Biologia Molecolare: Acidi Nucleici e DNA
DNA e RNA: Strutture e Differenze
- La scoperta della struttura del DNA è attribuita a James Watson e Francis Crick nel 1956.
- Il DNA (acido desossiribonucleico) è una molecola a doppia elica composta da due filamenti avvolti l’uno attorno all’altro.
- Ogni filamento è un polimero di nucleotidi.
- Ogni nucleotide è composto da:
- Uno zucchero (desossiribosio).
- Un gruppo fosfato.
- Una base azotata (adenina, timina, citosina o guanina).
- Le basi azotate si accoppiano in modo specifico:
- Adenina con timina.
- Citosina con guanina.
- La sequenza delle basi determina le informazioni genetiche e la funzione del DNA.
- Le basi azotate sono divise in:
- Purine
- Pirimidine
- Timina (T) (nel DNA) o Uracile (U) (nell’RNA)
- Citosina (C)
- Le purine si accoppiano con le pirimidine tramite legami idrogeno.
- Adenina con timina o uracile.
- Guanina con citosina.
Differenze tra DNA e RNA
- Il DNA e l’RNA sono entrambi acidi nucleici, ma presentano differenze fondamentali:
- Struttura:
- DNA: doppia elica.
- RNA: molecola singola (può formare strutture complesse).
- Zucchero:
- DNA: desossiribosio.
- RNA: ribosio.
- Basi azotate:
- DNA: adenina (A), timina (T), citosina (C), guanina (G).
- RNA: adenina (A), uracile (U), citosina (C), guanina (G).
- Differenza chimica tra timina e uracile: la timina ha un gruppo metilico (CH3) sul carbonio 5.
- Funzione:
- DNA: deposito di informazioni genetiche.
- RNA: sintesi proteica (mRNA), trasferimento di amminoacidi (tRNA), catalisi (rRNA).
- Le basi azotate hanno elettroni liberi che formano legami idrogeno (legami Watson-Crick).
- Accoppiamenti specifici:
- Adenina-timina (A-T): due legami idrogeno.
- Guanina-citosina (G-C): tre legami idrogeno.
- Questi legami stabilizzano la doppia elica e assicurano la fedeltà della replicazione del DNA.
- I legami idrogeno permettono anche la separazione dei filamenti durante replicazione e trascrizione.
- La temperatura per rompere i legami è più alta per G-C che per A-T.
- Struttura del DNA:
- Formata da complementarità delle basi e legami fosfodiesterici tra due zuccheri.
- Struttura portante: zucchero e fosfato.
- Legami Watson-Crick tra le basi azotate all’interno.
- Stabilizzazione: struttura portante (legami fosfato) e interna (legami idrogeno).
- Termodinamicamente favorevole, dinamica e difficile da distruggere.
- Efficienza tra basi complementari per formare la doppia elica.
- Elica non simmetrica con solco minore e solco maggiore.
- Solco minore: difficile interazione con proteine.
- Solco maggiore: permette l’accesso delle proteine al DNA.
- Il DNA durante la formazione dei legami fosfato perde acqua, compattandosi.
- Atomi di azoto e ossigeno creano un pattern di accettori e donatori di legami a idrogeno.
Interazione del DNA con gli Enzimi
- Il DNA interagisce con vari enzimi in modi diversi, fondamentali per le funzioni cellulari.
- Esempi:
- Replicazione del DNA (DNA polimerasi).
- Trascrizione (RNA polimerasi).
- Riparazione del DNA (enzimi di riparazione).
- Restrizione e modificazione (enzimi di restrizione).
- Modificazioni epigenetiche.
Enzimi di Restrizione
- Proteine che riconoscono e tagliano il DNA in sequenze specifiche.
- Classificati in:
- Enzimi Blunt (a “fronte”): tagliano il DNA in modo netto, creando estremità piatte.
- Enzimi Sticky (a “punta”): generano estremità adesive con nucleotidi sporgenti.
Visualizzazione del DNA
- Elettroforesi su gel di agarosio.
- Maggiore concentrazione di agarosio per riconoscere frammenti che differiscono di poche paia di basi.
- Bromuro di etidio per rendere visibile il DNA (tossico).
- Coloranti (es. bronfenolo) per seguire la corsa del DNA.
- DNA marker derivato da frammentazione con enzimi di restrizione per identificare le dimensioni dei frammenti.
Denaturazione e Ibridazione del DNA
- Denaturazione:
- Separazione della doppia elica in filamenti singoli a temperature elevate, rompendo i legami idrogeno.
- La temperatura di denaturazione varia in base alla composizione del DNA (quantità di legami G-C).
- Molecole caotropiche diminuiscono la temperatura di melting.
- Fondamentale in tecniche come PCR e sequenziamento del DNA.
- Ibridazione:
- Unione di due filamenti di DNA o RNA complementari per formare una nuova doppia elica.
- Avviene a temperature inferiori rispetto alla denaturazione.
- Utilizzata in Southern blot, Northern blot e nella progettazione di sonde di DNA.
- Denaturazione separa i filamenti, l’ibridazione li riunisce.
- Ibridazione ad alta stringenza: interazione solo tra sequenze perfettamente complementari.
- Ibridazione a bassa stringenza: permette appaiamenti con una base azotata non complementare.
- Alta stringenza: molecole DNA complementari.
- Bassa stringenza: molecole simili ma non completamente complementari.
Microarray
- Un esempio di ibridazione del DNA.
- Lastra di vetro o plastica con migliaia di sonde di DNA specifiche per diverse sequenze geniche.
- Funzione:
- Preparazione del campione: estrazione di RNA o DNA da cellule o tessuti.
- Etichettatura con colorante fluorescente.
- Interazione del campione marcato con il microarray.
- Legame delle sonde complementari a sequenze nel campione.
- Rilevamento della fluorescenza con un laser.
- Aree illuminate indicano quali geni sono espressi e a quale livello.
- L’RNA deve passare per la trascrittasi inversa per diventare cDNA.
- Avremo solo gli esoni, attaccati ma non separati dagli introni.
- Il DNA viene frammentato con ultrasuoni o enzimi di restrizione.
- Marcatura con biotina e pattern di colore trasformato in sequenze di numeri.
Southern Blotting
- Tecnica per rilevare specifiche sequenze di DNA in un campione.
- Fasi:
- Estrazione del DNA.
- Digestione enzimatica con enzimi di restrizione.
- Elettroforesi su gel di agarosio (separazione in base alla dimensione).
- Trasferimento su membrana di nylon o nitrocellulosa.
- Ibridazione con sonde di DNA marcate.
- Rilevazione della sonda marcata.
- Applicazioni:
- Diagnosi di mutazioni o malattie genetiche.
- Ricerca sulla struttura e organizzazione del DNA.