ve sporangiu
• konidie vznikají na konidiogenních buňkách na konidioforech
• proces vzniku konidií se nazývá kondiogeneze
• Konidiomata
  • specializovaný multihyfální útvar, na kterém (nebo uvnitř kterého) se tvoří konidiofory (nebo jen konidiogenní buňky) a konidie
• Základní typy konidiomat:
  • synnema (koremie): svazek dlouhých, vzpřímených, spletených konidioforů na vrcholu rozvětvených
  • sporodochium: polštářkovitý útvar hyf s palisádovitě uspořádanými konidiofory na povrchu hostitele
  • acervulus: útvar podobný sporodochiu, ale zanořený v pletivu hostitele
  • pyknida: kulovitý nebo lahvicovitý útvar na povrchu nebo v pletivu
• vytvořen umělý systém organizace:
  • Hyfomycety – konidiogenní buňky se tvoří na povrchu mycelia
  • Coelomycety - konidiogenní buňky se tvoří uvnitř uzavřených útvarů (acervulus, pyknidy)
• Nepohlavní rozmnožování vegetativní stélka:
  • Hyfy vytvářejí somatické útvary:
    • stromata – kompaktní somatická struktura v níž dochází k vytvoření plodnice
    • sklerocia – slouží k přetrvání nepříznivých podmínek
    • pseudosklerocia – husté myceliální shluky připomínající sklerocia
• Pohlavní rozmnožování
  • teleomorfa
  • rozmnožují se meiózou za vzniku spor (pohlavních buněk)
  • Zygospora - pohlavní spora zygomycet (Zygomycota), vznikající spojením dvou stejných buněk opačného pohlaví (gamet)
  • Askospora – pohlavní spora vřeckovýtrusých hub (Ascomycota), vznikající ve vřecku (askus)
  • Basidiospora - pohlavní spora stopkovýtrusých hub (Basidiomycota), vznikající na stopce bazidie

Výživa hub

• způsob výživy heterotrofní
• příjem organických látek živočišného a rostlinného původu
• získávají živiny nejjednodušší cestou – nejprve jsou využity rozpustné cukry a aminokyseliny => poté škrob => pak celulóza a pektiny => nakonec lignin a tuky
• příjem pouze nízkomolekulárních látek (jednoduché cukry – monoa disacharidy, aminokyseliny, mastné kyseliny, steroly, vitamíny)
• složitější látky (polysacharidy, pektiny, proteiny, lignin) jsou rozkládány vně buněk za pomoci extracelulárních enzymů
• často se jedná o hydrolytické enzymy vytvářené poblíž růstového vrcholu hyfy a přes plazmatickou membránu dochází k jejich exkreci
• produkty štěpení vstupují do buněk, kde jsou dále zpracovány intracelulárními enzymy a začleněny do metabolismu

Ekologie hub

• Ekologické skupiny hub
  • dle způsobu získávání živin
  • Paraziti - (obligátní, fakultativní) - získávají živiny z živých buněk rostlin, živočichů či jiných hub
  • Predátoři – "dravé houby"
  • Saprofyté - získávají živiny z odumřelých těl rostlin či živočichů
    • houby klíčová úloha
    • odlišné mechanizmy podle skupiny hub, substrátu, ekosystému
• Symbionti - rovněž absorbují živiny z buněk živého organismu, ale za to hostiteli prokazují službu (mutualistická symbióza); rostlinám například pomáhají absorbovat z půdy minerální látky (mykorhiza)

Nomenklatura

• nomenklatura hub se řídí podle Mezinárodního kódu botanické nomenklatury
• Basionym - v nomenklatuře rostlin a hub: původní název, pod kterým byl taxon popsán, tj. název, na kterém je založen nějaký pozdější platný název (Sterigmatocystis nidulans Eidam)

Klinicky významné mikroskopické huby

• v poslední době stoupá počet případů mykóz u člověka
  • možnými důvody jsou slabší imunita lidí
  • častá léčba antibiotiky (potlačuje veškerou bakteriální flóru => snazší invaze houbového patogena)
  • případně rozmach cestování (přenos hub z jiných oblastí)
  • zvýšený záchyt (diagnostika)
• známo 99 000 druhů hub dle Dictionary of Fungi 2008 z toho cca 560 druhů je patogenních pro člověka dle Atlas of Clinical Fungi (2013)
• původci onemocnění jsou vláknité houby a kvasinky většinou běžně se vyskytující ve vnějším prostředí a přirozeně kolonizující vnitřní a vnější prostředí organizmu
• většina hub patří mezi oportunní patogeny, kteří vyvolávají infekci u jedinců s oslabeným imunitním systémem
• výjimku představují dermatofyty
• specializovaní patogeni - anamorfy hub z řádu Onygenales, oddělení Ascomycota způsobující kožní a plicní onemocnění – Histoplasma, Blastomyces, Coccidioides a Paracoccidioides

Patogenita hub

• Mikroskopické houby působí:
  • Mykózy – onemocnění způsobená houbami
  • Mykotoxikózy – onemocnění způsobené toxiny hub
  • Mykoalergózy – onemocnění alergického charakteru vyvolané antigeny mykotického původu
  • Mycetismy – houba přítomna v těle, působí jen útlakem okolních tkání
• Klasifikace mykóz z hlediska klinického:
  • povrchové - kožní a slizniční
  • systémové - zasahující více vnitřních orgánů (hluboké nebo orgánové)
• Klasifikace mykóz dle lokalizace
  • Kožní mykózy
    • povrchové mykotické infekce kůže a vlasů nebo nehtů
    • dochází k patologickým změnám v hostiteli v důsledku přítomnosti infekčního agens a jeho metabolitů

• Jiné povrchové mykózy
• povrchové mykotické infekce kůže a vlasu (kosmetické)
• nevznikají patologické změny a není buněčná odpověď od hostitele

• Podkožní mykózy
• chronické, lokalizované infekce kůže a podkožního vaziva
• původci půdní saprofyté
• Systémové a subkutánní mykózy způsobené dimorfními houbami
• původci mykotického onemocnění jsou dimorfní houbové organizmy, které mohou překonat fyziologické a buněčné obranné mechanizmy lidského hostitele tím, že mění jejich morfologické formy
• jejich výskyt je geograficky omezen
• primárním místem infekce jsou obvykle plíce po inhalaci konidií
• Oportunní systémové mykózy
• mykotické infekce, které se vyskytují téměř výhradně u oslabených pacientů, jejichž normální obranné mechanismy jsou narušeny
• původci infekce jsou kosmopolitní, saprofytické houby
• pokud dochází k invazi do tkání, hovoříme o invazivních mykotických onemocněních (IFD)

Fyziologie klinicky významných mikroskopických hub

• Kultivace
  • Sabouraudův agar s 2 – 4% glukózy s přídavkem antibakteriálních látek (chlormfenikol nebo gentamicin)
  • obohacení Sabouraudova agaru thiaminem – podporuje růst a pigmentaci řady vláknitých hub
  • cykloheximid – potlačuje růst rychle rostoucích nepatogenních saprofytických hub
  • optimální kultivační teplota 28 – 30 °C
  • teplota inkubace 36 ± 1 °C většina původců oportunních mykóz (kandidy, aspergily, zygomycety)
  • jiná, podle potřeby, např. 30 °C u identifikačních souprav
  • u dimorfních druhů souběžná kultivace ve 25 °C a 37 °C
  • doba kultivace se pro jednotlivé skupiny, rody i druhy liší
• Biochemická aktivita
  • využití při identifikaci
  • u kvasinek a kvasinkovitých organizmů schopnost asimilovat a štěpit cukry a dusíkaté látky
  • produkce řady enzymů a jiných exolátek (elastáza, proteázy, lipázy, ureáza apod.)
  • např. ureázový test pro rozlišení Trichophyton rubrum a Trichophyton interdigitale
• Antigenní struktury
  • pro vláknité houby platí čím je kultura starší tím více antigenů lze při rozpadu hyf rozpoznat (např. průkaz aspergilózy dvojitou imunodifuzí v gelu)
  • detekce kapsulárního glukuronoxylomananu (latexová aglutinace) – diagnostika kryptokokové meningitidy
  • detekce a stanovení aspergilového galaktomananu (metoda ELISA) - diagnostika invazívní aspergilózy
  • stěna mikroskopických hub je pro makrooraganizmus vysoce antigenní a pro nedostatek enzymů je jím velice špatně odstraňována
• Patogenita
  • většina klinicky významných druhů nenapadá zdravý makrooraganizmus
  • důležité posouzení nálezu mikromycet v klinickém materiálu v souvislosti se zdravotním stavem pacienta a s přihlédnutím k predisponujícím faktorům (tumory, diabetes mellitus, autoimunitní choroby, stavy po transplantacích, dlouhodobé užívání kortikoidů a širokospektrých antibiotik atd.)
  • mykózy mívají často chronický průběh ke kterému přispívá obtížná destrukce buněčné stěny
  • hlavní úloha v obraně proti mikromycetám připadá na buněčnou imunitu (leukocyty – fagocytóza)
• Epidemiologie
  • epidemiologický výskyt není pro mykózy typický
  • pouze hromadný výskyt např. dermatofytóz
• Terapie
  • antimykotika – lokální a systémová

Mykologická diagnostika

• Akreditace zdravotnických laboratoří
  • národní certifikační autoritou je Český institut pro akreditaci (ČIA)
  • Standardní operační postup (SOP) – soupis všeho potřebného k provedení určitého vyšetření
  • Příručka kvality – definuje všechny řídící procesy v laboratoři
  • Externí hodnocení kvality
  • Nepodkročitelné minimum diagnostiky mykóz laboratoří lékařské mykologie - požadavky na vybavení a metodologii mykologické laboratoře
• Odběr a zpracování materiálu na mykologické vyšetření

• Odběr materiálu na povrchové mykózy
  • Odběry nehtů, kožních šupin a vlasů
    • Kožní šupiny - po předchozím ošetřením 70% alkoholem a oschnutí, odebíráme kožní šupiny seškrábnutím z postiženého místa sterilním skalpelem do sterilní zkumavky nebo přímo do Petriho misky s kultivačním médiem. Materiál odebíráme z okrajů ložiska na rozhraní zdravé a chorobně změněné tkáně, kde je vitalita mykotického agens největší.
    • Vlasy a chlupy - po očištění odebíráme epilační sterilní pinzetou, odebíráme zejména nějakým způsobem změněné, polámané vlasy a chlupy. Snažíme se především odebrat folikulární část vlasu. Odstřižené vlasy nad úrovní pokožky nejsou vhodný materiál.
    • Odběr z povrchu nehtu - po dekontaminaci 70% alkoholem a oschnutí, odstřihneme okraj nehtu a sterilním skalpelem se seškrabe keratin vnitřní části nehtu a nehtového lůžka do sterilní zkumavky nebo na Petriho misku s médiem.
    • Nešupící se ložiska – zdrsnit sterilním skalpelem, prach setřít na suchý sterilní tampón.
    • Mokvající kožní ložiska – stěr tamponem do transportního média.
    • Před odběrem klinického materiálu na mykologické vyšetření nesmí být postižená místa 10-14 dní ošetřována žádnými lokálními antimykotiky a až 6 týdnů celkovými antimykotiky.
    • Odběrové sady (AMIES - univerzální, FUNGI-QUICK, CAT) + Hemokultivační lahvičky
• Mykologická diagnostika
  • • • • průkaz etiologického agens vyšetřované infekce
        • průkaz přímý – nález houby nebo jejich složek ve vyšetřovaném vzorku
        • průkaz nepřímý – průkaz specifických stop, které houba v organizmu zanechala (průkaz protilátek)
        • Průkaz přímý
  • Mikroskopické vyšetření klinického materiálu
  • Kultivace etiologického agens
  • Identifikace etiologického agens
  • Stanovení citlivosti k antimykotikům
  • Průkaz antigenů ve vyšetřovaném vzorku
    • • • Nepřímý průkaz – omezené použití
  • negativa:
  • častý výskyt protilátek i u relativně zdravých jedinců
  • imunosuprimovaní jedinci mohou mít nedostatečnou protilátkovou odpověď – falešná negativita

Mikroskopické metody – přehled

• Nativní preparát
  • • • • vyšetření vaginálního sekretu
        • modifikace v diferenciální diagnostice kvasinek a vláknitých hub
• Louhový preparát (včetně modifikace obarvením např. pomocí Myco-Ink)
  • • • • vyšetření dermatologických a gynekologických vzorků
        • vyšetření bioptických a nekroptických vzorků
• Barvení podle Grama
  • • • • vyšetření vzorků ze sliznic
        • vzorků z primárně sterilních materiálů
• Barvení podle Giemsy
  • • • • vyšetření vaginálního sekretu
        • diagnostika Pneumocystis jiroveci (trofozoity)
• Barvení pouzder
  • • • • diagnostika Cryptococcus neoformans
• Barvení podle Grocota nebo Gram-Weigertovo barvení
  • • • • diagnostika Pneumocystis jiroveci (cysty)
• Fluorescence (včetně imunofluorescence)
  • • • • vyšetření dermatologických, bioptických a nekroptických vzorků
        • diagnostika Pneumocystis jiroveci (trofozoity i cysty)

Kvasinky a kvasinkám blízké organizmy

• součást saprofytické mikroflóry člověka v dutině ústní, ve střevě a na poševní sliznici
• oportunní patogeni
• nejčastější původci: Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Sacharomyces, Torulopsis, Trichosporon aj.

1. kvasinky náležející do třídy Saccharomycetes oddělení Ascomycota

• • askosporogenní
  • asporogenní - pouze nepohlavně se rozmnožující kvasinky

2. bazidiomycetní – kvasinkovitá stádia oddělení Basidiomycota (dimorfizmus)

Ascomycota

• vřeckovýtrusé houby
• nejpočetnější skupina, cca 60% známých taxonů, cca 65 000 druhů
• do tohoto oddělení patří většina známých mitosporních (imperfektních) hub (žijících pouze jako anamorfy), dříve Deuteromycota
• vegetativní stélka
  • • • • haploidní přehrádkované mycelium, přehrádky (septa) mají centrální jednoduchý pór
        • kvasinkovité pučící buňky, psudomycelium
• životní cyklus haplo-dikaryotický (haplo-diploidní a diploidní)
• při pohlavním procesu dochází ke vzniku dikaryotických hyf, kde v koncových buňkách tzv. askogenních hyfách – z nich vznikají vřecka (asci, askus)
• zralé vřecko je diploidní buňka, ve které probíhá meioza za vzniku askospor, obvykle v počtu 8 spor v jednom vřecku
• plodnice (askomata)
• buněčná stěna dvouvrstevná, základní složkou chitin a -1,3-polyglukan
• nepohlavní rozmnožování dělením (vzácné), fragmentace stélky, tvorba konidií
• základní typem pohlavního rozmnožování je gametangiogamie – splynutí morfologicky diferencovaných gametangií : samčí větev mycelia nese anteridium, samičí větev nese několik kulovitých askogonů s jedním nebo několika vláknitými výrůstky – trichogyny
• životní cyklus
  • • • • haplo-dikaryotický
        • haploidní je vegetativní mycelium a plodnice, dikaryotické jsou pouze askogenní hyfy
        • do životního cyklu je vložena dikaryotická fáze charakteristická tzv. konjugovanými mitózami (současné mitózy obou jader)

Basidiomycota

• stopkovýtrusé houby
• společným znakem je tvorba bazidie (meiosporangium), bazidiospor (meiospor) tvořících se exogenně na sterigmatech (stopečkách)
• vegetativní stélku tvoří přehrádkované mycelium, ve stěně přehrádek jsou vytvořeny dolipóry (podoba pláště soudku) s parentozómem
• primární mycelium – vznik klíčením bazidiospory, 1jaderné, u někt. zástupců může chybět
• sekundární mycelium – dikaryotické, jeho vznik souvisí se somatogamickou kopulací dvou buněk primárního mycelia
• konjugované mitózy jsou spojeny s tvorbou přezek (Pucciniales a někteří další zástupci přezky netvoří)
• Pohlavní rozmnožování
  • • • • somatogamie (kopulace dvou mycelií nebo bazidiospor)
• nepohlavní rozmnožování
  • • • • arthrokonidie, blastokonidie, chlamydospory a sklerocia
        • anamorfa se obvykle tvoří na dikaryotickém myceliu
• životní cyklus dikaryotický

Kvasinky a kvasinkám blízké organizmy

• Morfologie
  • • • • vegetativní stélka je nejčastěji ve formě jednotlivých kulovitých či oválných pučivých buněk – blastokonidií (3-15 μm), některé druhy vytvářejí tzv. pučivé pseudomycelium a chlamydospory, vzácně se vyskytuje i hyfální přehrádkované mycelium
• Nepohlavní rozmnožování
  • • • • pučení za vzniku blastokonidií (holoblastická konidiogeneze), po odpadnutí dceřinných blastokonidií zůstávají na povrchu mateřské buňky zřetelné jizvy
        • prosté dělení buněk
        • u vláknitých typů tvorba arthrokonidií (holoarthrická konidiogeneze)

• Pohlavní rozmnožování
  • • • • somatogamie (kopulace dvou vegetativních buněk)
        • vzniká diploidní zygota
        • vřecko se tvoří většinou přímo ze zygoty (holozygotní) nebo jako výrůstek zygoty (exozygotní)
        • u vláknitých typů kopulují nepříliš diferencovaná gametangia - gametangiogamie
• Kvasinková stádia oddělení Basidiomycota
• Pucciniomycotina, Microbotryomycetes, Sporidiobolales
  • • • • anamorfa Sporobolomyces
        • anamorfa Rhodotorula
• Agaricomycotina, Tremellomycetes, Tremellomycetidae, Tremellales,Tremellaceae
  • • • • anamorfa Cryptococcus – teleomorfa Filobasidiella
        • anamorfa Trichosporon
• Ustilaginomycotina, Exobasidiomycetes, Malasseziales
  • • • • anamorfa Malassezia
• Kvasinky oddělení Ascomycota (Saccharomycotina, Saccharomycetes, Saccharomycetidae, Saccharomycetales)
  • • • • Candida, Geotrichum, Saccharomyces

Rod Candida (Fungi, Ascomycota, Saccharomycotina, Saccharomycetes, Saccharomycetidae, Saccharomycetales)

