There are three types av RNA:

rRNA, ribosomal RNA makes up around 80% of all RNA, made up by long RNA molecules that make up the ribosomes that put toughether aminoacids to proteins. 3 for bacteria and 4 for eukaryotes. This type of RNA is active and works as an enzyme. This enzyme catalyzes reactions in proteinsynthesis.

tRNA

Makes up around 15% of RNa, transfer-RNA, works as translationkeys during proteinsynthesis. In one end it is able to bind an aminoacide and in the other it has three nitrogenbases that can pare with the description of the aminoacid it binds. 70-90 bases long.

mRNA

messenger RNA, are recepies for proteins. They are created as copies of genes that describe proteines. The process in which mRNA is made is called transcription.

Transcription

Transcription begins when an enzyme called RNA polymerase recognizes a sequense on the DNA-molecule that says to start the reading here. RNA-polymerase binds to the DNA which starts to open the DNA strands. A opeining of about 18 basepairs it made and one of the two chains gets folded outwards towards the surrounfings which makes free RNA-bases can basepair with the DNA. RNA-polymerase can put together the components and a chain is made. In contrast to DNA RNA can start at 0 and put together two simple RNA compontents with eachother. The RNA chain moves across the DNA chain as it grows. New bases gets opened and already transcribed ones get closed. The transcription ends when the RNA meets a certain sequence marking stop. Sometimes special proteins are neded to help. In this process the mRNA also gets a methylated cap and a poly-A tail. They help with transporting mRNA from the nucleus, protects the molecule from degradetion, fills a function when mRNA is attaches to the ribosome and in starting translation.

splitsning

in eukaryotes the RNA molecules that get created whilst reading the proteincoding genes can also contain copies of intrones that are merged with the genes. The intrones must be removed from the RNA in a process called splising. In this process proteins called snRNP (small nuclear RNAs) are working. The end result is that the intrones are removed and the exones get merged together. This can happen in many diffrent combinations and therefore it will lead to diffrent mRNA-molecules. First after splising will the mRNA leave the eukaryote nucleous and get to the cytoplasme where it will meet ribosomes for translation. In bacteria there is no intrones therfore the RNA in bacteria doesn’t recuire splising.

non coding long RNA-molecules

In mamalcells there are tousands and more than one hundred RNA molecoles that have a unknown function. We only know the function of a few. some are a part of the particals that eukaryotes recognize as a ribosome creating a protein that needs to be transported out of the cell and makes sure that it attaches to the ER.

Other non coding long RNA-molecules are parts of enzymes that make sure that the cromosomes doesn’t get shorter when being copied.

short regulating RNA

There are RNA that determine what proteins a cell should create. These RNA binds to special proteins and are like känselspröt. When they encounter a messenger RNA that contain the right sequense that is completary to the short RNAs. There are two groups of these short RNA molecules. miRNA and siRNA. A micro RNA can bind to a mRNA eventhought the sequense isn’t entierly completary and can therefore supress the production of many proteins. small interferior RNA (siRNA) can only bind to mRNA when the sequense is completery and they do therefore regulate a smaller amount of proteins.

Translation

the process of turning aminoacids into proteins by following the recepie made by rna. Takes place in the ribosome. Ribosomes consist of some RNA molecules and a big number of proteins.

Ribosome

The ribosome is divided in two parts. The big and small subunit. In bacteria the small subunit is made up by a ribosomal RNA molecule and 21 proteins. In a eukaryote a rRNA molecule and 33 proteins. The big subunit is made up by 2 in bacteria and 3 in eukaryotes rRNA. In a ribosome there is place for 3 tRNA molecules at once. it has 3 “seets”. Where the tRNA binds to the ribosome is called acceptor seat(A-site), P-site is where aminoacids get merged together, the site where a emty tRNA leaves is called E-site.

geleelektrofores

när man vill sortera DNA efter storlek kan man använda sig av geleelektrofores. Det negativt laddade DNA:t dras genom positiv

Proteiner

proteiner har många sprida uppgifter.

deras form beskriver deras funktion. ändras strukturen ändras funktionen. 20 aminosyror bygger upp kroppens proteiner. Sätts samman med peptidbindningar till peptider.

