Proč buňky komunikují?
vnímání okolního prostředí (nutrienty, toxiny, světlo, atd.)
vnímání vnitřního prostředí
udržování homeostáze mnohobuněčného organismu
Principy buněčné komunikace
produkce signální molekuly (ligandu) signalizující buňkou
předání signálu cílové buňce prostřednictvím receptoru
aktivace signálních přenašečů uvnitř buňky – přenos k efektorům
převádění jedné formy signálu na druhou = transdukce signálu
efektory zajistí buněčnou odpověď
Klíčoví hráči signalizace
Signální molekuly
hydrophobní
hydrofilní
Receptory
membránové
cytosolické
Přenašeče signalizace + druzí posli
Efektorové proteiny
Efekt
rychlý (modifikace proteinů)
pomalý (modifikace genové exprese)
Produkce signálu
využití vezikulárního transportu a exocytózy
Dosah signálů
Endokrinní signalizace
typicky - hormon uvolněný buňkami žlázy
sekretovaná molekula má dosah v celém těle
odpovídají jen buňky s příslušným receptorem
využívá krevního oběhu živočicha nebo mízy rostliny
Parakrinní signalizace
působení signální molekuly v blízkých/přilehlých buňkách
transport difuzí extracelulárním prostředím
např. neurotransmitery mezi neurony a svalovými buňkami
růstové faktory – tvorba gradientu – rozdílný efekt v závislosti na koncentraci
Signály nervové soustavy
Působí na velké vzdálenosti (m)
Směr signálu dán nervovým nebo svalovým vláknem
Elektrické impulsy (změna membránového potenciálu) se na synapsích mění na parakrinní signalizaci mediátory
Autokrinní signalizace
odpověď buňky na vlastní signál
obvykle růstové faktory
např. buňky in vitro nebo nádorové buňky
Signalizace přímým mezibuněčným kontaktem
mezi membránovými proteiny dvou buněk
receptor – ligand
proteolytické štěpení membránového proteinu -> uvolněné extracelulární části jako solubilního ligandu
Propojení cytosolů buněk
přímá výměna molekul mezi buňkami
gap junctions (konexiny) – u živočišných buněk (max. 1kDa)
plasmodesmata u rostlinných buněk
Reakce buňky na aktivovaný receptor
specifická odpověď
aktivace nitrobuněčných přenašečů (signální dráhy)
ovlivnění efektoru
genové exprese
aktivity metabolických enzymů
konfigurace cytoskeletu
změna chování buněk
aktivace syntézy DNA
pohyb
diferenciace
smrt
Buňka odpovídá jen na omezený počet signálů
citlivost je dána přítomností receptorů
z velkého množství exprimuje každá buňka jen některé
kombinace signálů – rozdílný efekt
Jeden signál - rozdílné účinky
Acetylcholin
tlumící účinek na b. srdečního svalstva
stimulace kontrakce b. kosterního svalstva
stimulace žlázových buněk k sekreci
Vysvětlení:
různé typy receptorů pro stejný signál
odlišná interpretace stejného signálu různými buňkami (odlišnost přenašečů, efektorů, apod.)