• nejvýznamnější a nejčastěji nalézán v klinickém materiálu
• původcem kandidóz
  • povrchové (kožní, slizniční)
  • systémové
• slizniční kandidózy: kandidóza sliznice pochvy, kandidoza ústní sliznice
• kožní kandidózy: plenková dermatitida u kojenců, kandidozy kůže a nehtů
• invazivní infekce se vyskytuji především u oslabených osob a u osob léčených kombinací širokospektrých antibiotik
• nejběžnější je Candida albicans, dále C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. parapsillosis a další
• Candida albicans
  • Morfologie záleží na typu substrátu
    • tvoří blastokonidie, pseudomycelium, chlamydospory (rýžový nebo kukuřičný agar), zárodečné klíčky (germ tubes, G-test)
  • Morfologii kvasinek ovlivňuje přítomnost živin v substrátu
    • zdroj C - mono-, di-a oligosacharidy
    • zdroj N - amonné ionty a aminokyseliny
  • Kultivace
    • vhodná kultivační teplota je 30 - 37°C
    • doba kultivace 24 – 48 hodin
    • schopnost růstu při 40 - 45°C
    • na bakteriologických půdách vytvoří za 24 hodin drobné, lesklé, bílé kolonie (chlebová vůně)
    • na Sabouraudově agaru s 4% glukozy tvoří krémové, neprůhledné, matné, vypouklé kolonie s typickou vůní
  • Patogeneze
    • komenzál lidské sliznice (kandidy jsou v malém počtu v dutině ústní, ve střevě, v oblasti vaginy a dalších slizničních površích, aniž vyvolávají chorobné příznaky)
    • vyskytují se také na kůži v místech s vlhkou zapářkou (zdroj infekce v případě oslabení imunitního systému)
    • většina kandidoz je endogenního původu
    • schopnost rychlého klíčení ve tkaních
    • schopnost měnit povrchové struktury (parazitická forma se vyznačuje přítomností pseudomycelia jehož tvorba je indukována přítomností séra)
    • podmínky za nichž se uplatňuje jako patogen:
      • u nedonošených novorozenců než se u nich vytvoří normální mikroflora
      • při hormonálních změnách (těhotenství, diabetes mellitus, endokrinní poruchy)
      • oslabené imunitě (imunosuprese), těžká celková onemocnění
      • místní poruchy bariér (déletrvající zavedení kanyl a katetrů)
  • Slizniční kandidózy
    • kandidóza ústní sliznice (Candidosis mucosae oris ) – na sliznici úst a jazyka se tvoří bílé splývající povlaky (pablány)
    • u imunokompromitovaných osob a novorozenců, než se u nich vytvoří normální mikroflora
    • tvoří 4 formy
      • 1. akutní pseudomembranózní forma (soor, moučnivka) – bělavé povlaky na sliznici úst, jazyku a patře, mohou přejít i na ústní koutky, sliznice vypadá jak posypaná moukou
      • 2. akutní atrofická forma - zarudnutí a bolestivost ústní sliznice, bez přítomnosti povlaku, vzniká po léčbě širokospektrými antibiotiky
      • 3. chronická atrofická forma - projevuje se zarudlými ložisky bez povlaku, postihuje lidi se zubní protézou
      • 4. chronická hypertrofická forma
    • vaginální kandidóza (Vulvovaginitis candidosa )
      • chronické onemocnění charakterizované zánětlivě zduřelou a červenou vulvou s bělavým tvarohovitým výtokem a svěděním
      • u mnoha žen však probíhá asymptomaticky
      • predisponující faktory: gravidita, hormonální terapie, diabetes mellitus, antibiotická terapie, nižší pH prostředí,výživa(kvasinky jsou mlsné a je-li mlsná i jejich hostitelka, to uvítají)
      • rezervoárem infekce je střevo
    • Kvasinková balanitida - kandidoza předkožkového vaku
      • postihuje především starší obézní muže, diabetiky, muže při kontaktu s ženami s vaginalni kandidozou
  • Kandidózy kůže a nehtů
    • vznikají v místech vlhké zapářky
    • profesionální onemocněni kuchařek, pekařů a cukrářů, plenková dermatitida, kandidové paronychium -postihuje osoby máčející často ruce ve vodě
  • Invazivní kandidová onemocnění (systémové kandidóza)
    • poměrně vzácné v porovnání s povrchovými kandidozami
    • charakteristické přechodem kvasinkové formy ve vláknitou
    • nejčastěji postihuje močové cesty a ledviny
    • vysoká úmrtnost při kandidémie – kvasinkové infekci krevního řečiště
    • postihuje především imunosuprimované pacienty
    • nejčastěji se vyskytující kvasinkou byla C. albicans, nejvyšší mortalitu však vykazovaly infekce vyvolané C. glabrat a C. krusei
  • kandidurie - vylučování kandid moči, obv. při kandidové infekci močových cest, kolonizace močových katetrů
• Ostatní kandidy
  • Candida tropicalis
    • izolovaná ze čtvrtiny invazivních kandidoz (C. albicans z poloviny)
    • po C. albicans druha nejčastěji nalézaná na sliznicích
    • infekce střev, respiračního traktu, na sliznici pochvy
    • u nemocných leukemii se jeví patogennějši než C. albicans
    • všeobecný komenzál v ústech, trávicím ústrojí, v plicích, ve vagině, na pokožce lidi a zvířat
  • C. parapsilosis – nejhojnější komenzální kvasinka na kožním povrchu, často kolonizuje katetry a způsobuje katetrové sepse
  • C. dubliniensis - tvoří zárodečné kličky a chlamydospory ve shlucích, zatímco C. albicans jednotlivě
  • C. glabrata, C. krusei, C. kefyr

Rod Cryptococcus (Fungi, Basidiomycota, Agaricomycotina, Tremellomycetes, Tremellomycetidae, Tremellales, Tremellaceae)

• běžně se vyskytující v půdě a na různých alkalických substrátech
• častý zdroj kryptokoků bývá trus městských holubů nebo klecových ptáků
• na rozdíl od kandid netvoří pseudomycelium
• tvoří mohutná polysacharidová pouzdra, kolonie opouzdřených kmenů mají výrazně mukózní vzhled
• multilaterální pučení
• pozitivní ureázový test
• Cryptococcus gattii
  • výskyt je omezen na oblasti v Austrálii, Africe, Indii, Mexiku, Brazílii ad.
  • ekologická vazba na několik druhů Eucalyptus
• Cryptococcus neoformans
  • teleomorfa Filobasidiella neoformans - mycelium tvoří přezky, jednotlivé, stopkaté, kyjovité holobazidie, bazidiospory se tvoří v řetízcích na vrcholu bazidie

Rod Geotrichum (Fungi, Ascomycota, Saccharomycotina, Saccharomycetes, Saccharomycetidae, Saccharomycetales, Dipodascaceae)

• nejvýznamnější druh Geotrichum candidum
• ubikvitní saprofyt, vyskytuje se v mléčných výrobcích, ale i v půdě, ve vodě, v aktivovaných kalech z odpadních vod apod.
• pro člověka může být sekundárním patogenem
• nejčastěji izolován z dýchacích cest a gastrointestinálního traktu
• zejména u osob s diabetem nebo s imunosupresí> příležitostné infekce různé lokalizace
• arthrokonidie

Rod Malassezia (dřive Pityrosporum) (Fungi, Basidiomycota, Ustilaginomycotina, Exobasidiomycetes, Malasseziales, Malassezia)

• nejčastěji nalézaný druh Malassezia globosa, M. sympodialis a M. furfur
• saprofytická obligátně lipofilní kvasinky (kromě M. pachydermatis)
• běžnou součástí kožní mikroflory člověka a dalších teplokrevných obratlovců
• příčinou povrchového onemocnění kůže pityriasis versicolor – povrchová mykoza lokalizovaná pouze ve stratum coroneum, při které na kůži vytváří světlé skvrnky bez zánětu
• hyfy prorůstají mezi rohovými buňkami a dokonce jsou schopny intracelulární invaze. V napadených buňkách dochází k rozrušení keratinu a ztrátě organel, buňky se odlučuji
• onemocnění je časté v tropickém a subtropickém pásmu
• pro vznik onemocnění je klíčová přeměna saprofytické blastokonidiální formy malassezii na myceliální, která napadá povrchové oblasti rohové vrstvy
• k průkazu slouží mikroskopické vyšetření kožních šupin z ložisek, které zobrazí krátké segmentované hyfy a hroznovité shluky spor- nazýváno „spaghetti and meatballs“
• M. pachydermatis u nedonošenců a imunokompromitovaných > katetrové sepse s pneumonií
• Seberoická dermatitida (SD)
  • chronicky probíhající dermatoza vázaná na oblast obličeje kde je nejvíce mazových žláz
  • projevuje se tvorbou v mastných žlutavých šupinek a většinou i zarudnutím
  • postihuje především novorozence během prvních 3 – 4 týdnů života ve vlasové oblasti
  • výskyt v dospělé populaci se odhaduje na 3–5 % s vyšším výskytem u mužů než u žen

Rod Rhodotorula (Fungi, Basidiomycota, Pucciniomycotina, Microbotryomycetes, Sporidiobolales)

• nejčastěji nalézaný druh Rhodotorula mucilaginosa (syn. R. rubra)
• rozšířený druh po celém světě, osidlují vlhké prostředí, lze ho izolovat ze vzduchu, půdy, vody...
• obvykle kontaminant či doprovodná mikroflora
• ojediněle může vyvolat onychomykózu i systémové onemocnění
• tvoří charakteristické růžové, oranžové až cihlově červeně zbarvené kolonie

Rod Saccharomyces (Fungi, Ascomycota, Saccharomycotina, Saccharomycetes, Saccharomycetidae, Saccharomycetales, Saccharomycetaceae)

• dlouho považován za nepatogenní pro člověka
• Saccharomyces cerevisiae bývá izolován z více než 8% případů vaginálních mykoz
• rovněž zaznamenány případy výskytu u pneumonií a sepsí
• morfologie: elipsoidní i kulovité blastokonidie, některé kmeny tvoří cylindrické až protáhlé buňky, vytváří rudimentární bohatě větvené pseudomycelium, pravé mycelium se nevytváří
• v praxi se ve velké míře využívá hlavně v kvasném průmyslu

Rod Trichosporon (Fungi, Basidiomycota, Agaricomycotina, Tremellomycetes, Tremellomycetidae, Tremellales, Trichosporonaceae)

• nejvýznamnější je Trichosporon asahii původce tzv. bílé piedry v tropických a subtropických oblastech
• bílá piedra - postižení vlasů- vznik drobných uzlíků tvořených buňkami této kvasinky
• onemocněni kosmetického charakteru
• Trichosporon asahii
  • kolonie bílé až krémové, povrch suchý sametový s radiálními brázdami
  • pučící blastokonidie chybí, tvoří arthrokonidie
  • pozitivní ureaza (Geotrichum – negativní ureaza)

Rod Sporobolomyces (Fungi, Basidiomycota, Pucciniomycotina, Microbotryomycetes, Sporidiobolales)

• rozšířen v životním prostředí (lidé, savci, ptáci, a rostliny)
• běžně izolovány z ovzduší, listy stromů a pomerančové kůry
• původce mykotických infekci, zvláště u imunosuprimovaných pacientů
• nejčastější druh Sporobolomyces salmonicolor
• kolonie mají máslovitý charakter a lososové zbarveni, mohou se podobat Rhodotorula
• tvoří blastokonidie oválného až protáhlého tvaru,
• pseudomycelium, pravé hyfy a ledvinovité balistokonidie

Diagnostika kvasinek

Význam určování kvasinek pro diagnostickou praxi

• Klinický:
  • časné zahájení cílené léčby infekce
  • selhání léčby v důsledku rezistence k antimykotikům (flukonazol - Candida krusei a Candida glabrata)
  • důležité určování kvasinek zejména na hematoonkologických odděleních, známých nejvyšší četností a pestrostí non-albicans druhů
  • u pacientů v neutropenii je třeba pravidelně monitorovat kolonizaci sliznic (kvantita, ale i druhové spektrum kvasinek s cílem odlišit stálé a přechodné mykoflóru)
• Epidemiologický:
  • hledání zdroje nozokomiálních infekcí (např. fungémií u pacientů s venózními katétry)
• V řadě případů stačí pouze odlišit Candida albicans od ostatních kvasinek rodu Candida či ostatních rodů
• Kdy by měl být v laboratoři vždy určen druh kvasinky
  • diagnóza, zakládající podezření na mykotickou infekci (rizikové skupiny pacientů)
  • v případě cíleného požadavku na mykologické vyšetření
  • při izolaci z primárně sterilní lokality
  • v případě kvasinky izolované z míst osídlovaných běžnou mikroflórou
  • jedná-li se o čistou kulturu
  • zjevnou kvantitativní převahu kvasinkové nad bakteriální populace
  • při záchytu významného množství kandid na více místech nebo opakovaném v jedné lokalitě
• v případě používání chromogenní půdy je nutné určit kultury předběžně identifikované jako druhy známé svou rezistencí in vitro k systémovým antimykotikům
• Metody identifikace kvasinek
  • lze rozdělit na fenotypové a genetické
  • Fenotypové metody obvykle využívají rozdíly v morfologii, biochemické a enzymatické aktivitě nebo antigenním složení kvasinek.
  • Genetické metody jsou založené na druhových odlišnostech v sekvencích nukleových kyselin. Při analýze DNA, případně RNA nebo proteinů využívají řadu různých přístupů
• Vyšetřovací metody v klinické mykologii
  • Kultivační metody
  • Mikroskopické metody
  • Sérologie (stanovení antigenu, protilátky)
  • Enzymatické testy
  • Biochemické testy
  • Molekulárně-biologické metody (nestandardní)
  • Kultivační metody
    • Sabouraudův glukozový agar – (glukóza 40 g, pepton 10 g, agar 15 g, dest. voda 1000 ml)
    • SAB + antibiotika
    • SAB bujón
    • Selektivně diagnostická média – fluorogenní, chromogenní média
    • Rýžový agar, 24 – 48 hodin, pokojová teplota
    • Kukuřičný agar
    • nárůst za 24 – 48 hodin při 30 °C, případně 37 °C
    • Selektivně diagnostické kultivační půdy
      • média obsahují fluorogenní nebo chromogenní substráty detekující enzymatické aktivity kvasinek, nejčastěji beta-N acetylhexosaminidázy, beta-glukosidázy nebo fosfatázy
      • Výhody
        • při primární kultivaci rychlé, i když jen orientační určení druhů, nejčastěji se vyskytujících v klinickém materiálu
        • snadná detekce směsných kultur čímž významně přispívají ke zjednodušení procesu identifikace
      • Nevýhody
        • vyšší náklady
        • vývojově starší jsou fluorogenní média, používaná pouze k určení Candida albicans, nedostatkem je difúze fluoreskujících substancí do agaru, což ztěžuje odlišení C. albicans ve směsných kulturách
        • nutnost hodnocení v ultrafialovém světle
      • Chromogenní média
        • CHROMagar Candida - zlatý standard - využití pro předběžnou identifikaci čtyř druhů kandid:

C. albicans - žlutozelené až modrozelené kolonie

C. tropicalis - tmavě modré až modrošedé kolonie

C. krusei - světle růžové až purpurové, matné, nepravidelné kolonie

C. glabrata - růžové, lesklé, okrouhlé kolonie

nespolehlivé je odlišení C. dubliniensis od C. albicans dle tmavě zeleného zbarvení kultur

v ČR název Colorex Candida(Trios) hotové médium

• • • • • další nejčastěji používané médium CandiSelect 4 (Bio-Rad Laboratories)

identifikuje stejné druhové spektrum kandid

ve srovnání s médiem CHROMagar má zcela odlišné a ne tak výrazně diferencující zbarvení kolonií

určování kandid, zejména non-albicans, na chromogenních médiích je považováno za předběžné a mělo by být následně ověřeno podrobnou identifikací

• • • • • Bird Seed Agar (BD Diagnostics) – médium pro diferenciaci Cryptococcus neoformans na základě vysoce specifické aktivity fenoloxidázy, vedoucí k tvorbě charakteristického tmavohnědého melaninu, C. albicans tvoří bílé kolonie
    • Makromorfologie kolonií
      • Barva
      • Textura – hladká, drsná
      • Vzhled – lesklé, matné
      • Profil kolonie
        • 1. hladká kolonie
        • 2. hladká kolonie s vyvýšeným středem
        • 3. hladká kolonie, kráterovitá
        • 4. plochá kolonie
        • 5. kráterovitá kolonie ve středu zvlněná
        • 6. vyvýšená, zvlněná kolonie
        • 7. plochá, zvlněná kolonie
        • 8. rhiziodní kolonie s pseudomyceliem
      • Povrch a okraj kolonie
        • 1. centrálně pruhovaný (v koncetrických kruzích)
        • 2. radiálně pruhovaný (radiálně zvrásněný)
        • 3. ucelený okraj
        • 4. lalokovitý okraj
        • 5. pilovitý okraj
        • 6. cípovitý okraj
        • 7. rhizoidní okraj