Proteiner kan bestå av både aminosyrasekvensen och prostetisk grupp som är delar som inte består av aminosyror. t.ex. hemoglobin har 4 hemgrupper som är prostetiska grupper och 4 aminosyrasekvenser. det är ett konjugerat protein dvs ett protein som innehåller prostetiska grupper.

primärstruktur

De aminosyror som ingår i ett protein och hur dessa sätts samman, aminosyrasekvensen. Receptet för denna finns i generna. Sidokedjorna mellan olika aminokedjor varierar gör att proteinet får olika egenskaper.

sekundärstruktur

Eftersom NH och C=O grupper sticker ut kan de bilda vätebindningar ellan dessa på de ställen grupperna kommer nära varandra. Det gör att hela proteinet kan dra i hop sig till en alfa helix eller veckar proteinet ihop sig vilket gör att delar av aminosyran löper parallellt vilket ger en betastruktur. Vätebindningar håller ihop stukturerna.

tertiärstruktur

efter translation veckar proteinet ihop sig detta är teriärstruktur. Målet är att energinivån ska bli så låg som möjligt. Chaperoner kan skydda andra proteiner från att denatureras av värme. Hjälper visa proteiner att vecka sig rätt. De kan binda till polypeptidkedjan och förhindra att det uppkommer bindningar på fel ställe. Dessutom förhindra trassel när proteinet ska vecka sig.

kvartärstruktur

Om ett protein består av mer än en polypeptidkedja har det en kvartärstruktur. Kan hållas samman av disulfidbryggor, van der Waals-krafter, vätebindningar eller jonbindningar.

enzymer

globulära proteiner som fungerar som katalysatorer. Utan enzym hade reaktioner i celler aldrig skett eller skett med mycket låg hastighet. Enzymer sänker aktiveringsenergin som krävs för att en reaktion ska ske. Enzymer har en aktiv yta vilket substratet(det ämne som ska omvandlas) binder till. När substratet omvandlas till produkt passar det inte längre den aktiva ytan och släpper vilket gör att den aktiva ytan åter är fri att ta emot ett nytt substrat. Förbrukas inte kan återanvändas.

Enzymer är mycket specifika binder endast ett specifikt substrat. Undantag är enzymer i matspjälkningssystemet som är mer allmäna. Då det hade varit slöseri på energi att ha ett specifikt enzym för varje protein.

visa enzymer kräver en kofaktor för att fungera optimalt. Det är ett icke protein förening som krävs för att visa enzym ska fungera. Kan vara en metalljon eller organisk molekyl. Kofaktorer interagerar med enzym och hjälper dom att katalysera kemiska reaktioner effektivt.

-de kan hjälpa enzymet och substratet att binda till varandra

-de kan ändra formen på enzymet för att göra det mer aktivt

-kan donera eller acceptera kemiska grupper under reaktioner

-kan stabilisera övergångsstadiet för en reaktion och på det sättet göra reaktionen enklare att ske.

enzymer är känsliga för förändringar i omgivningen

för höga temperaturer gör att vibrationer i molekylen bryter bindingar som ger det dess struktur och enzymet denatureras permanent. Förändringar i pH gör att enzymets struktur förändras då sidokedjorna byter laddning.

Enzymets förmåga att reagera med substratet påverkas bland annat av koncentrationen substrat. Desto mer substrat desto större chans att substratet kolliderar med enzymet vilket ökar reaktionshastigheten. Detta har dock ett maxvärde då platserna för substratet tar slut. En låg temperatur gör att molekylerna rör sig långsamt bidrar också till lägre reaktionshastighet. Den elektrostatiska attraktion som finns mellan substrat och enzym kan försvinna eller bli repulsion i fel pH-värde.