Přenos signálu uvnitř buňky
Transdukce a amplifikace signálu
signální dráha – kombinace signálních proteinů
přenos signálu z receptoru k efektoru
každý stupeň transdukce může amplifikovat signál
vznik amplifikační kaskády
rozdělení signálu k různým efektorům
aktivace/inhibice velkého množství cílového proteinu
Amplifikace signálu
jedna signální molekula aktivuje jediný receptor
jediný aktivovaný receptor aktivuje větší počet přenašečů
každý přenašeč může zajistit odezvu
Výsledek:
nízká koncentrace ligandu – významná odpověď uvnitř buňky – schopnost reakce na malé změny okolí
Např:
adrenalin (epinefrin) - velmi nízká koncentrace v krvi
celkem: 10∧8 x zesílení signálu -> produkce glukózy z glykogenu
Signální kaskády využívají přenašeče
proteiny-přenašeče přepínají mezi polohami „zapnuto“ a “vypnuto“
podstata přepnutí: obvykle připojení nebo odpojení zbytku kyseliny fosforečné nebo GTP/GDP
signál převádí stav přenašeče z neaktivního do aktivního stavu
Molekulové přepínače: fosforylace
proteinkináza, katalyzuje kovalentní připojení fosfátu k proteinu
proteinfosfatáza, katalyzuje odstranění fosfátu
regulační kináza/fosfatáza je často sama podrobena kontrole fosforylací jinou kinázou: vznikají fosforylační kaskády
Molekulové přepínače: vazba GTP
týká se G-proteinů
vazba GTP (guanozintrifosfátu) – zapnuto – přímou interakcí s receptorem nebo proteiny GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor)
vazba GDP (guanozindifosfátu) – vypnuto pomocí proteinů GAP (GTPase-Activating Protein)
přepnutí reflektuje stav receptoru
Průchodnost membrány pro ligandy
rozhoduje velikost a chemická povaha signální molekuly
velké a hydrofilní molekuly nemohou membránou projít - aktivují povrchové receptory
malá a hydrofobní molekuly difundují membránou a vážou se na nitrobuněčné receptory
Steroidní a thyroidní hormony, retinoidy a vitamín D
hydrofobní a nízkomolekulární
procházejí membránou
vážou se na receptory v cytosolu nebo jádře
jejich receptory fungují jako regulátory genové exprese závislé na ligandech
vazba ligandu - změna konformace receptoru - změna schopnosti vazby DNA nebo aktivace exprese cílových genů
Oxid dusnatý (NO)
prochází plazmatickou membránou a přímo aktivuje cílové enzymy
nemění genovou expresi – rychlejší odezva
snadno difunduje z buněk produkčních do buněk cílových
působí lokálně a existuje jen krátkodobě (reakcí s vodou a kyslíkem se mění na dusičnany a dusitany)
v buňkách obvykle aktivuje guanylátcyklázu, která katalyzuje tvorbu cyklického GMP
cGMP aktivuje různé efektory
vzniká z argininu, např. u endoteliálních buněk, které vystýlají cévy
nervové buňky vyšlou signál - endoteliální buňky produkují NO, který uvolní buňky hladkého svalstva cévních stěn – céva se roztáhne – krev v ní může lépe proudit
Nitroglycerin
nitroglycerin se v těle mění na NO
využití v medicíně: při infarktu nebo angině pectoris
uvolňuje krevní cévy a snižuje zátěž srdce
Hlavní typy povrchových receptorů
receptory spřažené s iontovými kanály (ion-channel-coupled receptors)
bez enzymové aktivity
vazbou ligandu ovlivňují průchodnost membránových kanálků
změna permeability - změna toku iontů
receptory spřažené s G-proteinem (G-protein-coupled receptors)
bez enzymové aktivity
řídí aktivitu enzymů nebo průchodnost kanálků prostřednictvím membránového proteinu G („GTP-binding regulatory protein“)
receptory spřažené s enzymy (enzyme-coupled receptors)
vazbou ligandu získávají katalytickou schopnost
obvykle transmembránové proteiny s proteinkinázovou aktivitou
Hlavní typy povrchových receptorů
Signální ligandy
často ovlivňují fyziologii a pocity organismu
molekuly exogenní látek (léky, tišící prostředky, drogy, …) často napodobují přirozený ligand a se vážou na receptor a blokují (antagonisté) nebo nadměrně stimulují (agonisté) jeho aktivitu
Převod chemických signálů na elektrické
zajišťují receptory spřažené s iontovými kanálky
synapse v nervosvalovém systému
chemický signál (nervový mediátor) se převádí na elektrický signál v podobě změny permeability plazmatické membrány cílové buňky
Receptory spřažené s G-proteinem
početná rodina, stovky členů
zprostředkovávají odpovědi na rozmanité podněty (např. hormony, lokální mediátory, nervové mediátory)
charakteristická struktura: jediný polypeptidový řetězec procházející dvojvrstvou membrány 7x
evoluční konzervativnost: u obratlovců (fotoreceptorový protein sítnice rhodopsin, čichové receptory), u kvasinek, atd.