• • Mikroskopické metody
    • mikromorfologické hodnocení kultur
    • morfologické znaky:
      • klíční vlákna, chlamydospor
      • velikost a tvar blastokonidií
      • arthrokonidie, askospory
      • vláknité struktury: mycelium, pseudomycelium
    • používají se nativní a barvené preparáty
    • nativní preparát je součástí tzv. testu klíčících vláken (germ tubes, GT - test) – rychlá cílená identifikace C. albicans
    • mikroskopické vyšetření se provádí po 2 – 4 h inkubace při 37 °C vyšetřované kultury v séru, příp. jiném bílkovinném médiu
    • pozitivní nález - krátká myceliální vlákna, vyrůstající z jednotlivých blastokonidií
    • nutné zkušenosti k rozlišení pravých klíčních hyf od časné produkce pseudohyf
    • tvoří je také C. dubliniensis a vzácně C. tropicalis
    • velmi dobrá senzitivita a 100% specifita byly zjištěny při provedení testu přímo z hemokultur v bezprostřední návaznosti na barvení podle Grama, což významně urychlilo diagnostiku nejčastějšího původce kandidémií
    • nativního preparátu se využívá při hodnocení mikromorfologie kvasinek, kultivovaných na rýžovém nebo kukuřičném agaru
    • tvorba chlamydospor u C. albicans a C. dubliniensis
    • Louhový preparát
      • určen ke znázornění dermatofytů, jiných vláknitých hub a kvasinek v kůži, nehtech, vlasech, vousech a chlupech
      • nelze identifikovat
      • nevypovídá o životaschopnosti
    • Modifikace louhového preparátu
      • barvení houbových elementů barvivem MykoInk
      • houby přijímají barvivo selektivně a vzorek je dostatečně projasněn 10% KOH
    • Barvené preparáty
      • barvení podle Grama - vyšetření vzorků ze sliznic a primárně sterilních materiálů
      • barvení postupem Wirtze a Conklina (5% roztok malachitové zeleně) je možné hodnotit počet a morfologii askospor u perfektních druhů kvasinek po inkubaci na speciálních médiích (agar podle Gorodkové, V-8 juice agar atd.)
      • průkaz pouzdra kryptokoků - negativní barvení tuší (Burriho barvení)
  • Sérologické metody
    • stanovení vysoce imunogenního antigenu buněčné stěny (manan)
    • stanovení protilátek proti němu (antimanan)
    • detekce přítomnosti antigenu kryptokoků glukuronoxylomananu v séru, likvoru, moči a bronchoalveolární tekutině latexovou aglutinací
    • Stanovení mananu
      • do séra i jiných tělních tekutin je vylučován při invazívní kandidové infekci
      • může být detekován latexovou aglutinací (Pastorex Candida, Bio-Rad) s detekčním limitem 15 ng mananu/ml, výsledek je udáván kvalitativně
      • ELISA (detekční limit 1 ng mananu/ml, Platelia Candida Ag, Bio-Rad), výsledek je udáván kvantitativně
      • obě metody využívají k detekci monoklonální protilátku EBCA-1
      • metoda je standardizována pro použití v séru
      • senzitivita testu je udávána od 40 % do 75 %
      • specificita od 49 % do 100 %
      • zvýšení senzitivity a specifity dosáhneme při kombinaci průkazu mananu s průkazem protilátky antimananu metodou ELISA (Platelia Candida Ab, Bio- Rad)
      • exprese antigenu na povrchu buněčné stěny je u jednotlivých druhů kandid rozdílná
      • senzitivita testu závisí na druhu kandidy vyvolávající infekci
    • Komerční testy identifikující:
      • společně C. albicans a C. dubliniensis (Bichro-Latex Albicans, resp. ELITex Bicolor albi-dubli)
      • C. dubliniensis (Bichro-Dubli, ELITex dubliniensis)
      • C. krusei (Krusei Color, ELITex krusei)
      • detekce je prováděna latexovou aglutinací s využitím monoklonálních protilátek proti antigenům buněčné stěny
      • latexová aglutinace k průkazu kryptokoků, např. souprava Pastorex Cryptococcus (BioRad Laboratories)
      • Aglutinační testy
        • (ELITex Bicolor albi-dubli)
        • identifikuje společně C. albicans a C. dubliniensis
        • červený latex + monoklonální protilátka
        • zelená disociační tekutina
        • koagulace blastokonidií nesoucích příslušný antigen s latexovými částicemi
        • červená sraženina v zeleném roztoku
  • Enzymatické testy
    • průkaz činnosti specifických enzymů
    • komerčně využíván pro rychlý screening především C. albicans a C. glabrata
    • k identifikaci C. albicans jsou využívány L-prolin-aminopeptidáza a beta-galaktosaminidáza, např. BactiCard Candida (Remel) nebo AlbiQuick (Hardy Diagnostics)
    • identifikace C. glabrata je založena na detekci enzymu trehalázy, někdy i maltázy, což zvyšuje specifitu testu, např. Glabrata RTT (Fumouze Diagnostics) nebo Rapid Trehalose Assimilation Broth (Remel)
  • Biochemické testy
  • definitivní druhové určení kvasinek
  • založeno na testování schopnosti utilizace různých zdrojů uhlíku, případně dusíku
  • biochemické reakce mohou probíhat aerobně nebo anaerobně
  • asimilace cukrů a dusíkatých látek- testy se obecně označují jako auxanogramy
  • štěpení cukrů (fermentace) - testy se označují zymogramy
  • komerční soupravy - založeny na testování schopnosti utilizace různých zdrojů uhlíku
    • manuálních systémy - soupravy, které vyžadují ruční provedení a jejichž výsledky se posuzují prostým okem
    • poloautomatizované, resp. plně automatizované systémy – vyhodnocení jednotlivých reakcí, případně technická příprava je prováděna pomocí přístrojů
    • finální druhová identifikace se obvykle provádí numericky, nejčastěji pomocí osmičkového kódování, u sestav se širšími databázemi pomocí počítačových programů
    • RapID Yeast Plus Systém (Remel)
      • degradace specifických substrátů detekovaná různými indikátorovými systémy (5 testů prokazuje asimilaci a 13 hydrolýzu)
      • jednoduchá inokulace
      • identifikace po 4 hodinách při 30 °C
      • dodatková činidla
      • elektronické vyhodnocení
      • spolehlivost výsledků 78%
    • Uni-Yeast-Tek (Remel)
      • kolorimetrická souprava
      • asimilace 7 cukrů, průkaz utilizace KNO3, urey
      • uprostřed kukuřičný agar pro hodnocení mikromorfologie
      • inkubace při 22–30 °C po dobu 2–7 dní.
    • AUXACOLOR 2
      • obsahují 15 testů, z nich 13 prokazuje asimilaci sacharidů a alkoholů, zbylé dva citlivost k cykloheximidu a přítomnost fenoloxidázy
      • vyhodnocení kolorimetrické, tj. na základě změny barvy média
      • pro stanovení numerického profilu je nutné navíc vyhodnotit šest morfologických znaků
      • 24 – 72 h inkubace při 30 °C
      • spolehlivost výsledků 84%
    • CandidaTest21 (Erba Lachema)
      • asimilace 20 zdrojů uhlíku a utilizaci urey
      • hodnotí se 13 turbidimetrických a 8 kolorimetrických reakcí, které je v určitých případech nutné doplnit o mikromofologické znaky
      • inkubace při 25–30 °C po dobu 24 h.
      • pro identifikaci je možné využít diagnostický program
      • spolehlivost výsledků 87%
    • API 20 C AUX (bioMérieux)
      • asimilace 19 zdrojů uhlíku při 37 °C po dobu 48–72 h
      • hodnocení turbidimetrické (porovnávání stupně zákalu s negativní kontrolou)
      • v některých případech jsou vyžadovány dodatečné testy (utilizace KNO3, produkce ureázy nebo schopnost růstu při 42 °C)
      • spolehlivost identifikace méně obvyklých druhů je vyšší než u souprav založených na hodnocení barevných změn
      • spolehlivost výsledků 89%
    • ID 32 C (bioMérieux)
      • asimilace 24 cukrů, 5 organických kyselin, citlivost k cykloheximidu, hydrolýza eskulinu
      • hodnocení intenzity zákalu lze provádět po inkubaci 48–72 h při 30 °C prostým okem nebo pomocí přístroje
      • vyhodnocení testu se provádí na základě oktalového kódování pomocí programu Apiweb
      • považována za jednu z nejspolehlivějších souprav (nejmenší chybovost v případě méně obvyklých druhů kvasinek)
      • spolehlivost výsledků 96%
    • Micronaut-C (Merlin Diagnostika)
      • poloautomatizovaný systém
      • vyhodnocován fotometrem, příp. vizuálně
    • Vitek (bioMérieux)
      • plně automatizovaný systém
      • kolorimetrickou identifikaci kvasinek pomocí řady testů
      • automatická identifikaci pomocí databáze, obsahující 52 kvasinkových druhů
    • Biolog YT MicroPlate (Biolog)
      • nejrozsáhlejší databáze
      • využívá 94 biochemických testů v mikrotitrační destičce
      • možno diferencovat 267 druhů kvasinek z 53 rodů
      • výsledky jsou přístrojově vyhodnoceny celkem třikrát, za 24, 48 a 72 h
      • kultury je před testováním nutno inkubovat na BUY agaru (Biolog) při 30 °C
  • Hemokultivace
    • odběr krve pacienta a inokulace do hemokultivačního média v lahvičkách, které jsou pak dále inkubovány a sledovány v automatickém systému
    • standardně jsou očkovány lahvičky určené pro aerobní kultivaci, případně jsou doplňovány i o lahvičky pro kultivaci anaerobní
    • při podezření na mykologickou infekci – speciální mykologiké lahvičky
    • hemokultivační vyšetření (HMK) je jedno z nejpřínosnějších vyšetření při podezření na invazivní kandidózu
    • cílem je nejen informovat o pozitivním výsledku, ale i včas identifikovat původce infekce
    • odběr HMK před zahájením terapie, a to minimálně dva odběry (2x 7–10 ml) s časovým odstupem (max. do hodiny) nebo ze dvou různých odběrových míst
    • odběr po zahájení terapie – lahvičky se sorbentem
    • doporučuje se, aby byly lahvičky s hemokulturou vloženy do automatického kultivačního systému do jedné hodiny od jejich inokulace
    • systém monitoruje produkci CO2 množících se mikroorganismů
    • automatické systémy
      • kolorimetrický systém BacT/Alert (bioMérieux, Francie)
        • přítomnost CO2 je monitorována pomocí kolorimetrického senzoru v každé lahvičce
        • výsledkem je změna barvy indikátoru (z tmavě zelené na žlutou)
        • přístrojem je detekována i nepatrná změna barvy senzoru
        • pozitivita či negativita vzorků je určována pomocí rozhodovacího programu
        • vzorky jsou automaticky monitorovány a vyhodnocovány každých 10 minut
        • inkubace probíhá při 35 – 370C
      • fluorimetrický systém Bactec (Becton Dickinson, USA)
        • systém využívá k detekci CO₂ principu fluorescence
        • hemokultivační nádobky mají na dně senzitivní vrstvu, která je od média oddělena speciální membránou propouštějící pouze CO₂
        • CO₂ reaguje s vodou za vzniku kys. uhličité, přičemž klesá lokální pH
        • hodnota pH má vliv na množství fluorescence a nepřímo se tak měří množství CO₂ vzniklé při metabolismu mikroorganismů
        • inkubace probíhá při 350C
        • hodnota TTD (time to detection) je uváděna u každé pozitivní hemokultury
        • TTD je dobu (v hodinách) od vložení nádobky do přístroje do vyhodnocení pozitivity
        • pokud nedojde do sedmi dnů k ohlášení pozitivity, je hemokultura považována za negativní
        • TTD závisí na druhu mikroorganismu a na jeho množství v odebrané krvi
        • vysoká záchytnost kandid v mykologickém médiu, srovnatelná v obou systémech
        • doba růstu C. glabrata 2x delší než C. albicans a 3x delší než C. tropicalis
        • C. glabrata – nejvyšší mortalita
  • Histologický průkaz
    • průkaz blastokonidií či pseudomycelií pomocí histochemických metod z tkáně
    • popíšeme i míru postižení okolní tkáně, invazivitu procesu a přítomnost zánětu v okolí
    • nutnost odeslání vzorku na mykologickou kultivaci
    • barvení
      • HE (hematoxilin-eozin) – namodralé zbarvení
      • PAS (periodic acid Schiff) – červené zbarvení
        • při oxidaci polysacharidů kyselinou jodistou vznikají aldehydy, které reagují
        • s Schiffovým reagens a vytváří komplex s fialově červeným zbarvením
      • stříbření dle Grocotta – černé zbarvení
        • Kyselina chromová převádí složky buněčné stěny mikromycet na aldehydické sloučeniny, které mají redukční vlastnosti, díky čemuž jsou schopné z pracovního roztoku redukovat elementární stříbro, které se stává viditelným v místě jejich výskytu
  • Laboratorní diagnostika invazivní kandidózy
    • Podle kritérií EORTC/MSG za prokázanou invazivní kandidózu je považována infekce potvrzená histologicky nebo mikroskopicky průkazem blastokonidií či pseudomycelií ve vzorku získaném invazivními technikami (biopticky, peroperačně, endoskopicky) nebo kultivačně ze vzorku asepticky odebraného z normálně sterilních lokalit vykazujících klinické či radiologické známky infekce
    • pro průkaz invazivních onemocnění vyvolaných Cryptococcus neoformans je uznáván průkaz antigenu latexovou aglutinací v mozkomíšním moku

• • • MALDI-TOF MS
      • analýza buněčných proteinů hmotnostní spektrometrií
      • hmotnostní spektrometrie je založena na rozdělení nabitých částic podle jejich molekulových hmotností v elektrickém a magnetickém poli
      • rychlá a velmi přesná identifikaci bakterií, plísní a kvasinek
      • Příprava vzorku
        • jednotlivé kolonie jsou přeneseny na určitou pozici nosiče – terčíku MALDI target
        • vzorek je ošetřen speciální matricí a usušen
      • Princip
        • laser ozáří směs vzorku a matrice
        • matrice absorbuje energii pulsu a její rozklad ionizuje molekuly vzorku, především ve vysokých koncentracích přítomné ribozomální proteiny
        • pozitivně nabité ionty jsou pak na krátkou vzdálenost urychleny silným elektrickým polem a vstupují do vakua v trubici detektoru, kde se pohybují rychlostí úměrnou jejich hmotnosti a náboji
      • Vyhodnocení výsledků
        • vzorek (tj. kolonie mikroorganismu) je druhově identifikován porovnáním jeho hmotnostního spektra s databází
        • výstupem srovnávacího algoritmu je druhová identifikace mikroorganizmu s přiřazenou hodnotou skóre
      • Výhody
        • vysoce přesná
        • aplikovatelná pro široké spektrum mikroorganismů
        • mnohem rychlejší ve srovnání s tradičními metodami (provedení samotné analýzy v řádu minut)
        • ekonomicky efektivní
      • Nevýhody
        • vysoké pořizovací náklady

Aspergilózy

• zástupci rodu Aspergillus - popsáno 339 druhů, kolem 40 druhů popsáno jako původci mykotických infekcí u člověka
• oportunní patogeni
• saprofyté celosvětově rozšířeni, jsou přítomny v půdě, ve vzduchu, v rostlinných i živočišných zbytcích
• častý kontaminant potravin a krmiv
• aspergilóza je po kandidóze druhé nejčastější mykotické onemocnění u silně imunokompromitovaných pacientů
• Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus nidulans
• Postižení respiračního systému má 3 základní formy:
  • alergickou plicní aspergilózu
  • plicní aspergilom
  • invazivní aspergilózu (IA)
• původci povrchových infekcích – onychomykózy (mykóza nehtového aparátu)
• původci infekce zevního zvukovodu – otomykózy
• původci myktoxikóz - producenti mykotoxinů (aflatoxin) poškozujících ledviny a játra, zdrojem jsou zejména arašídy, oříšky kešu, pistácie a sušené plody
• Alergická plicní aspergilóza
  • bronchiální astma, exogenní alergická alveolitida a alergická bronchopulmonální aspergilóza (ABPA)
  • plicní onemocnění způsobené hypersenzitivitou k aspergilovým antigenům při kolonizaci dolních dýchacích cest aspergily
  • postihuje především nemocné s astmatem a cystickou fibrózou
  • výskyt ABPA v populaci: u astmatiků se uvádí 1-2 %, u nemocných s cystickou fibrózou cca 8-10 %
  • při tomto onemocnění jsou dýchací cesty kolonizovány aspergilem, k invazi do organizmu nedochází
  • klinickými příznaky jsou kašel, dušnost, teplota
  • Diagnostiká kritéria alergické bronchopulmonální aspergilózy (ABPA)
    • astma
    • okamžitá kožní reakce na Aspergillus
    • kultivační průkaz aspergila ve sputu, přítomnost IgG a IgE proti A. fumigatus v séru
    • výskyt plícních infiltrátů na CT hrudníka
    • eozinofílie v krvi, ve sputu a v bronchoalveolární laváži
    • průkaz aspergilového antigenu v séru
• Aspergilom
  • u pacientů s preexistujícími dutinami v plících
  • aspergilom je projevem saprofytické kolonizace plicních dutin vzniklých většinou po prodělané plicní tuberkulóze, z rozpadlého tumoru (Jovresova kaverna), při invazivní plicní aspergilóze
  • houba do okolní tkáně neinvaduje, ani nedochází k diseminaci infekce
  • rentgenologický nález ukáže typický obraz vzdušné dutiny s pohyblivým kulovitým útvarem uvnitř, který je tvořen shlukem hyf, zbytků tkání, fibrinu a zánětlivých buněk
• Aspergilom – diagnostika
  • rentgen nebo CT hrudníku
  • kultivace ze sputa je pozitivní jen v 50 % případech
  • přítomnost protilátek IgG proti A. fumigatus
• Invazivní aspergilóza (IA)
  • k infekci dochází aspirací konidií ze vzduchu
  • plicní (80-90%) nebo sinonazální infekce u imunosuprimovaných jedinců
  • podle invaze do plicních struktur se rozlišují 3 typy plicní aspergilózy – bronchoinvazivní aspergilóza, angioinvazivní aspergilóza a nekrotizující aspergilóza
  • u 10 – 20% případů infekce diseminují do CNS, kůže či jiných lokalit
  • příznaky plicní IA je neustupující horečka i přes léčbu ATB, kašel, bolest na hrudi, dušnost
  • při invazivní sinonazální aspergilóze dominují příznaky: horečka, kašel, bolest hlavy, výtok z nosu, lokální bolest, bolest v krku
  • při šíření infekce krevním řečištěm dosahuje mortalita 50 – 100%
  • konidie pronikají do alveolů, kde v závislosti na stavu hostitele
  • postupně vyrůstají ve formě hyfových vláken
  • růst mycelia má 3 fáze:
    • 1. fáze logaritmického růstu - bohatá látková výměna spojená s tvorbou organických substrátů nutných k výstavbě myceliální stěny. Je podmíněna dostatkem živin a hlavně glukózy v okolní tkáni. V této fázi může být uvolňován galaktomanan, který pak detekujeme v materiálu z dolních dýchacích cest nebo v séru.
    • 2. fáze stacionární - po vyčerpání zdrojů glukózy
    • 3. fáze - lýza a destrukce hyf
  • Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger, vzácně pak A. oryzae
  • Diagnostika IFD (invazivní mykotické onemocnění)
    • Podle mezinárodních kritérií jsou IFD děleny:
      • Prokázané
      • pravděpodobné
      • možné
    • Mezinárodních kritéria:
      • přítomnost predispozičních faktorů
      • klinické projevy onemocnění (dušnost, radiologický nález plicních infiltrátů)
      • průkaz mykózy pomocí mikrobiologických technik (přímá mikroskopie, kultivace klinického materiálu, detekce antigenů, histologický průkaz mykotických vláken ve tkáni)
      • nestandardizované postupy – panfungální PCR, specifická PCR v reálném čase
  • Prokázaná invazivní aspergilóza
    • histo/cytopatologický průkaz vláken získané aspirací tenkou jehlou nebo z bioptického vzorku tkáně s průkazným vztahem (mikroskopicky nebo nesporně zobrazovací technikou) k poškozené tkáni nebo
    • pozitivní kultivace ze vzorku získaného sterilním odběrem z normálně sterilního místa (s výjimkou vzorků moči a sliznic), které klinicky nebo radiologicky odpovídá místu infekce
  • Pravděpodobná invazivní aspergilóza
    • přítomnost alespoň jednoho z rizikových faktorů hostitele a jednoho mikrobiologického kritéria a jednoho velkého (nebo dvou malých) klinických kritérií s klinickými projevy místa (orgánu) odpovídajícími infekci
  • Možná invazivní aspergilóza
    • přítomnost alespoň jednoho z rizikových faktorů hostitele a buď jeden mikrobiologický faktor nebo jeden velký klinický faktor (nebo dva malé) odpovídající infekci
  • Mikrobiologické faktory (IA)
    • pozitivní kultivace nebo mikroskopický průkaz Aspergillus spp. Ze sputa nebo BAL
    • pozitivní kultivace nebo mikroskopický průkaz Aspergillus spp. Z aspirátu ze sinusů
    • pozitivní antigen – galaktomanan – v BAL, likvoru, krvi (v krvi minimálně ze dvou po sobě jdoucích odběrů)
  • Klinický materiál pro mykologické vyšetření (IA)
    • za ideální se považují vzorky odebrané přímo z podezřelého ložiska invazivními technikami (biopticky, endoskopicky, peroperačně)
    • v případě, že nemáme tuto možnost, snažíme se odebrat materiál z postižené lokality, např. BAL při postižení plic, výplach z dutin, mok při ložiskovém postižením CNS
    • technika odběru by měla maximálně omezit možnost kontaminace vzorku
    • při malém množství získaného materiálu nebo hrozí-li vyschnutí, je vhodnější odebírat přímo do tekutého kultivačního media nebo sterilního fyziologického roztoku
    • vzorky dodáme do laboratoře co nejrychleji, v případě nutnosti uchováváme při 4 °C, materiál odebraný do kultivačních medií uchováváme při pokojové teplotě
  • Diagnostika IA
    • Mikroskopické metody:
      • septované hyfy s charakteristickým dichotomickým větvením
        • histologický průkaz (PAS, stříbření dle Grocotta, barvení HE)
        • nativní preparát
        • barvení podle Grama
    • Kultivace klinického materiálu :
      • kultivační průkaz ze sterilních tkání získaných biopsií, bronchoalveolární laváže, pleurálního výpotku, hemokultury
      • kultivace na Sabouraudově glukózovém agaru při 30 – 37 °C, následná identifikace na diagnostických médiích
      • nejdříve můžeme očekávat narostlé kolonie aspergilů za 24–48 hod u druhu Aspergillus fumigatus nebo Aspergillus flavus
      • kultivační vyšetření má vysokou specifitu (92 %) v případě pozitivního nálezu, ale nízkou senzitivitu (50 % a méně) ve srovnání s dalšími metodami
    • Interpretace nálezu
      • významný je nález oportunních patogenů z primárně sterilních lokalit (krev, mozkomíšní mok, bioptické tkáně)
      • při izolaci z materiálů, jako je sputum nebo i sekret z dolních dýchacích cest (DDC), musí být nález interpretován s velkou opatrností
  • Nekultivační diagnostické metody
    • metody sérologické – využívající detekci antigenů, protilátek nebo metabolitů
    • metody molekulárně genetické – detekující nukleové kyseliny aspergilů
    • Detekce galaktomananu
      • zástupci rodu Aspergillus uvolňují při svém růstu do okolí exoantigeny, které mohou být detekovány v tělesných tekutinách
      • jedním z těchto exoantigenů je termostabilní heteropolysacharid, který je součástí buněčné stěny houby – galaktomanan (GM)
      • na zvířecích modelech byla prokázána korelace mezi mykotickou náloží ve tkáních a množstvím detekovatelného GM v séru
      • faktory ovlivňující množství GM: fáze růstu hyf, mikroprostředí, ve kterém probíhá infekce, imunitní stav jedince, stav funkce ledvin a antimykotická léčba
      • pravidelný a rutinní monitoring GM umožňuje zkrátit časový interval do stanovení diagnózy
      • pro jeho detekci je možno použít latexovou aglutinaci a zejména sendvičovou ELISu
      • metody se liší detekčním limitem i senzitivitou
      • komerčního užití – latexová aglutinace (Pastorex Aspergillus, BioRad) a sendvičová ELISA (Platelia Aspergillus, BioRad, Francie)
      • oba komerční sety využívají vazbu antigenu s králičí monoklonální protilátkou EB-A2
      • ELISA – vyšší citlivost, výsledek je udáván jako index pozitivity (IP) – tj. poměr mezi optickou denzitou testovaného vzorku a optickou denzitou kontrolního séra obsahujícího přibližně 1 ng GM/ml
        • pozitivní se označuje vzorek s IP > 0,5
        • pozitivní pacient je nemocný s více než 2 po sobě jdoucími pozitivními odběry
        • test je primárně určen pro detekci GM v séru, ale lze ho použít k detekci GM i v jiných tělesných tekutinách ev. v tkáních
    • Detekce 1,3-ß-D glukanu
      • součástí buněčné stěny většiny hub
      • glukan se vylučuje o něco později než galaktomanan a jeho koncentrace je nižší
      • pro laboratorní diagnostiku se využívá schopnosti glukanu reagovat s lyzátem amébocytů ostrorepa
      • Komerční kity:
        • FungitellTM, cutt-off 80 pg/ml, kolorimetrická
        • Fungitec GTM, cutt-off 20 pg/ml, kolorimetrická
        • Wako WB003, cutt-off 11 pg/ml, turbidimetrická

Cut-off je hodnota tzv.cut-off indexu pozitivity (cut-off IP), tedy hodnota indexu pozitivity, od které je vzorek označen jako pozitivní a ovlivňuje senzitivitu testu