inhibering av enzym

det finns två typer av inhibering

kompetitiv inhibering

inhibitorn tävlar med substratet om platsen på emzymets yta. Liknar substratets struktur så pass mycket att det passar i samma aktiva yta. Om inhibitorn därför har tillräckligt hög koncentration kan det konkurrera ut substratet, vilket gör att ingen eller mycket liten mängd slutprodukt bildas. Effekten beror på förhållandet mellan inhibitor och substrat vilket gör att genom att tillsätta mer substrat till vis del kan motverka inhibtion.

icke-kompetitiv inhibering

tävlar ej om platserna vid aktiva ytan. Istället binder de till en helt annan del av enzymet vilket gör att formen på enzymet förändras. Den aktiva ytans form förändras därmed vilket gör att substratet ej kan binda. Går inte att förhindra inhibtionen genom att tillsätta mer substrat.

många av de metaboliska reaktionsvägar som finns i våra celler styrs av kompetitiv och icke-kompetitiv inhibering. den slutprodukt som bildas efter flera reaktionssteg där enzymer varit aktiva kan fungera som kompetitiv inhibitor till det första reaktionssteget och därmed förhindra överproduktion.

Inom industrin används enzymer som renats fram för att i tvättmedel bryta ner protein fläckar, stärkelsefläckar och lipidfläckar. Gör att man kan tvätta i lägre temperaturer. även i livsmedel.

antikroppar

stora y formade proteiner. produceras av B-lymfocyter, binder till kroppsfrämande ytmolekyler, aka antigener. består av två identiska långa polypeptider och två korta polypeptider. de långa polypeptiderna bildar tillsammans skafter på anitkropparna. Skänklarna består av både de långa och korta polypeptider. Man brukar kalla skaftet den konstanta delen av antikroppen. Skaftet kan däremot också varieras vilket bildar olika grupper av antikroppar t.ex. igG. vilka är inriktade på olika hot t.ex. större parasieter eller bakterier. I änden på skänklarna finns det en mycket variabel del som gör att antikroppen kan binda specifikt till ett visst antigen.

antikroppar produceras av B-lymfocyter, de har inga färdiga gener för viken specifik antigen som ska tillverkas istället finns det DNA sekvenser som består av olika segment. Några av segmenten kodar för de konstanta delarna av antikroppen medans andra kodar för de variabla. När B-lyfocyten mognar flyttas dessa segment om slumpmässigt samtidigt som visa nukleotider tas bort eller tillsätts. Det för att många olika antigenbindande delar kan bildas på skänklarna.

vid framställning av monoklonala antikroppar (antikroppar från en samma B-lyfocyt och därmed identisk klon)

För att studera proteiner behöver man rena fram dem ur vävnader dock omöjligt att få 100% rent protein.

kromatografi

Proteiner skiljer sig i storlek, laddning, affinitet (förmåga att binda sin receptor). I samtliga kromatografier låter man proteinextrakt rinna genom en kolonn packadmed kolonnmassa. Det man får ut ur kromatorgrafin kallas eluat och vätskan elueringsvätska. Det som skiljer metoderna är kolonnmassan

Gelefiltrering

Proteinerna skiljs utifrån storlek. Proteinblandning får rinna genom en kolonn fylld med gelkulor som är porösa och gör att små molekyler kan tränga sig in och förvirrar sig i nätverket. Vilket tar längre tid än vägen för större molekyler som inte kan komma in i de små porerna utan istället rinner rät igenom då de kan ta en snabbare väg är det principen störst går först som gäller. Man samlar hela tiden små fraktioner elueringsvätska i provrör så man kan hitta det renade proteinet.

jonbyteskromatografi

laddningen för ett protein vid ett visst pH värde beror på R-grupperna. Vid jonbyteskromatografi är kolonnen fylld med en massa som antingen är positiv eller negativ. Om man vill rena fram ett positivt protein i ett visst pH fylls kolonnen med negativa joner vilket gör att övriga proteiner med negativ laddning rinner igenom med elueringsvätskan som hälls bort. kvar blir de önskade proteinerna som sedan släpps genom att positivt laddade joner “knuffar” bort proteinmolekylerna och konkurerrar ut dem när det gäller bindningen till kolonnens negativt laddade grupper.

