9) komunikace mezi buňkami

Proč buňky komunikují?

• vnímání okolního prostředí (nutrienty, toxiny, světlo, atd.)

• vnímání vnitřního prostředí

• udržování homeostáze mnohobuněčného organismu

Principy buněčné komunikace

• produkce signální molekuly (ligandu) signalizující buňkou

• předání signálu cílové buňce prostřednictvím receptoru

• aktivace signálních přenašečů uvnitř buňky – přenos k efektorům

• převádění jedné formy signálu na druhou = transdukce signálu

• efektory zajistí buněčnou odpověď

Klíčoví hráči signalizace

• Signální molekuly

  • hydrophobní

  • hydrofilní

• Receptory

  • membránové

  • cytosolické

• Přenašeče signalizace + druzí posli

• Efektorové proteiny

• Efekt

  • rychlý (modifikace proteinů)

  • pomalý (modifikace genové exprese)

Produkce signálu

• využití vezikulárního transportu a exocytózy

Dosah signálů

• Endokrinní signalizace

  • typicky - hormon uvolněný buňkami žlázy

  • sekretovaná molekula má dosah v celém těle

  • odpovídají jen buňky s příslušným receptorem

  • využívá krevního oběhu živočicha nebo mízy rostliny

• Parakrinní signalizace

  • působení signální molekuly v blízkých/přilehlých buňkách

  • transport difuzí extracelulárním prostředím

  • např. neurotransmitery mezi neurony a svalovými buňkami

  • růstové faktory – tvorba gradientu – rozdílný efekt v závislosti na koncentraci

• Signály nervové soustavy

  • Působí na velké vzdálenosti (m)

  • Směr signálu dán nervovým nebo svalovým vláknem

  • Elektrické impulsy (změna membránového potenciálu) se na synapsích mění na parakrinní signalizaci mediátory

• Autokrinní signalizace

  • odpověď buňky na vlastní signál

  • obvykle růstové faktory

  • např. buňky in vitro nebo nádorové buňky

• Signalizace přímým mezibuněčným kontaktem

  • mezi membránovými proteiny dvou buněk

  • receptor – ligand

  • proteolytické štěpení membránového proteinu -> uvolněné extracelulární části jako solubilního ligandu

• Propojení cytosolů buněk

  • přímá výměna molekul mezi buňkami

  • gap junctions (konexiny) – u živočišných buněk (max. 1kDa)

  • plasmodesmata u rostlinných buněk

Reakce buňky na aktivovaný receptor

• specifická odpověď

• aktivace nitrobuněčných přenašečů (signální dráhy)

• ovlivnění efektoru

  • genové exprese

  • aktivity metabolických enzymů

  • konfigurace cytoskeletu

• změna chování buněk

  • aktivace syntézy DNA

  • pohyb

  • diferenciace

  • smrt

Buňka odpovídá jen na omezený počet signálů

• citlivost je dána přítomností receptorů

• z velkého množství exprimuje každá buňka jen některé

• kombinace signálů – rozdílný efekt

Jeden signál - rozdílné účinky

Acetylcholin

• tlumící účinek na b. srdečního svalstva

• stimulace kontrakce b. kosterního svalstva

• stimulace žlázových buněk k sekreci

• Vysvětlení:

  • různé typy receptorů pro stejný signál

  • odlišná interpretace stejného signálu různými buňkami (odlišnost přenašečů, efektorů, apod.)

Přenos signálu uvnitř buňky

Transdukce a amplifikace signálu

• signální dráha – kombinace signálních proteinů

• přenos signálu z receptoru k efektoru

• každý stupeň transdukce může amplifikovat signál

• vznik amplifikační kaskády

• rozdělení signálu k různým efektorům

• aktivace/inhibice velkého množství cílového proteinu

Amplifikace signálu

• jedna signální molekula aktivuje jediný receptor

• jediný aktivovaný receptor aktivuje větší počet přenašečů

• každý přenašeč může zajistit odezvu

Výsledek:

• nízká koncentrace ligandu – významná odpověď uvnitř buňky – schopnost reakce na malé změny okolí

Např:

• adrenalin (epinefrin) - velmi nízká koncentrace v krvi

• celkem: 10∧8 x zesílení signálu -> produkce glukózy z glykogenu

Signální kaskády využívají přenašeče

• proteiny-přenašeče přepínají mezi polohami „zapnuto“ a “vypnuto“

• podstata přepnutí: obvykle připojení nebo odpojení zbytku kyseliny fosforečné nebo GTP/GDP

• signál převádí stav přenašeče z neaktivního do aktivního stavu

Molekulové přepínače: fosforylace

• proteinkináza, katalyzuje kovalentní připojení fosfátu k proteinu

• proteinfosfatáza, katalyzuje odstranění fosfátu

• regulační kináza/fosfatáza je často sama podrobena kontrole fosforylací jinou kinázou: vznikají fosforylační kaskády

Molekulové přepínače: vazba GTP

• týká se G-proteinů

• vazba GTP (guanozintrifosfátu) – zapnuto – přímou interakcí s receptorem nebo proteiny GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor)

• vazba GDP (guanozindifosfátu) – vypnuto pomocí proteinů GAP (GTPase-Activating Protein)

• přepnutí reflektuje stav receptoru

Průchodnost membrány pro ligandy

• rozhoduje velikost a chemická povaha signální molekuly

• velké a hydrofilní molekuly nemohou membránou projít - aktivují povrchové receptory

• malá a hydrofobní molekuly difundují membránou a vážou se na nitrobuněčné receptory

Steroidní a thyroidní hormony, retinoidy a vitamín D

• hydrofobní a nízkomolekulární

• procházejí membránou

• vážou se na receptory v cytosolu nebo jádře

• jejich receptory fungují jako regulátory genové exprese závislé na ligandech

• vazba ligandu - změna konformace receptoru - změna schopnosti vazby DNA nebo aktivace exprese cílových genů

Oxid dusnatý (NO)

• prochází plazmatickou membránou a přímo aktivuje cílové enzymy

• nemění genovou expresi – rychlejší odezva

• snadno difunduje z buněk produkčních do buněk cílových

• působí lokálně a existuje jen krátkodobě (reakcí s vodou a kyslíkem se mění na dusičnany a dusitany)

• v buňkách obvykle aktivuje guanylátcyklázu, která katalyzuje tvorbu cyklického GMP

• cGMP aktivuje různé efektory

• vzniká z argininu, např. u endoteliálních buněk, které vystýlají cévy

• nervové buňky vyšlou signál - endoteliální buňky produkují NO, který uvolní buňky hladkého svalstva cévních stěn – céva se roztáhne – krev v ní může lépe proudit

Nitroglycerin

• nitroglycerin se v těle mění na NO

• využití v medicíně: při infarktu nebo angině pectoris

• uvolňuje krevní cévy a snižuje zátěž srdce

Hlavní typy povrchových receptorů

• receptory spřažené s iontovými kanály (ion-channel-coupled receptors)

  • bez enzymové aktivity

  • vazbou ligandu ovlivňují průchodnost membránových kanálků

  • změna permeability - změna toku iontů

• receptory spřažené s G-proteinem (G-protein-coupled receptors)

  • bez enzymové aktivity

  • řídí aktivitu enzymů nebo průchodnost kanálků prostřednictvím membránového proteinu G („GTP-binding regulatory protein“)

• receptory spřažené s enzymy (enzyme-coupled receptors)

  • vazbou ligandu získávají katalytickou schopnost

  • obvykle transmembránové proteiny s proteinkinázovou aktivitou

Hlavní typy povrchových receptorů

Signální ligandy

• často ovlivňují fyziologii a pocity organismu

• molekuly exogenní látek (léky, tišící prostředky, drogy, …) často napodobují přirozený ligand a se vážou na receptor a blokují (antagonisté) nebo nadměrně stimulují (agonisté) jeho aktivitu

Převod chemických signálů na elektrické

• zajišťují receptory spřažené s iontovými kanálky

• synapse v nervosvalovém systému

• chemický signál (nervový mediátor) se převádí na elektrický signál v podobě změny permeability plazmatické membrány cílové buňky

Receptory spřažené s G-proteinem

• početná rodina, stovky členů

• zprostředkovávají odpovědi na rozmanité podněty (např. hormony, lokální mediátory, nervové mediátory)

• charakteristická struktura: jediný polypeptidový řetězec procházející dvojvrstvou membrány 7x

• evoluční konzervativnost: u obratlovců (fotoreceptorový protein sítnice rhodopsin, čichové receptory), u kvasinek, atd.