• • • • Výhody
        • pozitivita v časných stadiích invaze houby
        • široké spektrum patogenů, které lze detekovat (i nevýhoda)
        • umožňuje monitorovat status infekce a léčebnou odpověď
      • Nevýhody
        • vysoká cena
        • laboratorní náročnost
        • falešné pozitivity (např. laboratorní kontaminace)
        • falešné negativity (malé množství materiálu vstupujícího do reakce (5 μl), vysoká koncentrace bilirubinu)
      • Využití v diagnostice
        • verifikaci infekcí vzácnými mykotickými agens
        • konfirmace falešných pozitivit GM
• Identifikace druhů rodu Aspergillus
  • makroskopická a mikroskopická morfologie
  • sledování produkce sekundárních metabolitů
  • molekulární genetika
  • Molekulárně genetické metody
    • specifická PCR v reálném čase – kvantifikace fungální nálože
    • identifikace do rodu a druhu – části genu pro rRNA (18S, 5,8S a 28S) nebo sekvence mezerníků (ITS)
    • pro sledování genetické příbuznosti druhů je u aspergilů nutná sekvenční analýza dalších lokusů
  • Vnitrodruhová typizace aspergilů
    • PCR-RFLP s následnou sekvenční analýzou genu pro ß-tubulin (benA) či genu rodlet A (rodA) - pro rozlišení druhů fenotypicky podobných A. fumigatus
    • multilokusová sekvenční typizace (MLST) – sekvenování fragmentů „referenčních“ genů – využívána pro rutinní typizaci umožňující mezinárodní srovnávání izolátů
  • Aspergillus – makroskopické znaky
    • rychle rostoucí, plně vybarvené kolonie do pěti dnů
    • kolonie bohatě pigmentované (v odstínech žlutozelené, hnědé a černošedé)
    • pigmentace je výrazná na Czapek-Doxově agaru (CZ)
    • kolonie se hodnotí na standardních živných médiích: Czapkův agar s kvasničným extraktem (CYA), agar se sladovým extraktem (MEA), CZ při standardní kultivační teplotě: 25°C, 37°C
    • Makroskopické znaky:
      • rychlost růstu
      • zbarvení kolonií, spodní strany kolonií, povrchová struktura kolonií
      • velikost kolonií po 7, 10, 14 dnech
      • vzhled konidiální hlavice pod binokulární lupou
    • Nativní preparát: vlákna hub se špatně smáčejí a v preparátu často bývají vzduchové bubliny, je lépe použít místo vody 10 až 20% vodný roztok glycerolu, který nevysychá tak rychle. Místo glycerolu lze použít i roztok laktofenolu nebo kys. mléčnou.
  • Nepohlavní stádium
    • konidiofor vyrůstá přímo ze substrátu nebo ze vzdušných hyf
    • měchýřek (kolumelu)
    • fialidy (konidiogenní buňky) v jedné nebo ve dvou řadách nad sebou (uniseriátní a biseriátní)
    • konidiální hlavice - měchýřek s fialidami a řetězci konidií
    • tlustostěnné buňky zvané „Hülle cells“

• • Pohlavní stadium
    • Tvorba drobných plodnic (menších než 1mm) typu kleistothecium
    • teleomorfa Eurotium, Emericella, Neosartorya
    • Kleistothecium: uzavřená plodnice s vytvořenou stěnou, otvírá se rozpadem; vřecka nejsou nijak uspořádána

Aspergillus fumigatus

• kontaminant potravin, oportunní patogen člověka a jiných živočichů častý ve vlhkém, teplém prostředí (kompost, ale i zvlhčovací systémy, obytné prostory)
• zodpovědný za 90% všech případů IA
• termotolerantní - roste i při 55°C
• adaptace na nedostatek kyslíku > přežití v zánětlivé tkáni a umožňuje šíření do jiných orgánů
• produkuje mykotoxiny gliotoxin, verruculogen, fumitremorginy aj.
• dvě podskupiny – ve vzduchu a ve vodě
• druhy fenotypicky podobné: A. lentulus, A. viridinutans, Neosartorya fischeri, N. pseudofischeri, N. undagawae
• diagnostcký znak: A. fumigatus roste při teplotě 50°C a neroste při 10°C, kdy ostatní zaměnitelné druhy rostou (výjimkou je A. viridinutans)
• kolonie rychle rostoucí při 25 i 37°C, zelené, sametové
• konidiofory uniseriátní s široce kyjovitým měchýřkem
• konidiální hlavice typicky sloupcovité
• konidie kulovité nebo téměř kulovité, zelené, bradavčité, 2,5-3 μm v průměru

Aspergillus flavus

• rychle rostoucí, žlutozelené, roste i při teplotě až 48 °C
• výskyt v půdě, na potravinách (arašídy, koření, obiloviny)
• produkuje aflatoxin B1, 3-nitropropionovou kyselinu, kojovou, aspergilovou a cyklopiazonovou kyselinu
• z 10% původce bronchopulmonárních infekcí
• konidiofory biseriátní i uniseriátní, bradavičnaté s kulovitým nebo téměř kulovitým měchýřkem
• konidiální hlavice paprsčité konidie kulovité nebo téměř kulovité, bradavčité

Aspergillus niger

• kontaminant potravin rostlinného tak i živočišného původu
• produkuje naphtho-4-pyrony, malforminy a u několika kmenů produkce ochratoxinu A
• z 5% původcem IA, otomykózy
• optimální klíčivost konidií v acidofilním prostředí
• teplotní optimum je 30°C
• specifickým diagnostický znakem je přítomnost kalcium oxalátum ve formě krystalů v patologickém vzorku
• kolonie rychle rostoucí, černé, zrnité, často produkuje žlutý pigment do agaru
• konidiofory biseriátní, hladké s kulovitým měchýřkem
• konidiální hlavice paprsčité
• konidie kulovité nebo téměř kulovité, černé, nepravidelně bradavčité, 3,5-5 μm v průměru

Aspergillus terreus

• rychle rostoucí, okrové, sametové, roste i v 37 °C
• na potravinách a v budovách, bývá izolován i z půdy
• původce IA se sklonem k diseminaci, sekundární kožní infekce
• konidiofory biseriátní, hladké s téměř kulovitým měchýřkem
• konidiální hlavice sloupcovité
• konidie kulovité až elipsoidní, hladké, malé, 1,5 - 2,5 μm v průměru
• na substrátovém myceliu se tvoří kulovité buňky

Aspergillus nidulans

• kolonie rychle rostoucí při 25 i 37 °C, sametové, zelené
• tvorba plodnic – syn. teleomorfa Emericella nidulans
• kontaminant potravin
• produkuje mykotoxin sterigmatocystin aj.
• vyskytuje se vzácně, virulentnější než A. fumigatus, vyšší rezistence k některým antimykotikům
• plodnice kulovité, 100-300 μm v průměru, obalené vrstvou světle žlutých až béžových „hülle cells“
• vřecka kulovitá, s 8 askosporami, askospory červené, čočkovité, hladké
• konidiofory biseriátní, hladké, nahnědlé s kulovitým měchýřkem konidie v řetízcích, kulovité, bradavčité

Mukormykózy (zygomykózy)

• ubikvitní saprofyté z řádu Mucorales (na rostlinách, organických substrátech, v půdě, na exkrementech)
• kontaminantami klinického matriálu z prostředí (snadno se šíří vzduchem)
• vzácné oportunní infekce s vysokou mírou mortality
• rostoucí tendence výskytu u pacientů imunosuprimovaných, fagocytóza je důležitým obranným mechanizmem
• respirační cesta, kožní poranění
• invazivní infekce - rhinocerebrální a pulmonární mukormykózy, vzácněji gastrointestinální
• kožní infekce u těžkých popálenin a závažných poranění
• otomykózy zevního zvukovodu (starší diabetici)
• rhinocerebrální forma
  • postihuje hlavně diabetiky s acidózou
  • začíná ve vedlejších dutinách nosních odkud se šíří do očnicové dutiny a dále zasahuje CNS
  • vyvolá obstrukci nosu, mohutné zduření nosu, tváří a horního rtu, otok očnice
  • postižená tkáň nekrotizuje
  • k úmrtí dochází v průběhu 1 – 2 týdnů
• pulmonární forma
  • postihuje hlavně pacienty s těžkou neutropenií, s hematogenními malignitami, po transplantaci kožní dřeně a po dlouhodobé léčbě kortikosteroidy
• gastrointestinální forma
  • vzniká vzácně u nedonošených dětí, podvyživených pacientů a pacientů s postižením střev
• otomykóza - zánět zevního zvukovodu projevující se vatovitým povlakem od žlutobělavé po zelenočernou barvu ve zvukovodu
• afinita hyf ke stěnám velkých cév, do kterých prorůstají + rychlý růst => živého trombu (spleť hyf, trombocytů, lymfocytů) => embolii => smrti
• jsou rezistentní k antimykotikům, účinný je pouze amfotericin B (nasazení do 6 dnů od vzniku mykózy)
• klinicky významné rody Rhizopus, Mucor, Rhizomucor,Lichtheimia(Absidia), Cuninghamella z Mucorales
• invazivní mukormykózy – Rhizopus microsporus, Rhizopus oryzae, Rhizomucor pussillus, Lichtheimia corymbifera, Cuninghamella bertholletiae, Apophysomyces elegans

Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales

• mnohojaderné (coenocytické) neseptované mycelium, přehrádky pro oddělení rozmnožovacích struktur
• buněčná stěna tvořená chitinem
• nepohlavní rozmnožování pomocí sporangiospor uvnitř sporangií nesených sporangiofory
• sporangia - monosporická, multisporická
• vývojově odvozenější druhy – redukce počtu spor
• u řady zástupců přítomnost kolumely (sterilní sloupeček) případně s apofýzou
• sporangium se otvírá rozpadem stěny, na bázi zůstává tzv. límeček
• apofýza - rozšířená část sporangioforu přímo pod sporangiem
• rhizoidy
• stolony
• životní cyklus haplobiotický s převahou haploidní generace – vegetativní stélka je haploidní, zygota je jedinou diploidní buňkou, při jejím klíčení proběhne meióza a vyroste nová haploidní stélka
  • pohlavní proces – gametangiogamie – vzniká zygospora
  • homotalické druhy – gametangia vznikají i na stejném myceliu
  • heterotalické druhy – gametangia vznikají na pohlavně odlišných myceliích (+ a –)
• Kultivační média vhodná pro identifikaci zygomycetů
  • kultivačně nenáročné
  • sladinový agar (SL)
  • agar s maltextraktem (MEA) termofilní, max. 50 – 52°C
  • bramborodextrózový agar (PDA)
  • Sabouraudův agar (SAB) a podobná média s obsahem peptonu, kvasničného extraktu nebo maltextraktu
  • rostou rychle 1-3 dny (mycelium)
  • kultivační podmínky: při 25 °C a 37 °C po dobu 3-7 dní
  • některé druhy je vhodné kultivovat i při 45 °C nebo 50 °C.
  • zygospory se tvoří obvykle při 20 °C
• Rhizopus
  • Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Mucoraceae
  • Rhizopus microsporus, Rhizopus oryzae
  • nejčastější původce mukormykózy
  • stolony, svazečky sporangioforů, rhizoidy
  • deštníkový tvar kolumely
  • Rhizopus microsporus
    • kolonie světle hnědé až šedé, výška 10 mm
    • termofilní, max. 50 – 52°C
    • heterothalický druh
    • stolony a rhizoidy vytvořeny; rhizoidy jednoduché
    • sporangiofory hnědavé, vyrůstají po 1-2 na stolonech proti rhizoidům
    • sporangia šedočerná
    • kolumely téměř kulovité až kuželovité, šedavé
    • sporangiospory angulární (hranaté) a široce elipsoidní, na povrchu zřetelně podélně rýhované.
    • zygospory se tvoří nejlépe při 30° C na mediu YEA, jsou červenohnědé, na povrchu s hvězdicovitou ornamentací; suspenzory nestejné, proti sobě postavené
  • Rhizopus oryzae
    • od R. microsporus se liší delšími sporangiofory,
    • většími rhizoidy a neschopností růstu při 50 °C
• Mucor
  • Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Mucoraceae
  • M. circinelloides, M. indicus, M. ramosissimus a M. amphibiorum
  • rhinocerebrální mukoromykózy, infekce těžkých popálenin, otomykózy zevního zvukovodu
  • sporangiofory větvené nebo nevětvené bez rhizoidů a stolonů mnohosporová sporangia s kolumelou
  • Mucor circinelloides
    • sporangiofory opakovaně sympodiálně větvené; větve různé délky, často circinátní (silně zahnuté)
    • max. růstová teplota 37°C
• Absidia
  • Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Cunninghamellaceae
  • kontaminanta klinického materiálu
  • Absidia coerulea
    • kolonie s fialovým až modrofialovým odstínem
    • neroste při 37 °C
    • stolony, rhizoidy, svazečky sporangioforů
    • kolumely s větším zaobleným výběžkem a typickou apofýzou
• Lichtheimia
  • Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Lichtheimiaceae
  • Lichtheimia corymbifera (syn. Absidia corymbifera, Mycocladus corymbifer)
    • infekce vzácné, zejména u hematoonkologických pacientů
    • kolonie rychle rostoucí, vysoké, světle šedé
    • termotolerantní, max. 45-50°C
    • stolony a rhizoidy nezřetelné
    • sporangiofory jednoduché i rozvětvené; tvořící přeslen
    • kolumely typicky kuželovité, s jedním nebo s několika krátkými výběžky na vrcholku
    • obří buňky („giant cells“) různého tvaru a velikosti, hojné ve vzdušném myceliu
    • od rodu Absidia se liší umístěním přehrádky pod apofýzou ve větší vzdálenosti a růstem při 37 °C
• Rhizomucor
  • Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Lichtheimiaceae
  • Rhizomucor pusillus
    • kolonie nízké, modrošedé, později šedohnědé
    • termofilní druh, max. 55°C
    • od rodu Rhizopus se liší tvorbou větvených sporangioforů a méně vyvinutými rhizoidy
    • od rodu Mucor se liší především tvorbou rhizoidů
    • hnědavé rhizoidy
    • sporangiofory větvené monopodiálně nebo sympodiálně většinou pod vrcholkem
• Apophysomyces
  • Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Mucoraceae
  • Apophysomyces elegans
    • kolonie rychle rostoucí, žluté až hnědošedé sporangiofory větvené monopodiálně nebo sympodiálně většinou pod vrcholkem
    • rostou i na médiích s cykloheximidem
    • na běžných médiích nesporuluje
    • rhizoidy
    • sporangiofory nevětvené, vyrůstají jednotlivě z hyfového segmentu připomínajícího „foot cells“ u rodu Aspergillus
    • apofýza nálevkovitého nebo zvoncovitého tvaru
    • kolumela půlkulatá
    • sporangia hruškovitého tvaru
    • sporangiospory hladké, podlouhlé, světle hnědé
• Saksenaea vasiformis
  • Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Saksenaeaceae
  • kolonie šedé, na běžných médiích nesporuluje
  • sporangiofory jednotlivě, nevětvené
  • dichotomicky větvené rhizoidy
  • terminální sporangia lahvicovitého tvaru s kolumelou
• Laboratorní identifikace Apophysomyces elegans a Saksenaea vasiformis
  • Metoda indukující sporulaci zygomycet (Padhey a Ajello, 1988):
    • kultivace kultury na SDA (Sabouraud Dextrose Agar) při 26°C, 1 týden
    • vyříznutí malého agarového bloku (1cm²) s kulturou
    • transfer bloku do středu Petriho misky s obsahem 20 ml sterilní destilované vody a 0,2 ml sterilního 10% kvasničního extraktu
    • inkubace ve vodním roztoku při 35-37°C
    • po 5 dnech kultivace se na povrchu vody vytvoří tenký film
    • zhotovení preparátu (bavlníková modř v laktofenolu) z části tenkého filmu po 5, 10 a 15 dnech inkubace
• Cunninghamella
  • Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Cunninghamellaceae
  • Cunninghamella bertholletiae
    • infekce osob s poruchami imunity
    • původce nemocničních nákaz
    • kolonie bílé, později šedé
    • termofilní druh, max. 45°C
    • rhizoidy vyvinuté, stolony chybí
    • sporangiofory vzpřímené, větvené, zakončené sporogenními hlavicemi (vezikuly)
    • sporogenní hlavice pokryté krátkými stopkami nesoucími sporangioly (jednosporová sporangia) na povrchu ostnité
• Syncephalastrum
  • Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Syncephalastraceae
  • Syncephalastrum racemosum
    • kontaminanta klinického materiálu
    • kolonie rychle rostoucí, zprvu bílé, později tmavošedé
    • max. růstová teplota 40°C, rhizoidy vyvinuté
    • sporangiofory jednoduché, později nepravidelně větvené, vzpřímené nebo poléhavé, často podobné stolonům, nepravidelně přehrádkované, zakončené kulovitými sporogenními hlavicemi (vezikuly)
    • merosporangia na povrchu vezikuly; obsahují jednu řadu sporangiospor
• Cokeromyces recurvatus
  • Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Thamnidiaceae
  • koprofilní, z trusu hlodavců a ještěrek, také z půdy
  • příležitostný patogen člověka
  • kolonie nízké, s nepravidelným okrajem, hnědé až černé barvy
  • stolony nejsou vyvinuty
  • sporangiofory jednoduché, terminálně vytvářejí kulovité zduřeniny, nesoucí několikasporové sporangioly na stočených sekundárních sporoforech
  • sporangioly mají kolumelu a obsahují 10-25 sporangiospor
• Basidiobolus
  • Fungi, Fungi, Zoopagomycota, Entomophthoromycotina, Basidiobolomycete, Basidiobolales, Basidiobolaceae
  • Basidiobolus ranarum
    • běžnou součástí mikroflóry zažívacího traktu zvířat, na odumřelých rostlinách, exkrementy plazů a obojživelníků
    • původce podkožní infekce, méně často gastrointestinální infekce
    • výskyt v tropických oblastech
    • kolonie krémově šedé, radiálně zvrásněné
    • satelitní kolonie se tvoří klíčením konidie odmrštěné z primární kolonie
    • hyfy veget. mycelia septované, složeny z krátkých 1jaderných segmentů
    • dva typy nepohlavních spor
    • sporangiofory subterminálně zduřelé odmršťují primární kulovité sporangioly
    • sekundární hruškovité sporangioly se pasivně oddělují od krátkých úzkých sporangioforů
    • přenos do hostitelského organizmu: trávicím traktem obojživelníků (komenzál) => hmyz => hostitel
• Conidiobolus
  • Fungi, Zoopagomycota, Entomophthoromycotina, Entomophthoromycetes, Entomophthorales, Ancylistaceae
  • C. coronatus, C. incongruus , C. lamprauges
  • saprotrofní houby, vyskytující se v půdě, na opadu a na trusu
  • mohou být příčinou mykóz u lidí, koní nebo jiných savců (např. rhinoentomophthoromykózy)
  • tropické oblasti Afriky
  • mnohojaderné primární a sekundární sporangioly na vrcholu nevětvených sporangioforů
  • primární sporangiola často vyklíčí a vytvoří menší sekundární sporangiolu (exogenní konidii), která je znovu odmrštěna
  • morfologicky i způsobem odstřelení jsou sekundární sporangioly podobné primárním sporangiolám
  • stěna mezi sporangiolou a sporangioforem je ve zralosti složená ze tří vrstev; střední lamela se rozpustí a spora je papilárním vyklenutím prudce odmrštěna; papila zůstává patrná i po odmrštění
  • ve starší kultuře se tvoří spory (chlamydospory) s vlasovými přívěsky na povrchu
• Mukormykózy – diagnostika
  • možnosti diagnostiky značně omezené
  • komerčně dostupné, jednoduché a spolehlivé metody nejsou k dispozici
  • soubor klinických, radiologických, histologických a mikrobiologických metod
  • kultivační průkaz stojí až na druhém místě, umožní bližší identifikaci
  • přímý mikroskopický průkaz hyf typických pro zygomycety v postižené tkáni
  • PCR (od roku 2008)
  • nepodkročitelné minimum laboratorní diagnostiky – identifikace na úroveň rodu Mucor spp., Rhizopus spp., Rhizomucor spp., Lichtheimia spp.
  • klinický materiál: stěry z kožních lézí , biopsie plicních lézí , stěry a aspiráty z nosních dutin, biopsie
  • upozornění: coenocytické hyfy bývají často při odběru a zpracování klinického materiálu (homogenizace) poškozené a stávají se neživotaschopnými a tudíž obtížně kultivovatelnými
  • pro kultivační průkaz je zapotřebí se vyhnout nadměrnému poškození tkáně při odběru a laboratorním zpracování vzorků
  • prokazatelné přímou mikroskopií: stěry, sputum a exudát – louhový preparát (MycoInk, Calcofluor)
  • tkáňové řezy se barví pomocí HE, PAS, a stříbření dle Grocotta
  • vzorky se vyznačují přítomností širokých (6-15 μm), tenkostěnných, zřídka septovaných hyf, nepravidelně větvených v odstupu 90°