Affinitetskromatografi

Vissa proteiner binder starkt till specifika molekyler. Dessa molekyler kallas i affinitetskromatografi för ligander. Genom att fästa en ligand (kan vara antikropp) till bärarmaterialet kan ett visst protein fastna under elueringsprocessen samtidigt som andra proteiner passerar med elueringsvätskan. En elueringsvätska med speciellt pH-värde eller salthalt kan få proteinet att släppa från liganden.

elektrofores

Vid elektrofores låter man proteiner, DNA eller RNA vandra i ett elektriskt fält. Beroende på vilken typ av elektrofores kan då det undersökta ämnet separeras utifrån storlek, laddning eller båda. Gelelektrofores används för att analysera ett protein eller rena detta. Om man vill rena det skär man ut den del av gelen där proteinet koncentrerats och färgningen skapat ett band. Därefter kan proteinet elueras ut med hjälp av elektroelution.

SDS PAGE

proteiner separeras utifrån storlek. en variant av geleelektrofores

HJÄLP OMG SIDA 144!!!

Iso elektrisk fokusering

proteiner separeras utifrån laddning, alla proteiner har ett visst pH vid nettoladdningen noll det kallas isoelektrisk punkt. När man använder isoelektrisk fokusering får proteinerna vandra i ett elektriskt fält i en gel innehållande amfolyter (molekyler eller joner som har olika laddning beroende på pH:t de befinner sig i). Amfolyterna förflyttar sig i gelen tills pH blir noll och bygger under tiden upp en pH-gradient. Gelen får då samma pH-värde som amfolyternas isoelektriska punkter. Därför kan man beroende på vilka amfolyter man väljer få en pH gradient som sträcker sig långt eller kort. Proteiner kommer vandra till den plats i gelen där pH-värdet motsvarar det som gör att proteinets laddning blir noll. Genom detta kan man både rena proteiner och ta reda på deras isoelektriska punkt.

2D-gelelektrofores

En kombination av SDS PAGE och isoelektrisk fokusering. Proteiner separeras utifrån storlek och laddning. Först vandrar proteinerna genom rör som bildar isoelektrisk fokusering. Därefter in i en lösnig som innehåller SDS. Därefter till en separationsgel och proteinerna separeras enligt SDS-PAGE-metoden. (efter storlek)

immunologisk metod

Innebär att man använder monoklonala antikroppar för att identifiera ett visst protein, antikropp eller annan antikropp.

-westernblotting

för att identifiera ett protein bland andra protein i en elektroforesgel kan man använda western blotting. Efter avslutad elektrofores placeras gelen på ett membran, oftast nitrocellulosa. gelen och membranet pressas samman i en kasset som innehåller buffert. genom att lägga på en elektrisk spänning vinkelrätt mot gel/membran överförs proteinerna från gelen till membranet som därefter kallas blot. Blotten placeras i en lösning med proteiner, blocklösning, som ofta består fettfri torr mjölk eller fancy serum. För att blockera de hydrofoba bindningplatserna på membranet. Efter det placeras membranet i en lösning med primära antikroppar som binder till det protein man vill detektera. Därefter inkuberas membranet i en lösning med sekundära antikroppar för att de ska kunna detekteras. En vanlig detektionsmetod är att använda enzymkopplade sekundär antikroppar som ger en sekundär reaktion. Det gör att bandet med proteinet i fråga får en speciell färg när enzymet får verka på ett visst substat. Ett alternativ är att enzymet istället ger upphov till en ljusreaktion.

CRISPR

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) is a revolutionary tool for editing genes in organisms. It is a simple yet powerful gene editing technology that allows for precise and targeted changes to DNA sequences. CRISPR is based on a natural defense mechanism that bacteria use to protect themselves from viruses. Scientists have adapted this system to work in other organisms, including animals and plants.