nitrobuněčná doména pro vazbu G-proteinu
Struktura velkých G-proteinů
několik variant, každá je specifická pro určitý okruh receptorů a následných přenašečů signálu
hlavní struktura je obdobná u všech:
3 proteinové podjednotky: α, β, γ
klidový stav: všechny podjednotky pohromadě, k α-podjednotce navázán GDP
Spojení receptorů s G-proteiny
G-protein je umístěn na cytosolové straně membrány
vazba ligandu konformační změna receptoru – interakce s G-proteinem
aktivace G-proteinu (vazba GTP místo GDP)
Struktura aktivovaných G-proteinů
po stimulaci receptoru ligandem: interakce receptoru s G-proteinem
záměna GDP za GTP na podjednotce α
Rozdělení G-proteinu na podjednotku α s navázaným GTP a na komplex podjednotek βγ
obě části mohou samostatně difundovat membránou, interagovat s cílovými molekulami a předávat jim signál
Aktivita G-proteinů je dočasná
podjednotka α má vnitřní GTPázovou aktivitu, která po určité době (několika sekund) hydrolyzuje GTP na GDP
podjednotka α pak obnoví spojení s podjednotkami βγ
signalizace je vypnuta
Cíle G-proteinů
iontové kanály
membránové enzymy zodpovědné za tvorbu sekundárních přenašečů
Vliv G-proteinů na iontové kanály
např. regulace činnosti srdce:
nervová vlákna uvolňují acetylcholin, který se váže na receptor v buňkách srdečního svalu
aktivace G-proteinu
komplex podjednotek βγ se váže ke kanálku pro K+ v membráně buněk srdečního svalu a otevře jej
změna elektrických vlastností svalové buňky – omezení frekvence stahů/relaxace
Vliv G-proteinů na membránové enzymy
komplexnější důsledky – tvorba dalších nitrobuněčných signálů
nejčastější cílové enzymy:
adenylátcykláza (tvorba cAMP)
fosfolipáza C (tvorba inositoltrifosfátu a diacylglycerolu)
V obou případech je aktivace receptoru spřažena s tvorbou malých signálních molekul, které rychle a ve velkém počtu vznikají a snadno difundují cytosolem k efektorům
Hladina cAMP
inducibilní adenylátcykláza katalyzuje tvorbu cAMP z ATP
cAMP-fosfodiesteráza je konstitutivní - štěpí cAMP na AMP
hladina cAMP může během sekund vzrůst nebo poklesnout 10x
adenylátcykláza je pod kontrolou G-proteinu
účinek může být stimulační nebo inhibiční – dáno typem G-proteinu
Význam cAMP
cAMP je rozpustný ve vodě, snadno difunduje buňkou
aktivuje efektory: např. cAMP-dependentní proteinkinázu A
kináza A fosforyluje různé substráty a mění tak jejich aktivitu (např. regulátory genové exprese)
cAMP se účastní stresové signalizace
stres: v nadledvinách se uvolní adrenalin a přejde do krve
váže se na receptory spřažené s G-proteinem (adrenergní receptory) různých buněk
v kosterním svalstvu: stimulace adenylátcyklázy – navýšení cAMP
cAMP aktivuje kinázu A, která fosforyluje enzymy metabolismu glykogenu
aktivuje se mechanismus odbourávání glykogenu na glukózu
zajištění dostatečného množství glukózy pro očekávanou svalovou námahu
signalizace nevede ke změně genové exprese – je relativně rychlá
Rychlá a pomalá signalizace cAMP
Pomalá odpověď na cAMP
odezva během minut až hodin
cAMP aktivuje kinázu A
kináza A fosforyluje proteiny řídící transkripci určitých genů
nově exprimované geny zajistí změnu chování buňky
G proteiny mohou aktivovat fosfolipázu C
fosfolipáza C působí na membránový inositolový fosfolipid: odštěpí hydrofilní hlavičku: vzniká cukerný inositoltrifosfát (IP3) a lipidový diacylglycerol (DAG)
IP3 difunduje cytosolem k ER: otevře kanály v membráně ER, kterými proudí Ca2+ do cytosolu