Hyalohyfomykózy

• obecný termín používaný pro skupinu mykotických infekcí, jejichž původci jsou zástupci hyalinních hyfomycet (nepigmentované), které nejsou původci jinak pojmenovaných infekcí, např. aspergilózy
• k původcům patří Penicillium, Paecilomyces, Acremonium, Beauveria, Fusarium a Scopulariopsis
• tyto houby žijí jako saprofyté na rozkládající se organické hmotě a jejich konidie se šíří vzduchem
• klinické projevy hyalohyfomykózy mohou být neškodné saprofytické kolonizace až akutní invazivní onemocnění
• vyvolávají onemocnění u imunokompromitovaných pacientů, zejména u pacientů s leukémií nebo po transplantaci kostní dřeně, léčbě kortikosteroidy, cytotoxické chemoterapie a v menší míře u pacientů s AIDS
• Fusarium
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Hypocreomycetidae, Hypocreales, Nectriaceae
  • výskyt na substrátech rostlinného původu, kontaminant krmiv, obilí, významný producent mykotoxinů (fumonisiny, zearalenon,moniliformin aj.), fytopatogenní druhy a oportunní patogeni člověka (Fusarium oxysporum a Fusarium solani)
  • charakteristický tvorbou vícebuněčných zakřivených makrokonidií (česky srpatka)
  • při porušení povrchových bariér – karatokonjuktivitidu (při poškození rohovky) a onychomykózu (již narušených nehtů)
  • u osob s vážně oslabeným imunitním systémem může dojít k rozvoji invazivní infekce
  • využití: Fusarium venenatum – Quorn (masová náhražka)
  • Média doporučená pro identifikaci:
    • makroznaky kolonií - bramboro-dextrózový agar (PDA) a bramboro-sacharózový agar (PSA), 25°C, tma
    • mikroznaky - Synthetic Nutrient-Poor Agar (SNA), 25°C, 12 hod. světlo blízké UV/12 hod. tma
    • Makroznaky
      • barva kolonie
      • zbarvení spodní strany kolonií
      • rychlost růstu
      • vůně
    • Mikroznaky
      • mikrokonidie – tvar, velikost, tvorba řetízků nebo shluků
      • makrokonidie – tvar, velikost, tvar nožní a apikální buňky
      • typ fialid – monofialidy, polyfialidy, tvar
      • chlamydospory – schopnost tvorby (terminální, interkalární, jednotlivě, ve shlucích, v řetízcích
      • sporodochium – polštářkovitý útvar hyf s palisádovitě uspořádanými konidiofory na povrchu hostitele
  • Fusarium solani
• Penicillium
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Eurotiales, Trichocomaceae
  • cca 225 druhů
  • výskyt: půda, ovzduší, častý kontaminant potravin a krmiv
  • producent mykotoxinů a mnoha dalších extrolitů
  • alergenní
  • v laboratoři kontaminanta klinického materiálu
  • využití: startovací kultury k výrobě sýrů (P. camemberti, P. roqueforti), výroba antibiotika penicilínu, P. nalgiovense – fermentované uzeniny
  • Makroskopické znaky
    • kolonie pestře pigmentované
    • rychlý růst
    • standardní živná média: CYA, MEA
    • kultivační teplota: 25°C, 37°C
    • Nejvýznamnější makroskopické znaky:
      • rychlost růstu (velikost kolonií)
      • zbarvení kolonií, reverz kolonií,
      • povrchová struktura kolonií
      • produkce exudátu
  • Mikroskopické znaky
  • nepohlavní stádium – štětičkovité konidiofory, konidie
  • pohlavní stádium - Eupenicillium, Talaromyces, charakteristické tvorbou drobných plodnic
  • hodnotí se stavba konidioforu
  • 4 typy konidioforů:
    • monoverticilátní (podrod Aspergilloides)
    • terverticilátní (podrod Penicillium)
    • biverticilátně symetrický (podrod Biverticillium)
    • divarikátní (podrod Furcatum)
  • Fyziologické znaky (podrod Penicillium)
    • médium CREA - agar s kreatinem a indikátorem pH (bromkresolový purpur), který je při výchozím pH 8 fialový
    • schopnost využívat kreatin jako zdroj N (růst)
    • schopnost tvorby kyselých l. (žluté zbarvení)
    • schopnost tvorby zásaditých látek (fialové zbarvení agaru)
  • Biochemické znaky (podrod Penicillium)
    • detekce mykotoxinů povahy alkaloidů pomocí Ehrlichova činidla (dimethylaminobenzaldehyd, ethanol, HCl)
    • produkce kyseliny cyklopiazonové
    • pozitivní reakce: světle fialové „haló“
  • Penicillium marneffei
    • jediný pro člověka prokazatelně patogenní druh
    • endemické onemocnění v jihovýchodní Asii a Číně
    • rezervoárem infekce je zažívací trakt místních hlodavců
    • vstupní branou infekce je gastrointestinální trakt nebo dýchací cesty
    • u imunokompromitovaných osob se rozvíjejí těžké infekce postihující plíce, játra a kůži
    • případy laboratorní infekce, biohazard 3 (některé země)
    • dimorfní – v postižené tkáni tvoří protáhlé jednobuněčné útvary podobné kvasinkám
    • kolonie pomalu rostoucí, sametové, produkující oranžový až červený pigment, roste při 37°C
    • konidiofory terminálně větvené (biverticilátní)
    • fialidy ampuliformní až acerózní
    • konidie elipsoidní
• Paecilomyces
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Eurotiales, Trichocomaceae
  • Paecilomyces variotii - prokázána účast na vzniku endokarditidy, endoftalmitidy a kožních infekcí
  • Paecilomyces lilacinus – infekce oka
  • podobná stavbu konidioforu jako u rodu Penicillium, ale konidiofory jsou méně pravidelně větvené a fialidy jsou protáhlé v dlouhý krček
  • standardních živná média :CZ, CYA, MEA
  • Paecilomyces lilacinus
    • kolonie sametové až lanózní, světle růžovošedé, reverz nezbarven
    • půdní saprofyt, častější v teplých oblastech
    • konidiofory jemně bradavčité a nevýrazně pigmentované, terminálně větvené, s přesleny přitisklých metul a fialid
    • konidie v řetízcích, elipsoidní, jemně bradavčité
  • Paecilomyces variotii
    • kolonie rychle rostoucí, sametové, sytě okrové, často aromaticky vonící
    • termofilní, roste i při 50°C
    • izolován zejména z potravin, krmiva a vnitřního prostředí budov, producent patulinu a viriditoxinu
    • konidiofory různě dlouhé, hladké, s přesleny 2-7 fialid
    • konidie v řetízcích, elipsoidní až fusiformní, hladké, velmi variabilní ve velikosti
    • často se tvoří hnědé jednobuněčné chlamydospory
• Scopulariopsis
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Hypocreomycetidae, Microascales, Microascaceae
  • Scopulariopsis brevicaulis, teleomorfa Microascus brevicaulis
  • systémové mykózy – plícní forma
  • povrchové mykózy – dermatomykózy či onychomykózy
  • problém s léčbou – rezistentní k většině používaných antimykotik
  • kolonie béžové, schopné růst při 37°C
  • kosmopolitní houba, velmi často izolována z půdy, dřeva, rostlinných zbytků a také potravin
  • Scopulariopsis brevicaulis
    • konidiofory nepravidelně větvené, konidiogenní buňky (anelidy) – enteroblastická annelidická konidiogeneze
    • konidie kulovité až vejčité, s uťatou bazí, mladé hladké, později bradavčité
    • ENTEROBLASTICKÁ ANNELIDICKÁ KONIDIOGENEZE
      • konidiogenní buňka - anelida, modifikace fialidy
      • kumulace límečků - okraje protržené buněčné stěny bazální buňky
• Acremonium
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Hypocreomycetidae, Hypocreales
  • izolováni z postižené kůže, nehtů, oka bo z podkožního mycetomu (A. falciforme, A. potronii, A. strictum)
  • kolonie v bílých, žlutých nebo růžových odstínech
  • tvorba synnemat, fialidy většinou jednotlivé, k vrcholu se zužující (jehlicovité), septum na bázi
  • konidie jednobuněčné, hladké, hyalinní, kulovité, v řetízcích nebo shlucích
  • Acremonium potronii
• Pseudallescheria
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Hypocreomycetidae, Microascales, Microascaceae
  • teleomorfa Pseudallescheria boydii (anamorfa Scedosporium)
  • v přírodě – zemědělská půda, odpadní vody, stoky
  • povrchové mykózy – infekce ran a popálenin, keratitidy, abscesy rohovky, otomykózy
  • mykózy jednotlivých orgánů - pneumonie, endokarditidy, meningitidy, artritidy aj.
  • původce eumykotického mycetomu – granulomatózní infekce kůže a podkoží v tropech
  • vstupní branou je poranění nebo dýchací cesty
  • Pseudallescheria boydii
    • kolonie rychle rostoucí, zpočátku bílé až tmavě šedé, reverz je světlý s hnědočernými zónami
    • teleomorfa - zanořená kleistothecia, světle hnědá až černá, vřecka kulatá nebo téměř kulatá, 8 jednobuněčných askospor citrónového tvaru (zřídka u klinických kmenů – nutná kultivace 2 – 3 týdny)
    • anamorfa Scedosporium:1b. konidie, hladké ve shlucích, světle hnědé
    • Diagnostika
      • klinický materiál: sputum, bronchiální laváž od pacientů s plicním onemocněním a tkáňové biopsie u pacientů se subkutánním a diseminovaným onemocněním
      • mikroskopie: sputum, bronchiální laváž, aspiráty – louhový preparát (MycoInk, Calcofluor)
      • tkáňové řezy se barví pomocí HE, PAS, a stříbření dle Grocotta
      • kultivační průkaz – morfologie zejména konidiového stádia
• Emmonsia
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Onygenales, Ajellomycetaceae
  • Emmonsia crescens – celosvětově rozšířená
  • chronické plícní onemocnění zvané adiaspiromykóza
  • inhalace konidií obsažených v prachu
  • konidie v plicních alveolech zvětšují svůj objem – adiaspory (100 μm velké kulovité útvary se silnou stěnou)
  • adiaspory neklíčí, houba se nemnoží a infekce tak zůstává lokalizovaná v plicích
• Hyalohyfomykózy – diagnostika
  • klinický materiál: stěry kůže a nehtů, sputum a bronchiální laváž> louhový preparát (MycoInk, Calcofluor); moč, mozkomíšní mok, pleurální tekutina a krev>centrifugace a poté louhový preparát sedimentu (MycoInk, Calcofluor); biopsie
  • tkáňové řezy se barví pomocí PAS, stříbření dle Grocotta, HE
  • kultivační průkaz, Sabouraudův glukózový agar
  • hemokultura – invazivní fusarióza
• Dimorfní mikromycety
  • postihují jinak zdravé jedince v určitých oblastech, v kterých jsou příznivé klimatické podmínky a složení půdy pro jejich rozvoj
  • histoplazmóza
  • blastomykóza
  • kokcidiomykóza
  • parakokcidiomykóza
  • původci dimorfní mikromycety, biohazard 3
  • schopnost růstu ve dvou formách - obě formy mohou být příčinou infekce
  • forma vláknitá (do 30 °C) – inhalační cestou, přes sliznice či kůži
  • forma kvasinkovitá ( 35 – 37 °C) – může vyvolat systémové infekce tkání a orgánů
  • růst není blokován cykloheximidem
  • Histoplazmóza
    • původcem Histoplasma capsulatum
    • rezervoárem je půda znečištěná trusem ptáků a netopýrů
    • k nákaze dochází vdechováním konidií
    • původně endemickou oblastí je Severní Amerika, nyní i ve Střední Americe, Evropě
    • 1. asymptomatická primární histoplazmóza - zhojí se v regionálních lymfatických uzlinách
    • 2. akutní symptomatická pulmonární histoplazmóza - infekce je provázena horečnatým stavem různé závažnosti, od příznaků připomínajících chřipkové onemocnění až po život ohrožující rozsáhlou oboustrannou pneumonii
    • 3. chronická plicní histoplazmóza se vyskytuje hlavně u pacientů s emfyzémem (rozedma plic), projevy a průběh jsou podobné tuberkulóze
    • 4. diseminovaná (mimoplicní) histoplazmóza je s výjimkou imunokompromitovaných jedinců vzácná
    • Histoplazmóza – diagnostika
      • sérologický průkaz protilátek proti Histoplasma capsulatum (komplementfixační reakce, latexová aglutinace s histoplasminem, imunodifuze)
      • kultivace Sabouraudův glukózový agar, 4 týdny u hemokultur
      • histologicky z bioptického materiálu
      • komplementfixační reakce (KFR)
        • smísí se naředěné pacientovo sérum s příslušným antigenem a se známým množstvím komplementu (vícesložkový rozpustný systém krevní plazmy)
        • pokud je v séru přítomna hledaná protilátka, váže se na antigen a dojde k aktivaci a spotřebování přítomného komplementu
        • přidání beraních erytrocytů a protilátky proti povrchu těchto erytrocytů ("amboceptor")
        • přítomnost hledané protilátky – účinný komplement již nezbývá a erytrocyty nepoškozeny sedimentují
        • nepřítomnost protilátek v séru pacienta - komplement se nespotřeboval, aktivuje se až nyní a způsobí lýzu erytrocytů
    • Histoplasma capsulatum
      • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Onygenales, Ajellomycetaceae, Histoplasma
      • tři variety:
        • H. capsulatum var. capsulatum rozšířená v tropech a subtropech
        • H. capsulatum var. farciminosum původce epizootické lymfadenitidy u koní a mul
        • H. duboisii vyskytující se v Africe
      • na SGA, 24 °C – bílé, později hnědé kolonie; reverz krémový, časem hnědne
      • na BHI, 37 °C – kvasinkovitá fáze s pučícími blastokonidiemi
      • mikrokonidie – hladké, hruškovité, jednobuněčné
      • makrokonidie – hnědé, jednobuněčné, kulovité, silnostěnné, tuberkulátní
  • Blastomykóza
    • původce Blastomyces dermatitidis
    • rezervoárem je půda s vysokým obsahem organických látek (izolace z tlejícího dřeva a holubího trusu)
    • riziková je oblast v lesnaté krajině v blízkosti řek a jezer
    • k nákaze dochází vdechováním konidií
      • 1. asymptomatická blastomykóza
      • 2. akutní plicní blastomykóza - kašel, zimnice, teplota a bolest na pohrudnici, někdy blastomykóza přechází do chronického stadia
      • 3. diseminovaná blastomykóza - postihuje nejčastěji kůži (verukózní útvary a podkožní mikroabscesy), méně časté je postižení kloubů, kostí, prostaty, nadvarlete, laryngu
    • Mortalita neléčené diseminované blastomykózy je 75 %.
    • Blastomykóza – diagnostika
      • mikroskopické vyšetření sputa nebo materiálů odebraných bronchoskopicky kultivace
      • histologické vyšetření biopsie
      • imunologické metody nemají diagnostický význam
    • Blastomyces dermatitidis
      • Fungi, Ascomycota, Blastomyces
      • na SGA, 24 °C – bílé kolonie, reverz krémový až hnědý
      • konidie na krátkých konidioforech, hladké tenkostěnné, kulovité, 1buněčné
      • blastokonidie
  • Kokcidiomykóza
    • původcem Coccidioides immitis, C. posadasii
    • k nákaze dochází vdechováním konidií
    • endemickou oblastí je severní Mexiko a jihozápad USA (suché pouštní podmínky)
    • 60 % primárních infekcí asymptomatických
    • projevy onemocnění odpovídají atypické pneumonii
    • 90 % případů onemocnění se zhojí bez léčby
    • chronické onemocnění připomíná histoplazmózu nebo tuberkulózu
    • mimoplicní kokcidiomykóza (zřídka) postihuje kůži, kosti a meningy
    • Kokcidiomykóza – diagnostika
      • charakteristická eozinofilie v krvi a bioptických vzorcích
      • průkaz sférul
      • kultivační průkaz
      • precipitující protilátky jsou přítomny v 90 % případů
      • eozinofilie - vzestup počtu eozinofilních granulocytů nad fyziologickou hodnotu u zdravého dospělého člověka tvoří eozinofily 1–3 % z celkového počtu bílých krvinek
    • Coccidioides immitis
      • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Onygenales, Onygenaceae, Coccidioides
      • na SGB, 24 °C – bílé-šedé, plstnaté, reverz krémový, pak hnědý
      • na BHI, 37 °C – kvasinkovitá forma chybí
      • enteroarthrická konidiogeneze
      • in vivo – tvorba sférul s endokonidiemi, které jsou šířeny krví
      • fertilní hyfy, arthrokonidie krátké soudkovité střídající se s prázdnými buňkami
  • Parakokcidiomykóza
    • jihoamerická blastomykóza
    • původcem Paracoccidioides brasiliensis
    • oblasti s vlhkým klimatem (Jižní Amerika, zejména Brazílie), rezervoárem je půda
    • akutní postižení plic s následnou diseminací do dalších orgánů (systémové onemocnění)
    • většinou postiženi muži nad 30 let
    • inhalace konidií, poraněním
    • Paracoccidioides brasiliensis
      • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Onygenales, Ajellomycetaceae, Paracoccidioides
      • SGA, 24 °C – pomalý růst, ploché, plstnaté, bílé až hnědé, reverz hnědý
      • na BHI, 37 °C – kolonie máslovité
      • ve 24 °C konidie chybí nebo jako interkalární chlamydospory
      • ve 37 °C kulovité kvasinkovité buňky pučící synchronně po celém povrchu
  • Sporotrichóza
    • Sporothrix schenckii – původce sporotrichózy
    • dimorfní mikromyceta
    • kosmopolitní druh, žijící v půdě, rostlinách, rozkládající se vegetaci
    • kožní infekce – místem vstupu kožní trauma (rány, škrábance)
    • plícní infekce (pneumonie) – vdechování konidií (vzácněji)
    • výskyt nákazy spojen s manipulací s kontaminovanou vegetací (trnité rostliny, balíky sena….)
    • infekce je častější u lidí s oslabeným imunitním systémem
    • prvním příznakem je malý uzlík připomínající bodnutí hmyzem v místě vstupu houby
    • později může vypadat jako otevřená rána nebo vřed, který se velmi pomalu hojí
    • infekce se může šířit do dalších částí těla, včetně kostí a kloubů u imunokompromitovaných lidí
    • diagnostika – kultivace
    • Sporothrix schenckii
      • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Sordariomycetidae, Ophiostomatales, Ophiostomataceae, Sporothrix
      • na SGA, 24 °C – zvrásněné, hladké až plstnaté, bílé krémové až černé, reverz šedý až hnědočerný
      • na BHI, 37 °C – kvasinkovitá forma
      • konidiofory vyrůstají jednotlivě ze septovaného mycelia
      • konidie se tvoří ve shlucích na krátkých výběžcích
      • holoblastická konidiogeneze

Melanizované mikroskopické houby (Dematiaceae)

• netaxonomická skupina hub tvořící tmavé kolonie v důsledku přítomnosti melaninu v BS
• saprofyté, žijící v zevním prostředí na organické hmotě
• vice než 100 druhů bylo popsáno jako původci lidských onemocnění
• patogenita je nízká a infekce jimi způsobené bývají ojedinělé
• Podle klinických příznaků a vzhledu organizmu ve tkáni se onemocnění dělí:
  • Feohyfomykozy
  • Chromoblastomykozy
  • Eumykotický mycetom
• Feohyfomykózy
  • kožní, podkožní i systémové mykózy, původci v postižené tkáni tvoří pigmentovaná (melaninem) septovaná vlákna, elementy typu pseudomycelia nebo tmavé buňky kvasinkovitého typu
  • Feohyfomykózy – diagnostika
    • kožní stěry, sputum, bronchiální laváž – louhový preparát (MycoInk, Calcofluor)
    • exudáty a tělní tekutiny musí být centrifugovány a vyšetřován je sediment - louhový preparát (MycoInk, Calcofluor)
    • tkáňové řezy se barví pomocí HE, PAS, a stříbření dle Grocotta
    • kultivační průkaz, Sabouraudův glukozovy agar
    • Alternaria, Aureobasidium, Bipolaris, Culvularia, Exophiala, Phoma aj.
• Chromoblastomykózy
  • chronické kožní a podkožní tropické mykózy
  • vstupem infekce jsou poranění, v nichž vznikají nodulární či verukozní léze
  • v postižené tkáni jsou hnědě pigmentovaná sklerotická tělíska
  • Phialophora verrucosa, Fonsecaea pedrosoi, F. monophora, Cladophialophora carrionii a Rhinocladinella aquaaspersa
  • Diagnostika
    • diagnostika – kožní stěry, biopsie
    • kožní stěry – louhový preparát (MycoInk, Calcofluor)
    • tkáně – barvení HE, PAS, stříbření dle Grocota
    • kultivační průkaz, Sabouraudův glukozový agar – identifikace původce
    • sklerotická těliska 5-12 μm
• Eumykotický mycetom
  • ohraničená, chronická infekce kůže či podkoží nohou nebo rukou
  • mezi původce patří i hyalinní mikromycety (Pseudallescheria, Acremonium, Fusarium, Aspergillus aj.)
  • melanizované mikromycety (Madurella, Exophiala, Fonsecaea, Curvularia, Phialophora atd.)
  • místem vstupu je poranění v nemž se po inokulaci rozvíjí granulomatozní zánět
  • hnis obsahuje světlá nebo tmavá granula tvořená spletí hyf, tzv. sklerocia 0,5 – 1 mm velká
  • Diagnostika
    • biopsie tkání
    • tkáně – barvení HE, PAS, stříbření dle Grocota – mikroskopický průkaz
    • průkaz přítomnosti bílých až žlutých nebo černých pigmentových zrn
    • kultivační průkaz, Sabouraudův glukozový agar
• Alternaria
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Dothideomycetes, Pleosporomycetidae, Pleosporales, Pleosporaceae
  • ubikvitní, saprofytický rod, v klinickém materiálu často jako kontaminant, příležitostně původce podkožní feohyfomykozy
  • Alternaria alternata
    • kolonie olivově šedé až černé, reverz šedý až černý
    • vícebuněčné, hnědé konidie uspořádány akropetálně v řetízcích, hladké nebo bradavičnaté
  • Konidiogeneze
    • ENTEROBLASTICKÁ TRETICKÁ KONIDIOGENEZE