The CRISPR system consists of two main components: the Cas enzyme and the guide RNA (gRNA). The Cas enzyme acts like a pair of molecular scissors, cutting DNA at a specific location. The gRNA serves as a targeting system, guiding the Cas enzyme to the exact location on the DNA where it should make the cut.

The use of CRISPR in gene editing involves a three-step process. First, the gRNA is designed to match the target gene sequence. Second, the Cas enzyme is introduced to the cell and guided to the target gene by the gRNA. Finally, the Cas enzyme makes a precise cut in the target gene.

Once the DNA is cut, the cell will attempt to repair the break. There are two main ways that the cell can repair the break: non-homologous end joining (NHEJ) or homology-directed repair (HDR). NHEJ is a quick but imprecise process that often results in small deletions or insertions at the site of the cut, leading to gene knockouts. HDR is a slower but more precise process that can be used to introduce new DNA sequences at the site of the cut, leading to gene knock-ins.

RNAi

RNA interference (RNAi) is a regulatory biological process that takes place at the molecular level and plays a vital role in gene expression. It goes by a process of silencing targeted genes from being expressed or translated into proteins. RNAi is initiated by a small RNA molecule called small interfering RNA or siRNA that activates a protein complex known as RNA-induced silencing complex or RISC to selectively degrade messenger RNA (mRNA). This degradation prevents the production of a protein that would have been synthesized from the mRNA.

There are two ways by which RNAi operates:

1. Endogenous RNAi:

Endogenous RNAi is initiated by microRNA (miRNA) and small interfering RNA (siRNA) molecules produced by its human host. These molecules are produced by the cleavage of the RNA molecule that has a complementary sequence with the target mRNA, guiding RISC to the mRNA.

2. Exogenous RNAi:

Exogenous RNAi is initiated by double-stranded RNA (dsRNA), which has a sequence complementary to the target mRNA. The dsRNA is converted by an enzyme called Dicer to small siRNA molecules. The siRNA molecules are then transported by RISC to the target mRNA to degrade it.

Mechanisms of RNAi:

1. Initiation of RNAi:

Initiation is the first step in RNAi that involves the production of a small RNA molecule which serves as a template for the RISC complex to target the target mRNA. This results in the formation of a complex consisting of the small RNA molecule and an RNA-induced silencing complex (RISC).

2. Formation of the RISC complex:

The RISC complex is composed of two key proteins, Argonaute (AGO) and Dicer. Dicer recognizes and cleaves the larger dsRNA into smaller siRNA molecules. These fragments are then loaded onto the RISC complex which is responsible for identifying mRNA targets and carrying out silencing.

3. Target mRNA recognition:

The RISC complex recognizes the target mRNA through the complementary base pairing of the siRNA within the RISC with the mRNA. The RISC then creates a single-stranded mRNA by cleaving the mRNA with an endonuclease activity of the AGO protein.

4. mRNA degradation:

The single-stranded mRNA degradation mechanism involves the addition of nucleotides to the 3' end of the mRNA that are called oligo(A) tail, to make it more susceptible to degradation by the cellular machinery. Subsequently, nucleases degrade the mRNA to ensure its complete elimination from the cell.

In conclusion, RNAi is a powerful regulatory mechanism that plays a vital role in gene expression. By silencing specific genes, it can influence every biological process that relies on gene expression, including development, metabolism, and stress response. The understanding of its mechanisms has many potential implications for future therapies and treatments of various genetic diseases including cancers, viral infections, and neurological disorders.

119

125-127

95

151-154

ELIZA ( enzyme-linked immuno-sorbent assay)

en vanligt immunologisk metod för att detektera och kvantifiera ett antigen eller antikropp. Används för att spåra sjukdomar

1. ett prov samlas in ex. urin, blod, saliv

2. coating: botten av en microtiter blir belagd med en speciell antikropp som detekterar det antigen som man vill testa emot. Denna antikropp kallas capture antibody

3. Incubation: provet som innehåller antigenet tillsätts till den belagda platan. Plattan får därefter inkubera under föreskriven tid. Under denna tid binds antigenen till capture antikropparna.