Ca2+ stejně jako diacylglycerol aktivuje proteinkinázu C
kináza C fosforyluje své substráty
Rozložení iontů Ca2+ není rovnoměrné
Koncentrace Ca2+ v cytosolu je výrazně nižší než v mimobuněčném prostoru a endoplazmatickém retikulu
gradient je udržován membránovými pumpami
když signál přechodně otevře kanálky, ionty Ca2+ rychle proudí do cytosolu a aktivují zde proteiny, které jsou na Ca2+ citlivé
mezi hlavní proteiny citlivé na Ca2+ patří kalmodulin
Kalmodulin
univerzálně rozšířen
po navázání 4 iontů Ca2+ mění konformaci
nový tvar umožňuje vazbu k mnoha proteinům, čímž se mění jejich aktivita
hlavní cílem kalmodulinu jsou CaM kinázy (Ca2+/calmodulin dependent kinases) – fosforylují transkripční faktory
Receptory spojené s enzymy
často zajišťují odpovědi buněk na růstové faktory
ligandem aktivované receptory získávají katalytickou schopnost
abnormální signalizace z těchto receptorů často souvisí s poruchami proliferace, diferenciace, životaschopnosti, migrace buněk (nádorová transformace)
Receptory spojené s enzymy - struktura
jeden transmembránový úsek
doména vázající ligandy směřuje ven z buňky
cytoplazmatická doména má enzymovou aktivitu buď sama o sobě a nebo tvoří s enzymem komplex
enzymová aktivita má proteinkinázovou povahu
Receptorové kinázy - aktivace
vazba ligandu
ligand-dependentní dimerizace receptorů
kontakt sousedních receptorů aktivuje jejich kinázovou aktivitu – dojde k vzájemné fosforylaci
fosforylované tyroziny spolu se sousedními aminokyselinami slouží jako místo vazby nitrobuněčných signálních proteinů
Receptorové kinázy: aktivace Ras
aktivované receptory prostřednictvím adaptérů aktivují tzv. malé (jednopodjednotkové) G-proteiny (Ras)
odtud se signál šíří dále do nitra buňky
Protein Ras
ukotven na cytoplazmatické straně plazmatické membrány
člen rodiny malých G-proteinů s jedinou podjednotkou
funguje jako molekulový přepínač se dvěma konformačními stavy: aktivním s navázaným GTP a neaktivním s navázaným GDP
aktivuje kinázovou signální kaskádu zajišťující změnu genové exprese, která buňku přivádí k aktivní proliferaci
poruchy Ras (hyperaktivace) jsou běžné při tvorbě nádorů
dědičné poruchy = Rasopatie
Fosforylační kaskáda aktivovaná Ras
postupná fosforylace/aktivace sledu proteinkináz MAP
signál postupuje od membrány k jádru, zesiluje se a rozděluje do různých směrů
cílové efektory:
proteiny, které změní aktivitu
transkripční faktory, které změní spektrum exprimovaných genů
výsledkem je změna chování buněk obvykle v úrovni jejich proliferace nebo diferenciace
Ras je klíčový regulátor proliferace
např. intracelulární injekce protilátek anti-Ras: ztráta schopnosti receptoru aktivovat buněčnou odpověď na příslušný růstový faktor
mutace zvyšující aktivitu Ras: buňka reaguje stejně, jakoby byla neustále stimulována růstovým faktorem
mutace v genech ras identifikovány v cca 30 % případů rakoviny
Integrace signálů v buňkách
signální dráhy spolu interagují
výměna informací mezi drahami
integračními prvky jsou především kinázy, které fosforylují složky alternativních drah
Mechanismy integrace signálu
spojení informací z různých zdrojů je podmínkou řádného vyhodnocení situace a zajištění správné odpovědi
některé proteiny slouží jako spojnice toku informací různých drah
např. mají několik míst, která mohou být fosforylována různými kinázami
nebo aktivní protein vzniká z podjednotek pouze tehdy, jsou-li obě fosforylovány.
SH2