• Bipolaris
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Dothideomycetes, Pleosporomycetidae, Pleosporales, Pleosporaceae
  • vliv při vzniku sinusitid u pacientů s nosními polypy nebo alergickou rýmou
  • rod tvoří cca 45 druhů většinou subtropických a tropických parazitů rostlin
  • B. australiensis, B. hawaiiensis a B. spicifera patogeni člověka
  • B. sorokiniana – onychmykóza, žena, ČR
  • liší se velikostí konidii a počtem pseudosept
  • kolonie černé, rychle rostoucí (5 dnů)
  • konidiofory hnědé, produkující konidie sympodiálně, konidie (porokonidie) eliptické, rovné nebo zakřivené, pseudoseptované, světle hnědé
• Curvularia
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Dothideomycetes, Pleosporomycetidae, Pleosporales, Pleosporaceae
  • původci oportunních infekcí rohovky a vedlejších nosních dutin, mycetomu, podkožních a systémových feohyfomykóz
  • nacházejí se na odumřelém rostlinném materiálu, fakultativní patogen rostlin v subtropických a tropických oblastech
  • C. lunata, C. pallescens
  • kolonie rychle rostoucí, černé
  • teleomorfa – Cochliobolus
  • Curvularia lunata
    • konidiofory vzpřímené, hnědé
    • sympodiálně produkované konidie (porokonidie),elipsoidní, 3–4 septa, centrální buňka, konidie tmavší než koncové buňky
• Exserohilum
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Dothideomycetes, Pleosporomycetidae, Pleosporales, Pleosporaceae
  • původci kožních, podkožních feohyfomykóz, infekcí rohovky a vedlejších nosních dutin
  • nachází se v půdě a na rostlinách, v teplých oblastech s vlhkým podnebím
  • E. rostratum
    • kolonie rychle rostoucí, tmavě šedé až černé
• Aureobasidium
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Dothideomycetes, Dothideomycetidae, Dothideales, Dothioraceae
  • tzv. černý kvasinkovitý organizmus (rychlost růstu, vzhled kolonií)
  • Aureobasidium pullulans
  • převážně saprofytický organizmus, ale vyskytuje se i jako parazit na rostlinách a může způsobit choroby zvířat
  • kolonie rychle rostoucí (1-3 dny), krémové, později kolonie černají
  • Aureobasidium pullulans
    • endokonidie, konidie hladké, jednobuněčné, hyalinní, vznikající synchronně na nediferencovaných konidiogenních buňkách, interkalární tmavě pigmentované chlamydospory, pučící buňky
• Hormonema
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Dothideomycetes, Dothideomycetidae, Dothideales, Dothioraceae
  • Hormonema dematioides – kožní feohyfomykozy, peritonitida, fungemie; konidie vznikají postupně, z jednoho stejného místa, neasimiluje MDG
  • kolonie rychle rostoucí (3-5 dnů), krémové, později kolonie černají
  • Aureobasidium pullulans – konidie vznikají simultánně, každá z jineho místa asimiluje MDG (metyl-α-D-glukosid)
• Pleurostomophora
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Calosphaeriales, Pleurostomataceae, Pleurostomophora
  • Pleurostomophora richardsiae (syn. Phialophora richardsiae)
  • původce podkožní feohyfomykozy
  • kolonie olivově hnědé až hnědošedé, reverz černý
  • přehrádkované hyfy nejdříve hyalinní, později hnědé
  • lahvicovité fialidy se zřetelným septem na bázi a charakteristickým talířovitě rozevřeným límečkem
• Phaeoacremonium
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Sordariomycetidae, Diaporthales, Togniniaceae, Phaeoacremonium
  • Phaeoacremonium parasiticum
  • původce podkožní feohyfomykozy
  • kolonie kremové, později olivově hnědé, reverz světle hnědý
  • Phaeoacremonium parasiticum
    • přehrádkované hyfy nejdříve hyalinní, později hnědé
    • cylindrické fialidy se zřetelným septem na bázi, k vrcholu se zužující, límeček malý, tubulární
    • konidie, podlouhle, některe zakřivene, hyalinni
• Chaetomium
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Sordariomycetidae, Sordariales, Chaetomiaceae
  • původce podkožní a systémové feohyfomykozy, infekce nehtů a kůže
  • výskyt na potravinách a krmivech rostlinného původu, na výrobcích s celulozou a v půdě
  • plodnice – perithecia s trichomy
• Phoma
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Dothideomycetes, Pleosporomycetidae, Pleosporales
  • příležitostný původce feohyfomykozy
  • pyknidy
• Cladophialophora
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Chaetothyriomycetidae, Chaetothyriales, Herpotrichiellaceae
  • Cladophialophora bantiana – původce feohyfomykózy v podobě solitárních abscesů situovaných v CNS (biohazard 3)
  • Cladophialophora carrionii – původce mycetomu a chromoblastomykózy v zemích Jižní Afriky, Austrálii, Jižní Ameriky
  • původně klasifikovaný v rodech Cladosporium a Xylohypha
  • od rodu Cladosporium se liší málo diferencovanými konidiofory a nepigmentovanými jizvami po oddělení konidií
  • Cladophialophora bantiana
    • synonyma: Xylohypha bantiana; Cladosporium bantianum; C. trichoides
    • v přírodě izolován z půdy
    • kolonie sametové, olivově zelené, reverz olivově černý
    • roste ve 40°C
    • olivové konidie v dlouhých, málo větvených řetízcích, příležitostně přítomny velké chlamydospory
  • Cladophialophora carrionii
    • synonymum Cladosporium carrionii
    • v přírodě izolován z půdy
    • kolonie práškovité, olivově zelené, reverz olivově černý
    • neroste při teplotách nad 35-36 ° C
    • olivově zelené, apikálně větvené konidiofory nesoucí řetízky konidií
• Phialophora
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Chaetothyriomycetidae, Chaetothyriales, Herpotrichiellaceae
  • Phialophora verrucosa – chromoblastomykoza, feohyfomykoza, vzácně mycetom
  • kolonie pomalu rostoucí, olivové až černé
  • fialidy ampuliformní s výrazným nálevkovitým, tmavě pigmentovaným límečkem
  • konidie eliptické, hladké, hyalinní, ve shlucích
  • v přírodě se nachází na rostlinných zbytcích, v půdě, exkrementech
• Fonsecaea
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Chaetothyriomycetidae, Chaetothyriales, Herpotrichiellaceae
  • Fonsecaea pedrosoi a Fonsecaea monophora
  • chromoblastomykózy
  • oba druhy jsou morfologicky velmi podobné a nejlépe rozlišitelné pomocí genetických metod
  • rostou ve 37°C , ale nerostou při 40°C
  • kolonie pomalu rostoucí, olivové až černé, reverz černý
  • sporulace vyšší na PDA nebo kukuřičný agar
  • oba druhy jsou půdní saprofyté
  • výskyt převážně v tropických oblastech, zejména Jižní a Střední Amerika
  • Fonsecaea pedrosoi
    • melanizované konidiofory se shluky krátkých tupých výběžků
    • konidie světle olivoví, v krátkých řetízcích
    • ampuliformní, tmavě pigmentované fialidy s výrazným nálevkovitým límečkem
• Madurella
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Sordariomycetidae, Sordariales
  • M. grisea, M. mycetomatis – mycetom (Jižní Amerika, Indie a Východní Afrika)
  • kolonie pomalu rostoucí, melanizované, většinou sterilní mycelium
  • M. grisea – neroste ve 37°C, asimilace sacharozy
  • M. mycetomatis – roste ve 37°C, asimilace laktozy; na kukuřičném agaru mohou byt přítomny fialidy s drobnými konidiemi
• Exophiala
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Chaetothyriomycetidae, Chaetothyriales, Herpotrichiellaceae
  • v prostředí na tlejícím dřevě, v půdě
  • Exophiala jeanselmei (mycetom, feohyfomykozy), E. moniliae a E. spinifera (chromoblastomykozy, feohyfomykozy)
  • černý kvasinkovitý organizmus charakteristický annelidickou konidiogenezí
  • kolonie mají ve středu kvasinkovitý vzhled, později sametové, olivové až černé
  • v mladé kultuře – řetízky kulovitých, pučících, kvasinkovitých buněk
  • ve starší kultuře – přehrádkované hyfy nesoucí konidiogenní buňky (anelidy – s velice krátkou anelidickou zónou)
  • konidie eliptické, obvykle jednobuněčné, ve shlucích
  • torulozní hyfy
  • v infikované tkáni se nacházejí tmavě pigmentované hyfy a kvasinkovité buňky
• Pneumocystóza
  • Fungi, Ascomycota, Taphrinomycotina, Pneumocystidomycetes, Pneumocystidomycetidae, Pneumocystidales, Pneumocystidaceae
  • dlouho považován za prvoka
  • poprvé pozorován v plicích morčat infikovaných Trypanosoma cruzi, byl považován za vývojové stadium trypanosomy
  • cysty obsahují tělíska podobná askosporám
  • v roce 1999 byly lidské kmeny Pneumocystis carinii (název stale platí pro kmeny zvířecího původu) přejmenovaný na P. jirovecii
  • způsobuje pneumocystovou pneumonii dříve považovanou za nemoc nedonošených dětí
  • ve zdravé populaci se onemocnění nevyskytuje, setkáváme se s ním u imunokompromitovaných
  • doposud popsáno 5 druhů : P. cariniia a P. wakefialdiae u potkanů, P. jirovecii u člověka, P. murina u laboratorních hlodavců a P. oryctolagi u králíků
  • Pneumocystová pneumonie
    • zdrojem nákazy je nemocny člověk nebo myši
    • přenos kapénkovou infekcí
    • inkubační doba 2 měsíce
    • primární infekce je asymptomatická (s výjimkou novorozenců)
    • nastává latentní distribuce pneumocyst do plicních alveolů; v podmínkách těžkého imunodeficitu s poklesem CD4 lymfocytů se objeví klinické projevy infekce
    • dušnost, vysoka dechová f, neklid, cyanosa, plicní emfyzém, konec infekce může byt i fatální
    • extrapulmonalní manifestace je vzácná
    • Pneumocystis jirovecii
      • trofozoiti – amébovitý tvar s výběžky na povrchu, výběžky se zanořují do pneumocytů v alveolech, množí se příčným dělením, až zaplní celou dutinu alveolu
      • precysty – ještě není tenká vrstva trofozoita přetvořena na tlustou stěnu cysty
      • cysty – elipsoidní až kulovité (zralé obsahují 8 intracystických tělisek)
  • Diagnostika
    • přímý mikroskopický průkaz z indukovaného sputa či bronchoalveolární laváže po barvení speciálními postupy v kombinaci s metodami PCR
    • jednokroková PCR s primery detekujícími fragment mtLSU rRNA
    • cysty – barvení dle Gram-Weigerta, toluidinovou modří, stříbření dle Grocotta
    • trofická stadia - barvení dle Giemsa-Romanowski
    • nepřímá imunofluorescence s využitím monoklonálních protilátek (MONOFLUO KIT P. jirovecii IFA Test Kit, BioRad, Francie)
    • kultivace se nedaří
    • Odběr vzorků
      • Sputum: do sterilních umělohmotných zkumavek (sputovek) 2-5 ml ranního sputa
      • Indukované sputum: odebírá se u pacientů, kteří nedokáží spontánně vykašlávat. Pacient inhaluje inhalátorem 15% roztok NaCl ve sterilní destilované vodě cca 2-3 min. Po 15- 30 min od inhalace je vyzván k vykašlání sputa.
      • Bronchoalveolární laváž (BAL): metoda umožňující získat buněčné i nebuněčné složky z dolních dýchacích cest a alveolů. Vyšetření se provádí flexibilním bronchoskopem, výplachovou tekutinou je 100 – 300 ml fyziologického roztoku, který je ohřátý na 37 °C.

Microsporidiomycota (Microsporidia)

• zástupci jsou obligátní vnitrobuněční parazité, většinou vegetující v cytoplazmě hostitelů
• kosmopolitní
• známe cca 1200 druhů
• z humánního klinického materiálu poprvé popsán v r. 1959
• 14 druhů z 8 rodů klinicky významných (Encefalitozoom, Enterocytozoon, Nosema)
• Enterocytozoon bieneusi, E. cuniculia a E. hellem
• původci průjmů, zánětů rohovky, zánětlivá ložiska vnitřních orgánů
• zdroj nákazy: kontaminované potraviny, voda nebo vdechnutí spor či uchycení na rohovku
• spory mají na povrchu silnou stěnu, na jednom pólu ztenčenou a opatřenou polysacharidovou čepičkou
• zvláštností oproti běžným eukaryotům: 70S ribozomy (znak shodný s prokaryoty), dikaryotická jádra, chybí mitochondrie a centrioly, redukovaný Golgiho aparát
• spory obsahují specifické organely neznámé u jiných organizmů (pólové vlákno, polaroplast a útvar podobný vakuole)

• po vstupu do hostitele se polysach. čepička rozpadne a do spory se dostane voda – stoupne turgor
• pólové vlákno je vystřeleno z buňky ven a injiktuje obsah spory do hostitelské buňky
• Životní cyklus v buňce hostitele
  • začíná vstupem obsahu spory mikrosporidie (sporoplazma) do hostitelské buňky
  • meront: nezralé parazitické plasmodium - merogonie (schizogonie) – zmnožení jader a růst v b.
  • rozpad plazmodia a splývání jader
  • sporont, vznik spor ve sporoforním měchýřku
• Diagnostika
  • vzorky pro diagnostiku: stolice, moč, duodenální aspirát, seškrab z rohovky, biopsie tkání
  • transmisní elektronová mikroskopie - identifikace do rodu a druhu je založena na strukturních rysech spory, proliferujících formách, metodách dělení. V tkáni jsou často pozorovatelná všechna stadia životního cyklu, zatímco ve vzorcích stolice můžeme vidět pouze spory
  • fluorescenční mikroskopie - použití optických běličů (Calcofluor), které se váží na chitin ve sporovém obalu mikrosporidií
  • pro detekci a druhové určení mikrosporidií ve vzorcích se používají metody PCR amplifikující ITS, LSU a SSU rRNA - nejčastěji používaný cil PCR, neboť na rozdílech v jeho sekvenci je založeno rozlišení jednotlivých genotypů v rámci druhu Enterocytozoon bieneusia a rodu Encephalitozoon
• Systematické uspořádání: nejčastěji dvě skupiny (třidy):
  • Dihaplophaseomycetes (Dihaplophasea): zahrnuje rody s dikaryofází, haplofáze velmi krátká, nejznámější rody Nosema, Caudospora.
  • Haplophaseomycetes (Haplophasea):netvoří dikaryotickou fázi, diploidní jádro se ihned meioticky dělí, nejznámějši rody Enterocytozoon, Glugea.
  • parazité především hmyzu, ryb a obratlovců včetně člověka
  • Nosema apis (včelí úplavice)
  • Enterocytozoon a Encephalitozoon – parazité obratlovců včetně člověka
  • Glugea – parazit ryb, plazů a obojživelníků

