Biologia Molecolare: Acidi Nucleici e DNA

DNA e RNA: Strutture e Differenze

• La scoperta della struttura del DNA è attribuita a James Watson e Francis Crick nel 1956.
• Il DNA (acido desossiribonucleico) è una molecola a doppia elica composta da due filamenti avvolti l’uno attorno all’altro.
• Ogni filamento è un polimero di nucleotidi.
  • Ogni nucleotide è composto da:
    • Uno zucchero (desossiribosio).
    • Un gruppo fosfato.
    • Una base azotata (adenina, timina, citosina o guanina).
• Le basi azotate si accoppiano in modo specifico:
  • Adenina con timina.
  • Citosina con guanina.
• La sequenza delle basi determina le informazioni genetiche e la funzione del DNA.
• Le basi azotate sono divise in:
  • Purine
    • Adenina (A)
    • Guanina (G)
  • Pirimidine
    • Timina (T) (nel DNA) o Uracile (U) (nell’RNA)
    • Citosina (C)
• Le purine si accoppiano con le pirimidine tramite legami idrogeno.
  • Adenina con timina o uracile.
  • Guanina con citosina.

Differenze tra DNA e RNA

• Il DNA e l’RNA sono entrambi acidi nucleici, ma presentano differenze fondamentali:
  • Struttura:
    • DNA: doppia elica.
    • RNA: molecola singola (può formare strutture complesse).
  • Zucchero:
    • DNA: desossiribosio.
    • RNA: ribosio.
  • Basi azotate:
    • DNA: adenina (A), timina (T), citosina (C), guanina (G).
    • RNA: adenina (A), uracile (U), citosina (C), guanina (G).
  • Differenza chimica tra timina e uracile: la timina ha un gruppo metilico (CH3) sul carbonio 5.
  • Funzione:
    • DNA: deposito di informazioni genetiche.
    • RNA: sintesi proteica (mRNA), trasferimento di amminoacidi (tRNA), catalisi (rRNA).
• Le basi azotate hanno elettroni liberi che formano legami idrogeno (legami Watson-Crick).
  • Accoppiamenti specifici:
    • Adenina-timina (A-T): due legami idrogeno.
    • Guanina-citosina (G-C): tre legami idrogeno.
    • Questi legami stabilizzano la doppia elica e assicurano la fedeltà della replicazione del DNA.
    • I legami idrogeno permettono anche la separazione dei filamenti durante replicazione e trascrizione.
    • La temperatura per rompere i legami è più alta per G-C che per A-T.

Come si Forma il DNA

• Struttura del DNA:
  • Formata da complementarità delle basi e legami fosfodiesterici tra due zuccheri.
  • Struttura portante: zucchero e fosfato.
  • Legami Watson-Crick tra le basi azotate all’interno.
  • Stabilizzazione: struttura portante (legami fosfato) e interna (legami idrogeno).
  • Termodinamicamente favorevole, dinamica e difficile da distruggere.
  • Efficienza tra basi complementari per formare la doppia elica.
  • Elica non simmetrica con solco minore e solco maggiore.
    • Solco minore: difficile interazione con proteine.
    • Solco maggiore: permette l’accesso delle proteine al DNA.
• Il DNA durante la formazione dei legami fosfato perde acqua, compattandosi.
  • Atomi di azoto e ossigeno creano un pattern di accettori e donatori di legami a idrogeno.

Interazione del DNA con gli Enzimi

• Il DNA interagisce con vari enzimi in modi diversi, fondamentali per le funzioni cellulari.
  • Esempi:
    • Replicazione del DNA (DNA polimerasi).
    • Trascrizione (RNA polimerasi).
    • Riparazione del DNA (enzimi di riparazione).
    • Restrizione e modificazione (enzimi di restrizione).
    • Modificazioni epigenetiche.

Enzimi di Restrizione

• Proteine che riconoscono e tagliano il DNA in sequenze specifiche.
• Classificati in:
  • Enzimi Blunt (a “fronte”): tagliano il DNA in modo netto, creando estremità piatte.
  • Enzimi Sticky (a “punta”): generano estremità adesive con nucleotidi sporgenti.

Visualizzazione del DNA

• Elettroforesi su gel di agarosio.
  • Maggiore concentrazione di agarosio per riconoscere frammenti che differiscono di poche paia di basi.
  • Bromuro di etidio per rendere visibile il DNA (tossico).
  • Coloranti (es. bronfenolo) per seguire la corsa del DNA.
  • DNA marker derivato da frammentazione con enzimi di restrizione per identificare le dimensioni dei frammenti.

Denaturazione e Ibridazione del DNA

• Denaturazione:
  • Separazione della doppia elica in filamenti singoli a temperature elevate, rompendo i legami idrogeno.
    • La temperatura di denaturazione varia in base alla composizione del DNA (quantità di legami G-C).
  • Molecole caotropiche diminuiscono la temperatura di melting.
  • Fondamentale in tecniche come PCR e sequenziamento del DNA.
• Ibridazione:
  • Unione di due filamenti di DNA o RNA complementari per formare una nuova doppia elica.
  • Avviene a temperature inferiori rispetto alla denaturazione.
  • Utilizzata in Southern blot, Northern blot e nella progettazione di sonde di DNA.
    • Denaturazione separa i filamenti, l’ibridazione li riunisce.
  • Ibridazione ad alta stringenza: interazione solo tra sequenze perfettamente complementari.
  • Ibridazione a bassa stringenza: permette appaiamenti con una base azotata non complementare.
    • Alta stringenza: molecole DNA complementari.
    • Bassa stringenza: molecole simili ma non completamente complementari.

Microarray

• Un esempio di ibridazione del DNA.
• Lastra di vetro o plastica con migliaia di sonde di DNA specifiche per diverse sequenze geniche.
• Funzione:
  • Preparazione del campione: estrazione di RNA o DNA da cellule o tessuti.
    • Etichettatura con colorante fluorescente.
  • Interazione del campione marcato con il microarray.
    • Legame delle sonde complementari a sequenze nel campione.
  • Rilevamento della fluorescenza con un laser.
    • Aree illuminate indicano quali geni sono espressi e a quale livello.
• L’RNA deve passare per la trascrittasi inversa per diventare cDNA.
  • Avremo solo gli esoni, attaccati ma non separati dagli introni.
  • Il DNA viene frammentato con ultrasuoni o enzimi di restrizione.
  • Marcatura con biotina e pattern di colore trasformato in sequenze di numeri.

Southern Blotting

• Tecnica per rilevare specifiche sequenze di DNA in un campione.
• Fasi:
  1. Estrazione del DNA.
  2. Digestione enzimatica con enzimi di restrizione.
  3. Elettroforesi su gel di agarosio (separazione in base alla dimensione).
  4. Trasferimento su membrana di nylon o nitrocellulosa.
  5. Ibridazione con sonde di DNA marcate.
  6. Rilevazione della sonda marcata.
• Applicazioni:
  • Diagnosi di mutazioni o malattie genetiche.
  • Ricerca sulla struttura e organizzazione del DNA.