• nitrobuněčná doména pro vazbu G-proteinu

Struktura velkých G-proteinů

• několik variant, každá je specifická pro určitý okruh receptorů a následných přenašečů signálu

• hlavní struktura je obdobná u všech:

  • 3 proteinové podjednotky: α, β, γ

  • klidový stav: všechny podjednotky pohromadě, k α-podjednotce navázán GDP

Spojení receptorů s G-proteiny

• G-protein je umístěn na cytosolové straně membrány

• vazba ligandu konformační změna receptoru – interakce s G-proteinem

• aktivace G-proteinu (vazba GTP místo GDP)

Struktura aktivovaných G-proteinů

• po stimulaci receptoru ligandem: interakce receptoru s G-proteinem

  • záměna GDP za GTP na podjednotce α

• Rozdělení G-proteinu na podjednotku α s navázaným GTP a na komplex podjednotek βγ

• obě části mohou samostatně difundovat membránou, interagovat s cílovými molekulami a předávat jim signál

Aktivita G-proteinů je dočasná

• podjednotka α má vnitřní GTPázovou aktivitu, která po určité době (několika sekund) hydrolyzuje GTP na GDP

• podjednotka α pak obnoví spojení s podjednotkami βγ

• signalizace je vypnuta

Cíle G-proteinů

• iontové kanály

• membránové enzymy zodpovědné za tvorbu sekundárních přenašečů

Vliv G-proteinů na iontové kanály

• např. regulace činnosti srdce:

  • nervová vlákna uvolňují acetylcholin, který se váže na receptor v buňkách srdečního svalu

  • aktivace G-proteinu

  • komplex podjednotek βγ se váže ke kanálku pro K+ v membráně buněk srdečního svalu a otevře jej

  • změna elektrických vlastností svalové buňky – omezení frekvence stahů/relaxace

Vliv G-proteinů na membránové enzymy

• komplexnější důsledky – tvorba dalších nitrobuněčných signálů

• nejčastější cílové enzymy:

  • adenylátcykláza (tvorba cAMP)

  • fosfolipáza C (tvorba inositoltrifosfátu a diacylglycerolu)

  • V obou případech je aktivace receptoru spřažena s tvorbou malých signálních molekul, které rychle a ve velkém počtu vznikají a snadno difundují cytosolem k efektorům

Hladina cAMP

• inducibilní adenylátcykláza katalyzuje tvorbu cAMP z ATP

• cAMP-fosfodiesteráza je konstitutivní - štěpí cAMP na AMP

• hladina cAMP může během sekund vzrůst nebo poklesnout 10x

• adenylátcykláza je pod kontrolou G-proteinu

• účinek může být stimulační nebo inhibiční – dáno typem G-proteinu

Význam cAMP

• cAMP je rozpustný ve vodě, snadno difunduje buňkou

• aktivuje efektory: např. cAMP-dependentní proteinkinázu A

• kináza A fosforyluje různé substráty a mění tak jejich aktivitu (např. regulátory genové exprese)

cAMP se účastní stresové signalizace

• stres: v nadledvinách se uvolní adrenalin a přejde do krve

• váže se na receptory spřažené s G-proteinem (adrenergní receptory) různých buněk

• v kosterním svalstvu: stimulace adenylátcyklázy – navýšení cAMP

• cAMP aktivuje kinázu A, která fosforyluje enzymy metabolismu glykogenu

• aktivuje se mechanismus odbourávání glykogenu na glukózu

• zajištění dostatečného množství glukózy pro očekávanou svalovou námahu

• signalizace nevede ke změně genové exprese – je relativně rychlá

Rychlá a pomalá signalizace cAMP

Pomalá odpověď na cAMP

• odezva během minut až hodin

• cAMP aktivuje kinázu A

• kináza A fosforyluje proteiny řídící transkripci určitých genů

• nově exprimované geny zajistí změnu chování buňky

G proteiny mohou aktivovat fosfolipázu C

• fosfolipáza C působí na membránový inositolový fosfolipid: odštěpí hydrofilní hlavičku: vzniká cukerný inositoltrifosfát (IP3) a lipidový diacylglycerol (DAG)