DERMATOFYTOSY

Dermatofyta

• cca 50-60 druhů, z toho 35 druhů z lidského klinického materiálu
• V ČR druhová diverzita tvoří 15 druhů
• keratinofilní houby- schopné metabolizovat částečky keratinu
• celosvětově rozšířeny
• nejčastější původce infekcí kůže, vlasů, chlupů a nehtů- dermatofytózy
• pro vznik kožní infekce mají význam: vlastnosti houby, věk, pohlaví a celkový zdravotní stav osoby a místní kožní podmínky (vlhkost kůže či poranění), snížená odolnost organismu proti mykotické infekci
• Trichophyton, Microsporum a Epidermophyton náležející do oddělení Ascomycota, Arthrodermataceae
• diagnostikují se mikroskopicky a kultivačně
• léčba je dlouhodobá, většinou lokální, u onychomykóz systémová
• Podle svého dlouhodobého přežívání se dělí na 3 hlavní skupiny:
  • Geofilní- na keratinizovaných substrátech prostředí -saprotrofické půdní druhy (Microsporum gypseum, Trichophyton ajelloi, T. terrestre), zřídka patogenní pro živočichy a člověka.
  • Zoofilní- specializují se na domácí i divoká zvířata (Microsporum canis, Trichophyton verrucosum, T. mentagrophytes). K nákaze dochází při hraní s mazlíčky nebo jde o profesionální infekce.
  • Antropofilní– „obligátně“ parazitické druhy člověka (Trichophyton rubrum, Epidermophyton floccosum, Trichophyton interdigitale). K přenosu dochází při úzkém kontaktu mezi osobami nebo nepřímo (společným užíváním bot, ručníku, ve sprchách či saunách).
• Morfologie
  • Vláknité mikroskopické houby
  • septované větvící se hyfy
  • mikrokonidie
  • makrokonidie
  • chlamydospory
  • hyfová vlákna charakteristického
  • tvaru (parohovitá, spirálovitá)
• konidiogeneze
  • THALICKÁ – HOLOTHALICKÁ KONIDOGENEZE
    • hyfa se rozdělí přepážkami a pak se rozpadne na jednotlivé buňky, poté se formuje jejich tvar či obsah
    • rhexolytické uvolňování konidie – vytváří se mezibuňka
    • thalokonidie
• Patogenita
• místo vstupu – poškozená kůže
• velmi pomalu pronikají do okolní tkáně (infekce má plíživý nástup i průběh)
• vznik kožních lézí začíná vniknutím mikromycet do stratum coroneum a keratinizovaných vrstev kůže
• tomu předchází: adheze konidií trvající 12 hod. => klíčení konidií po 24 – 30hod. => proliferace hyf a postupný průnik vláken po dalších 2-3 dnech
• faktorem virulence dermatofyt je schopnost metabolizovat svými enzymy keratin
• k průniku do hlubších tkání nedochází
• imunitní reakce organizmu bývá výraznější u infekcí způsobených zoofilními druhy
• Onemocnění vyvolané dermatofyty se obecně nazývá tinea a druhou část názvu tvoří lokalizace infekce
  • tinea pedis – postižení plosky nohou a meziprstní prostory
  • tinea unguium (onychomykózy) – postižení nehtové ploténky nohou a rukou
  • tinea corporis – postižení trupu, horních a dolních končetin
  • tinea cruris – postižení oblasti třísel, zevních pohlavních orgánů a hýždí
  • tinea capitis – postižení vlasové části hlavy, obočí a řas
  • tinea faciei – postižení bezvousé obličejové části
  • tinea barbae – postižení vousaté části obličeje
  • tinea manuum – postižení rukou
  • tinea incognito – nepoznaná mykotická infekce
  • tinea pedis
    • postižení plosky nohou - nemoc zvaná atletická noha
    • nejčastější forma dermatofytické infekce
    • postihuje meziprstní prostory nohou a plosky především mužů středního věku, zpravidla v souvislosti se sportovními aktivitami
    • vznikají loupající se macerovaná ložiska se zarudlým okrajem, později bolestivé trhliny v kůži
    • predisponující faktory: vlhké i teplé mikroklima v obuvi, poruchy prokrvení, diabetes mellitus, chronická žilní nedostatečnost, kouření, poruchy obranyschopnosti, podvýživa
    • Trichophyton rubrum, Trichophyton interdigitale, stále řidčeji Epidermophyton floccosum
    • konidie hub zůstávají virulentní několik měsíců především na podlahách společných sprch, tělocvičen, umýváren, kolem bazénů
  • tinea unguium
    • postižení nehtového aparátu (onychomykózy)
    • dermatofyt se z bříšek prstů rozšíří i na epidermis nehtového lůžka a postupuje dále pod nehtovou ploténku
    • nehet je ztluštělý, deformovaný a odlišně zbarvený
    • predisponujícími faktory: jsou traumatické postižení nehtu, vyšší věk, tinea pedis, nedostatečná nehtová hygiena, snížení periferní vaskulární cirkulace, sportovní aktivity, uzavřená obuv, diabetes mellitus
    • Trichophyton rubrum (až v 85 %), Trichophyton interdigitale, Epidermophyton floccosum
  • tinea corporis
    • postihuje neochlupenou kůži trupu, paží až k zápěstí a dolních končetin, kromě třísel, chodidel a rukou
    • typicky se projevuje jako okrouhlá olupující se ložiska, na okraji zarudlá
    • infekci vyvolávají všechny druhy dermatofytů
    • původcem jsou nejčastěji zoofilní druhy (Trichophyton interdigitale, Trichophyton verrucosum, Microsporum canis)
    • Microsporum canis (kočky, psi, králíci a morčata), nejčastěji jsou postiženy děti
    • Trichophyton interdigitale (hlodavci, pes, kočka)
    • Trichophyton rubrum (antropofilní druh) může způsobovat infekce u imunodeficitních a zanedbaných osob středního věku
  • tinea cruris
    • postižení třísel zejména mladších mužů
    • infekce velmi často vzniká autoinokulací ze současné mykózy nohou a nehtů
    • predisponujícími faktory: nedostatečná hygiena, vlhkost, obezita, zapaření v těsném oděvu
    • Trichophyton rubrum, Trichophyton interdigitale, Epidermophyton floccosum
  • tinea capitis
    • postižení vlasové části hlavy, obočí a řas
    • ložiska s olámanými vlasy, kůže se loupe, případně se tvoří krusty
    • v našich podmínkách nejčastěji vyvolané zoofilními dermatofyty
    • postiženy bývají především děti předškolního věku
    • infekce ze zvířete na člověka; zdrojem infekce jsou kočky, psi, koně
    • nejčastějším původcem infekce ve světě (s výjimkou USA) je Microsporum canis, zdrojem nákazy jsou kočky
    • v USA je hlavním původcem Trichophyton tonsurans
    • v Africe Trichophyton violaceum
    • k přenosu z člověka na člověka prakticky nedochází
    • rod Microsporum postihuje vlas podle typu ektotrix (vlákna a konidie na povrchu vlasu)
    • rod Trichophyton vyvolává typ ektotrix i endotrix (vlákna a konidie uvnitř vlasu)
  • tinea faciei
    • povrchní mykóza lokalizovaná v obličeji
    • postihuje často děti
    • začíná asymptomaticky, případně mírně svědí, zůstává často nepoznána
    • Trichophyton interdigitale, Microsporum canis, občas i Trichophyton rubrum
  • tinea barbae
    • postižení vousaté části obličeje
    • vyskytuje se u dospělých mužů
    • postižení diskrétní povrchovou formou nebo silně zánětlivou hlubokou formou
    • nejčastějším původcem bývá zoofilní Trichophyton interdigitale (hlodavci), Trichophyton verrucosum (skot)
    • nejčastěji jsou postiženy osoby pracující se zvířaty, např. chovatelé, veterináři
    • zvířata (přenašeči infekce) bývají často zcela bez klinických příznaků
  • tinea manuum
    • postižení dlaně nebo hřbetní části ruky
    • méně častá dermatofytóza
    • infekce antropofilním dermatofytem bývá na ruku přenesena sekundárně z mykózy nohou (Trichophyton rubrum)
    • vzhledem k častému kontaktu ruky se zevním prostředím a nejrůznějšími materiály mohou být původcem infekce i zoofilní či geofilní dermatofyty
• Rod Epidermophyton
  • Epidermophyton floccosum
    • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Onygenales, Arthrodermataceae
    • antropofilní
    • napadá kůži a nehty, ne však vlasy
    • může způsobit malou epidemii v kolektivu, používajícím společné hygienické zařízení
    • pomalu rostoucí (3 - 4 týdny)
    • kolonie žlutohnědé paprsčitě rozbíhavé
    • ve starších kulturách vločky bílého pleomorfního mycelia
    • reverz žlutozelený až hnědavě oranžový
    • rod se liší od Trichophyton a Microsporum absencí mikrokonidií
    • kyjovité makrokonidie ve svazcích, hladké, 2-5 buněčné, 10-40 x 6-12 μm
    • chlamydospory a arthrokonidie běžné ve starší kultuře
• Rod Trichophyton
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Onygenales, Arthrodermataceae
  • v současné době stále více přibývá kožních infekcí zvířat vyvolaných čistě antropofilními druhy (infekce ovčích kopyt či koní vyvolaných T. rubrum)
  • a naopak objevují se drmatofytózy způsobené zoofilními druhy
  • teleomorfa Arthroderma
  • makrokonidie a mikrokonidie
  • rod se liší od Microsporum hladkými a většinou tenkostěnnými makrokonidiemi, od Epidermophyton přítomností mikrokonidií
  • Trichophyton rubrum
    • nejčastěji nacházený dermatofyt
    • antropofilní
    • středně rychle rostoucí (2 – 3 týdny)
    • kolonie chmýřité nebo granulární, bílé až narůžovělé
    • reverz vínově červený až olivový
    • u nás nejčastěji původce původce tinea pedis, tinea unguium, tinea corporis
    • makrokonidie výjimečně, tenkostěnné, málo diferencované, cylindrické
    • mikrokonidie kolíčkovité, hruškovité
    • chlamydospory jsou méně časté
  • Arthroderma benhamiae
    • zoofilní (morče)
    • původce tinea capitis, tinea corporis (u dětí do 10 let)
    • 2 fenotypy – žlutý a bílý
    • reverz žluté odstíny, červené až hnědé
    • menší procento izolátů se morfologií podobá T. interdigitale
    • makrokonidie většinou chybí
    • mikrokonidie uspořádané v hustých hroznovitých shlucích
    • chlamydospory
  • Trichophyton interdigitale
    • dříve Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale
    • antropofilní, zoofilní (hlodavci, psi kočky)
    • původce tinea pedis, tinea unguium, tinea corporis (zoofilní)
    • rychle rostoucí (7 - 12 dní)
    • kolonie bílé s žlutým okrajem; reverz oranžový
    • pozitivní ureázový test
    • Kolonie různých kmenů T. interdigitale po 14 dnech kultivace ve tmě při 25 °C na SGA
    • makrokonidie většinou chybí
    • mikrokonidie kapkovité
    • v nesporulujících kulturách nodulární shluky buněk obklopené žlutým exudátem
  • Trichophyton tonsurans
    • antropofilní druh
    • často původce tinea corporis (zápasníci)
    • zvýšený výskyt u tinea capitis (endotrix) ve městech
    • středně rychle rostoucí (2 – 3 týdny)
    • kolonie variabilní, většinou semišové, radiálně, nepravidelně zvrásnělé bílé až šedé, žlutavé; někdy narůžovělý až olivový střed
    • reverz fialový, žlutý
    • pozitivní ureázový test za 5 dní
    • makrokonidie pokud jsou přítomny, tenkostěnné, 2-6 buněčné, cylindrické až cigárovité
    • mikrokonidie různé velikosti, válcovité, kulovité i hruškovité, uspořádané řídce na myceliu nebo na zesílených terminálních hyfách
    • chlamydospory hojné, terminální a interkalární
  • Trichophyton mentagrophytes
    • zoofilní, široké spektrum zvířecích hostitelů (drobní hlodavci, velbloud)
    • Blízký a Střední východ, Afrika a Austrálie
    • v ČR se přirozeně nevyskytuje!
    • infekční řetězec většinou začíná u hlodavce
    • původce tinea corporis, tinea barbae a tinea capitis, nachází se i v nehtech
    • velmi mnohotvárný druh, což vedlo k popisu četných variet- ne všechny jsou uznávány
    • rychle rostoucí (7 - 12 dní)
    • kolonie bílé až béžové, hrubě zrnité nebo chmýřité (subkultury), okraj paprsčitě rozbíhavý
    • reverz béžový až črvenohnědý, příležitostně žlutý
    • makrokonidie, hladké, tenkostěnné, 3-8 buněčné, kyjovité, vyskytující se řídce
    • mikrokonidie kulovité, uspořádané v hustých hroznovitých shlucích nebo jednotlivě podél hyf
    • spirálové hyfy
    • chlamydospory méně časté
  • Trichophyton verrucosum
    • zoofilní, zdrojem infekce je hovězí dobytek
    • u infikovaných osob (u zemědělců z povolání) původce infekcí ochlupených částí těla
    • velmi pomalu rostoucí, růst lze urychlit přídavkem thiaminu do média, přesto inkubace může trvat až 6 týdnů
    • 80% vyžaduje pro růst thiamin + inositol
    • kolonie vyvýšené nebo knoflíkovité, voskovité, kompaktní, později plstnaté, bělavé, šedožluté
    • reverz lososový
    • sporulace chybí nebo je redukovaná
    • makrokonidie, hladké, tenkostěnné, 4-7 buněčné
    • mikrokonidie hruškovité
    • chlamydospory hojné, terminální, interkalární, v řetízcích
    • vždy přítomná terminální ztluštění – vezikuly (4 – 5 den kultivace)
  • Trichophyton violaceum
    • antropofilní druh
    • u infikovaných osob původce tinea capitis, tinea corporis, onychomykózy
    • pomalu rostoucí (3 – 4 týdny)
    • kolonie voskovité, později sametové, žluté až sytě fialové
    • kultury pleomorfní – nepigmentované bílé sektory, některé kmeny zcela nepigmentované
    • reverz tmavě žlutý, červenohnědý, fialový
    • produkují hnědý pigment difundující do agaru
    • sporulace chybí nebo redukovaná (thiamin podporuje tvorbu konidií)
    • hyfy reflexivně větvené, hustě septované, často se rozpadající v arthrokonidie
    • makrokonidie vzácné
    • mikrokonidie hruškovité
  • Trichophyton schoenleinii
    • antropofilní
    • pomalu rostoucí
    • způsobuje onemocnění kštice favus, kdy se v okolí vlasových folikulů tvoří krustózní mističkovité útvary zvané skutula, které splývají a vytvářejí krusty zapáchající po myší moči
    • kolonie voskovité, vyvýšené, krémové
    • reverz bez pigmentu nebo světle žlutá
    • makrokonidie a mikrokonidie obvykle chybí
    • charakteristická parohovitá, dichotomicky větvená vlákna s rozšířenými konci („favické svícny“)
    • chlamydospory hojné
• Rod Microsporum
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Onygenales, Arthrodermataceae
  • rychle rostoucí (Microsporum canis, M. gypseum, M. fulvum, M. persicolor)
  • pomalu rostoucí (Microsporum ferrugineum, Microsporum audouinii)
  • teleomorfa Arthroderma
  • mikrokonidie zřídka
  • rod se liší od Trichophyton a Epidermophyton drsnými a silnostěnnými makrokonidiemi
  • nejčastějším druhem u nás je Microsporum canis způsobující nejčastěji infekci kštice, kde vytvářejí ložiska s vlasy ulámanými 1-3 mm nad povrchem
  • Microsporum canis
    • zoofilní
    • rychle rostoucí
    • nejčastější původce tinea capitis
    • zdrojem infekce jsou nejčastěji koťata, méně štěňata
    • kolonie zpočátku bílé, později nažloutlé, paprsčitě rozbíhavé
    • reverz žluto-okrový
    • makrokonidie bradavčité, silnostěnné, vřetenovité, na obou koncích zašpičatělé, 6- 12 buněčné
    • mikrokonidie hladkostěnné, hruškovité, klasovitě uspořádané podél hyf
  • Microsporum gypseum
    • geofilní
    • infekce lidí (zejména intenzivně pracující s půdou) i zvířat
    • původce tinea corporis nebo tinea capitis
    • rychle rostoucí
    • kolonie okrové s nádechem skořicové, okraj rozbíhavý
    • reverz žlutohnědý, někdy s růžovým nádechem
    • makrokonidie bradavičnaté, tenkostěnné, vřetenovité, ve shlucích
    • mikrokonidie hladké, tenkostěnné
  • Microsporum persicolor
    • geofilní
    • infekce u zvířat (psi), vzácně u lidí, tinea corporis
    • rychle rostoucí
    • makrokonidie, mikrokonidie, spirálové hyfy
  • Microsporum fulvum
    • geofilní
    • vzácně u lidí a zvířat
    • rychle rostoucí
    • makrokonidie, mikrokonidie
  • Microsporum audouinii
    • antropofilní
    • původce tinea capitis
    • nalézán zejména u dětí
    • endemické oblasti v Africe, východní Asii a Evropě
    • pomalu rostoucí
    • pektinátní hyfy, terminální chlamydospory
    • makrokonidie vzácné, nepravidelně vřetenovité
    • mikrokonidie vzácné
  • Microsporum ferrugineum
    • antropofilní
    • původce tinea capitis u dětí
    • pomalu rostoucí
    • endemické oblasti v Africe, východní Asii a Evropě
    • vyvýšené, zvrásněné, krémové až žluté
    • konidie většinou chybí, dlouhé, rovné hyfy s nápadnými přepážkami "bamboo hyphae"
• Diagnostika dermatofytóz
  • pouze přímý průkaz
    • mikroskopie
    • kultivace
  • Mikroskopické vyšetření
    • Louhový preparát
      • určen ke znázornění dermatofytů, jiných vláknitých hub a kvasinek v kůži, nehtech, vlasech, vousech a chlupech
      • louh projasní keratin a umožní pozorovat hyfy či konidie
      • nelze identifikovat
      • nevypovídá o životaschopnosti
      • Postup:
        • 1. do 1-2 kapek 10-20% KOH na podložním sklíčku přidejte malé množství vyšetřovaného vzorku a důkladně promíchejte
        • 2. opatrně přiložte a přitlačte na vzorek krycí sklíčko
        • 3. preparát nechte ležet 1-2 hodiny, případně i přes noc ve vlhké komůrce. Doba preparace závisí na hustotě preparátu (louh částečně projasní proteinové složky vzorku)
        • 4. přebytečný louh odsajte a jemným tlakem na krycí sklíčko materiál roztlačte do tenčí vrstvy
    • Modifikace louhového preparátu
      • 1. Barvení houbových elementů např. barvivem MycoInk, chlorazolová čerň: barviva se váží na stěnu hub
      • 2. Calcofluor (Rylux BSU) a KOH: 1 kapka 0.1% calcofluoru a 1 kapka 10% KOH se přenesou na podložní sklíčko. Přidáme malé množství vzorku a překryjeme krycím sklíčkem. Po projasnění se preparát prohlíží fluorescenčním mikroskopem (500 nm). Barvivo se váže na chitin, který je součástí buněčné stěny vláknitých hub a kvasinek, proto jejich struktury v UV světle modrozeleně září
• Diagnostika- Kultivace
  • Sabouraudův glukózový agar
  • + thiamin (nezbytný pro T. verrucosum)
  • + antibiotika (chloramfenikol s gentamicinem)
  • +cykloheximid – potlačí rychle rostoucí saprofytické houby
  • 2 – 4 (6) týdnů při teplotě 25–30 °C
  • kultivace na 3 - 4 šikmých agarech současně
  • 1x týdně kontrola růstu
  • výrazná makromorfologie kolonií
  • pestrá pigmentace spodní strany kolonií (PDA – bramborý agar s dextrózou)
• Diagnostika- Vlasový perforační test
  • některé druhy mají schopnost perforovat vlas in vitro
  • části mycelia jsou inkubovány ve 25 ml vody obsahující 2-3 kapky kvasničního extraktu a sterilních fragmentů dětských vlasů
  • kultivace při 24 °C, 2 – 4 týdny
  • louhový preparát vlasů
  • pozitivní výsledek: perforační kanálky
• Diagnostika- Fyziologické testy
  • ureázový test – Christensenovo médium
  • Trichophyton agar T1 – T7
  • růst v rýžovém substrátu
  • Ureázový test
    • produkují řadu exolátek: proteázy, lipázy, elastázu, ureázu atd.
    • využití v diagnostice – ureázový test k odlišení Trichophyton rubrum (negativní) a T. interdigitale (pozitivní)
    • v přítomnosti ureázy se močovina rozkládá za vzniku amoniaku a současné změny pH, kterou indikujeme fenolovou červení
    • jednorázová plastová zkumavka s Christensenovým agarem
    • kultura se naočkuje vpichem a inkubuje se při pokojové teplotě 5 dní
  • Trichophyton Agar (T1 – T7)
    • zástupci rodu Trichophyton mají specifické nutriční požadavky
    • sada chemicky definovaných médiích pro diferenciaci a identifikaci izolátů rodu Trichophyton na základě potřeby určitého vitaminu a aminokyselin
    • nutriční požadavky jsou zjišťovány porovnáním růstu na základním médiu s růstem v přítomnosti specifických živin
    • Trichophyton Agar 2, 3 a 4 - požadavek na inositol, thiamin nebo obojí
    • Trichophyton Agar 5 – požadavek na kyselinu nikotinovou
    • Trichophyton Agar 6, 7 - požadavek na histidin (T6 základní médium)
    • inkubace 2 týdny při 25 - 30 °C
  • Růst na rýžovém substrátu
    • inkubace 14 dní při 30 °C
    • makrokonidie M. audouinii podobné chudě sporulujícímu M. canis

Jiné povrchové mykózy

• Hortaea werneckii
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Dothideomycetes, Dothideomycetidae, Capnodiales, Teratosphaeriaceae, Hortaea
  • tinea nigra – tropická kožní mykóza, způsobuje tmavě hnědé až černé skvrny na dlaních a chodidlech
  • hustě přehrádkované, hnědé hyfy, konidiogenní buňky interkalární či laterální (anelidy – anelidická zóna širší jak u rodu Exophiala)
  • konidie 2-buněčné, často pučící, přechází ve shluky chlamydospor
  • kolonie hladké, slizovité, olivově černé
• Piedraia hortae
  • Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Dothideomycetes, Dothideomycetidae, Piedraiaceae, Piedraia
  • černá piedra - mykotické onemocnění vlasů a kůže vyskytující se zejména v tropických oblastech
  • askostromata na vlasech, černá, velikosti 1 x 0,3 mm
  • aska s 2-8 askosporami, elipsoidní, bitunikátní
  • askospory jednobuněčné, hyalinní, vřetenovité, zahnuté, zužující se na koncích v bičíkaté prodloužení
  • kolonie pomalu rostoucí, tmavě hnědé až černé, většinou sterilní