4. Washing: plattan sköljs med en buffert lösning för att få bort obundna substanser. Det gör att bara antigen som bundit till antikropparna kvarstår

5. detection: En sekundär antikropp tillsätts som binder till antigen som är bundna till den primära antikroppen. Denna sekundära antikropp är bunden till ett enzym som katalyserar en färgreaktion när ett substrat tillsätts. Denna färgskiftning visar på att antigenet finns i provet

6. analysis: färg intensiteten mäts för att kunna bestämma mängden antigen i provet. En högre färg intensitet indikerar högre koncentration i provet.

RNAi

RNA interferens används för att tysta proteinuttryck. Det finns två sätt för detta att ske genom siRNA och miRNA. Båda formerna av RNAi fungerar genom att en hairpin och gRNA lämnar cellkärnan. Hairpinen klipps av av DICER och gRNA:et sätts in i proteinet. En endonukleas bildas. Om det är siRNA klipps mRNA:et i läsramen medan miRNA klipper i polyA svansen vilket gör det svårt att komma fram till robosomerna vilket därmed stoppar RNA:et från att bilda proteinerna.

för att genomföra CRISPR krävs gRNA och cas9. Dessa inkorporeras i cellkärnan med hjälp av en plasmid. gRNA:et har en hairpin och binder till cas9 med hjälp av denna. därefter letar cas9 efter en NGG sekvens på DNA:et för att hitta rätt ställe att genomföra dubbelsträngsbrottet på. Beroende på om man vill slå ut en gen eller lägga till genetisk information samt beroende på cellens miljöfaktorer kan detta dubbelsträngsbrott lagas på olika sätt. Om cellen påverkas av stress lagas dubbelsträngsbrotten med hjälp av NHEJ, nukleotider nära brottet kan tas bort eller nukelotider i närheten inkorporeras det gör att genen oftast får en läsramsförskjutning och slås ut. HDR är det andra sättet att laga dubbelsträngsbrottet på. om inga gener ska tillsättas lagas dubbelsträngsbrottet genom att det andra exemplaret av kromosomen kopieras. Om man ska tillsätta gener görs detta genom att DNA sekvensen för detta är vad som kopieras istället för den andra kromosomen.

CRISPR i bakterier

CRISPR is an adaptive immune system that helps bacteria defend themselves against foreign genetic elements such as viruses and plasmids. It works by creating small RNA molecules (CRISPR RNAs or crRNAs) that recognize and bind to specific DNA sequences of invading foreign genetic material.

The CRISPR system consists of three main components: CRISPR arrays, Cas (CRISPR-associated) proteins, and crRNAs. The CRISPR array is a region of bacterial DNA that contains short, repeated sequences interspersed with unique spacer sequences. These spacer sequences are derived from foreign DNA that the bacterium has encountered in the past.

When a bacterium encounters a foreign DNA sequence that matches one of the spacers in its CRISPR array, it uses the Cas proteins and crRNAs to target and cut the invading DNA. The crRNA acts as a guide, binding to the foreign DNA and directing the Cas protein to cleave the DNA.

Once the Cas protein has cut the invading DNA, the bacterium can degrade the DNA or use it as a template to repair any damage to its own DNA. By using the CRISPR system to target and destroy foreign DNA, bacteria can protect themselves and their offspring from future invasions by the same or similar viruses and plasmids.

Chaperones (also known as molecular chaperones or heat shock proteins) are proteins that help to guide the folding, assembly, and maturation of other proteins in the cell. They work to prevent protein misfolding and aggregation, which can lead to cellular damage and disease.

Chaperones bind to newly synthesized or misfolded proteins, and in doing so, shield them from interaction with other proteins or structures in the cell that could promote improper folding. Chaperones can also provide physical support to help coax the protein into the correct three-dimensional shape, and they can provide energy to drive protein folding reactions.

In addition, chaperones can also help to transport proteins to their final destination in the cell, such as the plasma membrane or inside organelles. By ensuring that proteins are properly folded and localized within the cell, chaperones play a crucial role in maintaining cellular function and preventing disease.