• IP3 difunduje cytosolem k ER: otevře kanály v membráně ER, kterými proudí Ca2+ do cytosolu

• Ca2+ stejně jako diacylglycerol aktivuje proteinkinázu C

• kináza C fosforyluje své substráty

Rozložení iontů Ca2+ není rovnoměrné

• Koncentrace Ca2+ v cytosolu je výrazně nižší než v mimobuněčném prostoru a endoplazmatickém retikulu

• gradient je udržován membránovými pumpami

• když signál přechodně otevře kanálky, ionty Ca2+ rychle proudí do cytosolu a aktivují zde proteiny, které jsou na Ca2+ citlivé

• mezi hlavní proteiny citlivé na Ca2+ patří kalmodulin

Kalmodulin

• univerzálně rozšířen

• po navázání 4 iontů Ca2+ mění konformaci

• nový tvar umožňuje vazbu k mnoha proteinům, čímž se mění jejich aktivita

• hlavní cílem kalmodulinu jsou CaM kinázy (Ca2+/calmodulin dependent kinases) – fosforylují transkripční faktory

Receptory spojené s enzymy

• často zajišťují odpovědi buněk na růstové faktory

• ligandem aktivované receptory získávají katalytickou schopnost

• abnormální signalizace z těchto receptorů často souvisí s poruchami proliferace, diferenciace, životaschopnosti, migrace buněk (nádorová transformace)

Receptory spojené s enzymy - struktura

• jeden transmembránový úsek

• doména vázající ligandy směřuje ven z buňky

• cytoplazmatická doména má enzymovou aktivitu buď sama o sobě a nebo tvoří s enzymem komplex

• enzymová aktivita má proteinkinázovou povahu

Receptorové kinázy - aktivace

• vazba ligandu

• ligand-dependentní dimerizace receptorů

• kontakt sousedních receptorů aktivuje jejich kinázovou aktivitu – dojde k vzájemné fosforylaci

• fosforylované tyroziny spolu se sousedními aminokyselinami slouží jako místo vazby nitrobuněčných signálních proteinů

Receptorové kinázy: aktivace Ras

• aktivované receptory prostřednictvím adaptérů aktivují tzv. malé (jednopodjednotkové) G-proteiny (Ras)

• odtud se signál šíří dále do nitra buňky

Protein Ras

• ukotven na cytoplazmatické straně plazmatické membrány

• člen rodiny malých G-proteinů s jedinou podjednotkou

• funguje jako molekulový přepínač se dvěma konformačními stavy: aktivním s navázaným GTP a neaktivním s navázaným GDP

• aktivuje kinázovou signální kaskádu zajišťující změnu genové exprese, která buňku přivádí k aktivní proliferaci

• poruchy Ras (hyperaktivace) jsou běžné při tvorbě nádorů

• dědičné poruchy = Rasopatie

Fosforylační kaskáda aktivovaná Ras

• postupná fosforylace/aktivace sledu proteinkináz MAP

• signál postupuje od membrány k jádru, zesiluje se a rozděluje do různých směrů

• cílové efektory:

  • proteiny, které změní aktivitu

  • transkripční faktory, které změní spektrum exprimovaných genů

• výsledkem je změna chování buněk obvykle v úrovni jejich proliferace nebo diferenciace

Ras je klíčový regulátor proliferace

• např. intracelulární injekce protilátek anti-Ras: ztráta schopnosti receptoru aktivovat buněčnou odpověď na příslušný růstový faktor

• mutace zvyšující aktivitu Ras: buňka reaguje stejně, jakoby byla neustále stimulována růstovým faktorem

• mutace v genech ras identifikovány v cca 30 % případů rakoviny

Integrace signálů v buňkách

• signální dráhy spolu interagují

• výměna informací mezi drahami

• integračními prvky jsou především kinázy, které fosforylují složky alternativních drah

Mechanismy integrace signálu

• spojení informací z různých zdrojů je podmínkou řádného vyhodnocení situace a zajištění správné odpovědi

• některé proteiny slouží jako spojnice toku informací různých drah

• např. mají několik míst, která mohou být fosforylována různými kinázami

• nebo aktivní protein vzniká z podjednotek pouze tehdy, jsou-li obě fosforylovány.

SH2