Mykotoxiny

• sekundární metabolity mikroskopických hub, nebílkovinné povahy, toxické pro bakteriální, rostlinné, houbové nebo živočišné buňky
• > 300 mykotoxinů
• rozlišení na toxiny bílkovinné a nebílkovinné povahy
• bílkovinné toxiny mají mnoho shodných rysů s bakteriálními toxiny jejich význam z hlediska kontaminace potravin je však zanedbatelný. Při požití jsou cizorodé bílkoviny tohoto původu patrně destruovány trávicím procesem a snad již také přípravou stravy. Zatím nebyla u houbovitých organizmů popsána produkce nějaké obdoby botulotoxinů, které nejenže vydrží krátkodobý var, ale jsou i odolné vůči trávení.
• Mykotoxiny se stanoveným limitem v potravinách v ČR
  • aflatoxiny - arašídy, čili, fíky, kakao, kari, kmín, kukuřice, ořechy, paprika, pepř
  • ochratoxin A - obiloviny, rozinky, káva, víno , zelený čaj, grep. šťáva, luštěniny, maso, vnitřnosti
  • patulin - jablka a výrobky z jablek, banány, borůvky, plesnivé kompoty, jablečné mošty
  • deoxynivalenol - obiloviny a výrobky z nich
  • sterigmatocystin - obiloviny a výrobky z nich, tvrdé sýry
• Další mykotoxiny na potravinách v ČR
  • alternariové MT - rajčata, řepka
  • fumonisin B1- kukuřice a kukuřičné výrobky
  • kyselina cyklopiazonová - kukuřice, arašídy, kroupy, sýry typu camembert
  • T-2 toxin - obiloviny a výrobky z nich
  • zearalenon - obiloviny a výrobky z nich
• Mykotoxiny – rozdělení
  • Rozdělení podle účinků
    • cytotoxické mykotoxiny
    • toxiny s imunosupresívními účinky
    • teratogenní toxiny
    • karcinogenní mykotoxiny
    • mutagenní toxiny
  • Rozdělení podle toxicity – kvantitativní
    • 1. Silně toxické - aflatoxiny, patulin, luteoskyrin, sporidesminy, ochratoxin A, cyklochlorotin (= islandotoxin), zearalenon (F-2), T-2 toxin, DAS, citreoviridin, rubratoxiny, penitrem A
    • 2. Středně toxické - citrinin, kyselina penicillová, sterigmatocystin, kyselina cyklopiazonová
    • 3. Slabě toxické - griseofulvin, kyselina koji, trihothecin, kyselina mykofenolová, chaetomin nejtoxičtější mykotoxiny mají LD50 pro běžná laboratorní zvířata blízkou KCN (tj. cca 1 mg.kg-1 tělesné hmotnosti)
    • toxicita pro člověka je odhadem podle toxicity vůči různým živočichům
  • Rozdělení podle toxicity – kvalitativní
    • 1. Hepatotoxiny - aflatoxiny, sterigmatocystin
    • 2. Nefrotoxiny - ochratoxin A, citrinin
    • 3. Toxiny zažívacího traktu - T-2 toxin a další trichotheceny
    • 4. Neurotoxiny a myotoxiny - tremorgeny (např. penitrem A), citreoviridin
    • 5. Dermotoxiny - T-2 toxin
    • 6. Toxiny dýchacího traktu – patulin
    • 7. Genitotoxiny – zearalenony
    • 8. Imunotoxiny - aflatoxiny, ochratoxin A, trichotheceny
    • 9. Toxiny nezařaditelné nebo málo prozkoumané
• Mykotoxiny – historie
  • první doložené zprávy o toxicitě plesnivých potravin pocházejí z Japonska. Některé z nich navazují na lidové zkušenosti, např.: „žlutou rýži je třeba vystavit na několik hodin v tenké vrstvě prudkému slunci, aby pozbyla svoji toxicitu“ (fotolýza mykotoxinu citreoviridinu)
  • ve 30. a 40. letech byly na území tehdejšího SSSR zkoumány vzorky obilí, napadené houbami rodu Fusarium. Ty byly spojeny s onemocněním, které se nyní nazývá alimentární toxická aleukie (ATA), v té době bylo známo pod mnoha synonymy (např. "septická angína")
  • exaktní modelový pokus, prokazující původ ATA z otravy fusariovými mykotoxiny byl proveden až v 70. letech
  • obnovení zájmu o toxické látky z mikroskopických hub přišlo v roce 1960, když na farmách Nové Anglie uhynulo několik desítek tisíc krůťat. Byla prokázána produkce toxických látek z hub vyskytujících se v arašídech, které tvořily součást krmné směsi pro krůťata
  • producentem toxinů byl druh Aspergillus flavus, podle něhož byly nazvány aflatoxiny. K jejich bližší identifikaci byla použita písmena, zprvu B pro modře a G pro zeleně světélkující pod dlouhovlnným ultrafialovým zářením a číselnými indexy, značící jejich pořadí na chromatogramu při tehdy užívané tenkovrstevné chromatografii, aflatoxiny M byly nalezeny v mléce, H v játrech, P byly v době svého objevu považovány za specifické pro primáty.
  • k zahájení výzkumu mykotoxinů na lékařské fakultě v Brně došlo v souvislosti s následující kazuistikou. V jednom ze závodů tehdejší Fruty došlo k zaplísnění rajčat. Pracovníci hygienické služby, provádějící tehdy senzorické zkoušky, onemocněli s příznaky poškození jater.
  • v současné době představuje vrcholové pracoviště pro mykotoxiny v potravinách a potravinových surovinách Centrum zdraví, výživy a potravin v Brně (CZVP)
• Mykotoxiny – přehled
  • Aflatoxiny
    • aflatoxin B1 - nejsilnější dosud známý přírodní karcinogen
    • za základní považujeme aflatoxiny B1, B2, G1, a G2
    • producenti: Aspergillus flavus a A. parasiticus aj.
    • produkce závisí na teplotě, vlhkosti, přístupu vzduchu, struktuře a chemickém složení substrátu, důležité jsou i vlivy doprovodné mikroflóry (např. inhibice tvorby aflatoxinů vlivem Aspergillus sk. niger)
    • akutně toxické (blokáda syntézy bílkovin), karcinogenní (vazba na RNA), teratogenní, imunosupresivní
    • vyvolávají u člověka Reyův syndrom, zánět jater, primární hepatom a stavy útlumu imunity
    • zdrojem jsou obiloviny, olejniny, koření a ořechy
    • aflatoxikózy u lidí méně časté (Asie, Afrika)
    • A. flavus se vyskytuje především v teplých oblastech Ameriky, Afriky a Asie
    • k nám je transportován na různých hospodářských komoditách špatné kvality
  • Sterigmatocystin
    • producenti: Aspergillus versicolor, Aspergillus nidulans aj.
    • hepatotoxický, karcinogenita pravděpodobná
    • zdroj: v obiloviny a výrobky z nich, kávová zrna, salámy, sýry
  • Ochratoxin A
    • ze skupiny ochratoxinů nejtoxičtější produkován některými druhy rodů Aspergillus a Penicillium (Aspergillus ochraceus, A. verrucosum, A. sulphureum, A. mellus, Penicillium verrucosum P. viridicatum, P. palitans, P. commune, P. aurantiogriseum, P. freii, P. tricolor)
    • mechanismus jeho toxicity spočívá v inhibici proteosyntézy
    • vliv na organizmus je v útlumu imunity a postižení ledvin
    • hlavním zdrojem je obilí, dalším zdrojem jsou masné výrobky (ochratoxin A vytváří rezidua ve tkáních), káva, vepřová krev, v níž je ochratoxin vázán na albumin, sušené ovoce
  • Patulin
    • produkován řadou druhů mikroskopických hub rodů Byssochlamys, Penicillium, Aspergillus (název je odvozen od Penicillium patulum)
    • objeven ve 40. letech jako antibiotikum, účinný např. proti Bacterium tuberculosis
    • antibiotické účinky na bakterie, antifungální účinky na houby, toxicita pro rostlinné i živočišné buňky, poškozuje žaludeční sliznici
    • zdrojem je kazící se ovoce, velice často v jablkách, ovocné šťávy
    • v ovoci se vyskytují ochranné látky (např. vitamín C), které zabrání rozkladu patulinu při tepelném zpracování kompotů, dření i moštů (čistý patulin se rozkládá při 80°C)
    • je jeden z mála dobře detoxikovatelných mykotoxinů
    • v potravinách je spíše špatných výrobních postupů - používání "plesnivých" vstupních surovin
  • Trichotheceny
    • skupina látek, charakterizovaných přítomností tzv. trichothecenového jádra
    • producenti: teplomilné i chladnomilné druhy rodu Fusarium (Fusarium poae, F. graminearum, F. sporotrichoides), u nás s nimi bývají problémy jen v teplotně atypických letech
    • vyvolávají alimentární toxickou aleukii
    • zvláštní skupinu tvoří tzv. makrocyklické trichotheceny, patří mezi ně satratoxiny (Stachybotrys chartarum, Dendrodochium toxicum). Působí na kůži už ve zlomcích mikrogramu těžké dráždění.
    • Stachybotryotoxikóza
      • postihuje především domácí zvířata konzumující kontaminované seno nebo slámu
      • zřídka postiženi lidé
      • Stachybotrys chartarum
      • mykotoxiny satratoxiny a stachybotryotoxiny
      • Čtyři různé formy:
        • postižení kůže a sliznice (ústa, jícen, žaludek, plíce)
        • celková intoxikace – postižení krvetvorby a krve
        • nervová forma
        • potraty
    • T-2 toxin
      • trichotecenový mykotoxin
      • produkovám druhy rodu Fusarium
      • mykotoxin je produkován při teplotě 3 až 8°C (při 25°C se již netvoří)
      • způsobuje kožní a slizniční nekrotické léze, zejména v horní části gastrointestinálního traktu po kontaktu s mykotoxinem (pozorováno u drůbeže a prasat)
      • možné zneužití k vojenským účelům - zpuchýřující účinek podobný yperitu, navíc vyvolává těžké postižení imunity a krvetvorby
    • Deoxynivalenol (DON)
      • trichotecenový mykotoxin
      • produkovám druhy rodu Fusarium
      • společně s T-2 toxinem nejvíce frekventovaným mykotoxinem v krmivech
      • zdrojem obiloviny
      • obecné symptomy jsou nauzea, iritace pokožky a poruchy krvetvorby
      • u přežvýkavců dochází ke snížené užitkovosti a příjmu krmiva
      • v enterocytech, kde inhibuje syntézu proteinů a vyvolává apoptózy
  • Zearalenon
    • někt. druhy rodu Fusarium, může se jednat i o stejné druhy, které produkují trichotheceny
    • ač nemá steroidní strukturu, má účinky steroidních hormonů estrogenů
    • u lidí i hospodářských zvířat může způsobovat hyperestrogenismus
    • zdrojem jsou obiloviny
    • nebezpečí u konzumace naklíčeného obilí a dalších semen, kdy během klíčení mohou fuzária vyrůst a vyprodukovat mykotoxiny
  • Citrinin
    • produkován některými druhy rodu Penicillium (P. citrinum, P. expansum, P. verrucosum) a rodu Aspergillus (A. tereus, A. candidus)
    • původně používán jako antibiotikum, ale pro značnou toxicitu (nefrotoxický) vyřazen
    • může se vyskytovat společně s ochratoxinem
    • v našich podmínkách je kontaminantou obilí, v plesnivém chlebu a špatně skladované šunce
    • je dobře stanovitelný vzhledem k intenzivní žluté fluorescenci pod ultrafialovým světlem
  • Fumonisiny
    • skupina látek odvozených od nenasycených mastných kyselin : fumonisin A1, A2, B1 - B4; nejčastěji je nalézán fumonisin B1
    • produkovány některými druhy rodu Fusarium a patrně i dalšími mikroskopickými houbami
    • vyvolávají několik typů onemocnění hospodářských zvířat, přičemž nejznámější je leukoencephalomalacie koní a zhoubné nádory u laboratorních potkanů
    • u člověka existují souvislosti s výskytem karcinomu jícnu (potenciální karcinogen)
    • hlavním zdrojem je kukuřice včetně výrobků z ní (např. Clever Popcorn slaný)
  • Kyselina cyklopiazonová
    • produkována druhy rodů Penicillium a Aspergillus flavus
    • barevně reaguje s Ehrlichovým činidlem, což lze použít i v druhové identifikaci
    • při perorálním kontaktu dochází především k postižení trávicí trubice a jater
    • v menším množství se mykotoxin pravidelně vyskytuje v plísňových sýrech pod pokryvem Penicillium camemberti, vyskytuje se i v tavených sýrech (sem se dostává s plesnivými odkrojky), plísňových salámech apod.
    • dalším možným zdrojem je drůbeží maso (příjem krmivem)
• Mykotoxiny – onemocnění
  • mykotoxikózy - onemocnění člověka a hospodářských zvířat, vyvolaná mykotoxiny
  • 1. Onemocnění člověka vyvolaná pouze mykotoxiny
    • Ergotismus
      • historicky první mykotoxikózou popsanou u člověka. Vyskytoval se po konzumaci mouky infikované paličkovicí nachovou Claviceps purpurea
      • do roku 1879 bylo v Evropě známo 306 epidemií ergotismu. Onemocnění bylo v minulosti často označováno jako oheň sv. Antonína (vaskulární forma). Poslední popsaný případ ergotismu byl ve Francii v roce 1950.
      • onemocnění způsobují alkaloidy, nacházející se ve sklerociích houby (námel), tyto látky využívá farmaceutický průmysl
      • dvě formy:
        • vaskulární forma (ergotamin)

dominují spasmy drobných cév, vyvolávající při opakovaném působení toxinů gangrenizaci tkáně a odpadnutí akrálních částí těla (ušní boltce, nos, rty, prsty)

• • • • • psychotropní forma (ergin a hydroxyethylamidkyseliny lysergové)

výskyt halucinací, křeče, zvracení, svědění, bolesti hlavy, průjem, nekontrolované pohyby rukou

• • • Akutní kardiální beri-beri
      • projevuje se křečemi a vzestupnou paralýzou stejně jako klasická beri-beri, dušností a může skončit úmrtím na zástavu srdce
      • vyvolávajícími toxiny jsou citreoviridin, citrinin, luteoskyrin aj.
      • producenti: Penicillium citreonigrum, Penicillium islandicum
      • citreoviridin je silně fotolabilní (detoxikace slunečním zářením), má jasně žlutou barvu, která se projeví na rýži ("žlutá rýže")
      • Asie, Japonsko za 2. Světové války
    • Alimentární toxická aleukie (ATA)
      • Rusko, 19. st., 2. světová válka
      • onemocnění je způsobeno T-2 toxinem a příbuznými trichotheceny
      • producenti: druhy z rodu Fusarium (Fusarium poae a F. sporotrichioides)
      • onemocnění má tři fáze:
        • 1) první příznaky na trávicím ústrojí - záněty sliznice, zvracení, průjmy. T-2 toxin může proniknout do organizmu i neporušenou pokožkou
        • 2) dostavuje se zdánlivá úleva, doprovázená poklesem počtu krevních destiček a bílých krvinek
        • 3) postižení bakteriálními infekcemi pro zdravého člověka nepatogenními, krvácení (vykrvácení žen během menstruace), často bývají postiženy krční mandle, proto byla choroba známa i pod synonymem "septická angína„, někdy smrt udušením (otok krku)
  • 2. Multifaktoriální - mykotoxin je jedním z možných činitelů:
    • Toxická hepatitida
      • původci hepatotoxické mykotoxiny (aflatoxiny, cyklochlorotin či luteoskyrin)
      • při chronické expozici vyvolávají poškození jater, mající charakter zánětu
      • častěji se vyskytuje hepatitida hospodářských zvířat
      • výskyt tohoto onemocnění je u lidí převážně v rozvojových zemích
    • Primární hepatom
      • karcinogenita aflatoxinů se projevuje především indukcí nádoru jater
      • primární hepatom má rovněž vztah k nosičství viru infekční hepatitidy B
      • prodělání hepatitidy B zvyšuje riziko karcinomu jater cca dvacetinásobně
      • virus je nyní považován za jeden z prokázaných lidských onkovirů, ovšem k onkogenezi potřebuje přítomnost karcinogenní látky, což je velice často právě aflatoxin
    • Aflatoxiny vyvolaný Reyův syndrom
      • Reyův syndrom je polyetiologický chorobný stav postihující děti, který lze vyvolat i některými léky (např. Acylpyrin), jedy a virovou infekcí.
      • S aktivitou aflatoxinů je u nás spojováno úmrtí dětí v 70. letech, u nichž byl popsán Reyův syndrom. Ve všech případech byl zjištěn v játrech aflatoxin B1. Přítomnost aflatoxinu byla poté dokázána mimo jiné v sušeném mléce, které bylo součástí výživy kojenců.
      • Onemocnění se vyznačuje rychlým přechodem do těžkého bezvědomí po horečnatém onemocnění s nespecifickými příznaky, připomínajícími virózu. V komatu se projeví současné těžké postižení jater a mozku, které je i příčinou smrti.
    • Hyperestrogenismus
      • je vyvolán zearalenonem s účinky estrogenů, který se vyskytuje v potravě (zejména obilniny a výrobky z nich)
      • především u dobytka-jsou popsány záněty rodidel, zmetání a poruchy plodnosti u samců
      • v ČSSR bylo zachyceno několik případů hyperestrogenismu u dětí, kde vektorem bylo maso slepic, konzumované rodinami pracovníků drůbežáren v neobvyklém množství
• Kategorizace mykotoxinů z hlediska karcinogenity (IARC-WHO)
  • Aflatoxiny 1 prokázaný karcinogen pro člověka
  • Ochratoxin A 2B možný karcinogen pro člověka
  • Fumonisiny 2B možný karcinogen pro člověka
  • Fusarin C 2B možný karcinogen pro člověka
  • Zearalenon 3 zatím není klasifikován jako karcinogen pro člověka
  • Deoxynivalenol 3 zatím není klasifikován jako karcinogen pro člověka
  • T-2 toxin 3 zatím není klasifikován jako karcinogen pro člověka
  • Category 1: carcinogenic to humans (karcinogenní pro lidi).
  • Category 2A: probably carcinogenic to humans (pravděpodobně karcinogenní).
  • Category 2B: possibly carcinogenic to humans (možná karcinogenita).
  • Category 3: not classifiable as to carcinogenicity in humans (nezařaditelný jako karcinogenní).
  • Category 4: probably not carcinogenic to humans (pravděpodobně nekarcinogenní).
• Mykotoxiny – stanovení
  • Analytika mykotoxinů - ke stanovení mykotoxinů je možné využít jejich fyzikální, chemické a biologické vlastnosti
    • fyzikálně-chemické
    • biologické
    • toxikologické
    • mikrobiologické
  • Detekce
    • kvalitativní
    • semikvantitativní
    • kvantitativní
  • Analytické procesy:odběr vzorku, extrakce, přečištění, stanovení
    • Odběr vzorku
      • odběr a zpracování vzorků je pro některé potraviny a suroviny upraven zvláštní normou a k dosažení reprodukovatelných výsledků je nutno předepsané postupy striktně dodržovat
      • Metoda HPLC s postkolonovou derivatizací a s přečištěním na imunoafinitní kolonce
    • Extrakce
      • účelem je převést co největší podíl stanovované látky ze vzorku do co nejmenšího objemu vhodného rozpouštědla s co nejmenším podílem rušících látek
      • způsob extrakce závisí na fyzikálně-chemických vlastnostech komodit kontaminovaných mykotoxiny a na zvoleném způsobu přečištění extraktů
    • Čištění extraktu
      • zbavení primárního extraktu nežádoucích látek
      • čištění ve fázích kapalina - kapalina, kapalina - pevná látka a čištění imunoafinní
      • čištěním kapalina-kapalina převádíme testovanou látku z jednoho rozpouštědla do druhého, popř. převádíme do jiného rozpouštědla nežádoucí extrahované látky (ochratoxin A nebo kyselina cyklopiazonová)
      • čištěním kapalina - pevná látka dochází k sorpci testované látky na povrchu vhodného sorbentu, vymytí nežádoucích zároveň adsorbovaných látek a následnému vymytí testované látky
      • imunoafinní kolonky představují prostupný gel, v němž jsou ukotveny specifické protilátky proti mykotoxinu - skupině mykotoxinů. Extrakt je protlačen (nebo volně proteče) přes kolonku, nežádoucí látky jsou vymyty a poté je kolonka promyta rozpouštědlem, které ruší vazbu mykotoxin -protilátka.
  • Metody fyzikálně-chemické
    • sloupcová chromatografie – v současné době používána k předčišťování vzorků, které jsou poté analyzovány jinou metodou
    • tenkovrstevná chromatografie (TLC) - zpravidla méně přesná, ale čištění vzorku může být méně náročné
    • vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC) – vysoká přesnost, ale je nutno použít velmi účinné čistící postupy, při nichž dochází ke značným ztrátám
    • detekce fluorimetricky
  • Metody biologické
    • imunologické metody RIA a ELISA
    • mykotoxiny působí jako hapteny, to znamená, že po navázání na vhodný nosič (např. bílkovinu) vyvolají tvorbu specifických protilátek
    • imunologických metod se používá především v rámci výzkumu, popř. vnitropodnikového sledování, kde vynikne jejich vysoká citlivost (alespoň v případě aflatoxinů, ochratoxinu, zearalenonu apod.)
  • Metody toxikologické
    • používají se minimálně
    • testy, detekující estrogenní látky (zearalenon) na základě zvětšení dělohy u nedospělých samiček potkanů a myší
    • testy na bezobratlých (žábronožky, prvoci)
  • Metody mikrobiologické
    • detekce blokády růstu testovacího kmene kolem disků s obsahem mykotoxinu
    • podezření na konkrétní mykotoxin je dáno jednak postupem přípravy vzorku a použitím kmene se selektivně vysokou citlivostí k určitému mykotoxinu - skupině mykotoxinů

Další mikromycety kontaminující potraviny „Food borne fungi“

• Xerofilní a termotolerantní houby
  • rostou na substrátech s nízkou vodní aktivitou (substráty sušší, s vysokými koncentracemi cukrů nebo solí) např.: vysychající pečivo
  • většinou se jedná o zelené porosty rodu Eurotium (anamorfa Aspergillus)
  • častěji se vyskytují v tropických a subtropických oblastech
  • k nám jsou dováženy s kořením (např. pepř, nové koření) nebo jiných sušených produktech ve formě spor
  • jsou termotolerantní – askospory krátkodobě přežívají teplotu 60–65 °C
  • pro kultivaci se používají média s vyšším obsahem cukru (např.: CY20S – Czapkův agar s kvasničným extraktem a 20% sacharózy)
  • Wallemia sebi nepohlavně se rozmnožující bazidiomyceta, na bílém pečivu (housky, rohlíky, arabský chléb) vytváří hnědé 1-2 mm velké kolonie
• Psychrotolerantní houby
  • Cladosporium: nacházen na stěnách zanedbaných lednic nebo zapomenutých potravinách
  • Thielaviopsis thielavioides: způsobuje tmavé skvrny na uskladněné mrkvi
  • Botrytis cinerea plíseň šedá - za chladného a deštivého počasí napadá dužnaté plody např.: jahody, réva vinná - ušlechtilá plíseň – výroba botrytického vína
  • Penicillium digitatum, P. italicum a P. expansum
    • původci hnilob ovoce v domácnostech
    • P. digitatum a P. italicum se vyskytují výlučně na citrusech (citrony, pomeranče, grepy aj.)
    • P. digitatum způsobuje zelenou hnilobu
    • P. italicum modrou hnilobu
  • Monilia fructigena: hniloba ovoce (většinou si houbu přineseme již na ovoci)
• Mikroskopické houby v nápojích
  • druhy rodu Fusarium a Trichoderma nalezeny v sycených a ochucených minerálních vodách