7) buněčný cyklus

„Každá buňka je z buňky“ Rudolf Virchow (1821-1902)

• kde existuje buňka, musí existovat předchozí buňka, která jí umožnila vzniknout, podobně jako živočich vzniká pouze z jiného živočicha a rostlina z jiné rostliny

• Omnis cellula e cellula

• buněčný pohled aplikoval na patologické stavy:

  • „nemoci jsou důsledkem poruch buněk“

Co je buněčný cyklus?

• uspořádaný sled událostí, při kterých buňka zdvojí svůj obsah a následně se rozdělí

• Klíčové procesy:

  • vytváření nových strukturních složek

  • jejich doprava na správná místa

  • rozdělení do dceřiných buněk

• Cíl: uspořádání buněčných procesů do logického sledu pro úspěšnou replikaci genomu, syntézu nezbytných makromolekul a organel, a jejich správnou segregaci za vzniku funkčních dceřiných buněk

• Kontrolní systém zajišťuje vysokou přesnost

Cyklus u jednobuněčných organismů

• sladění buněčného dělení s růstem (udržování správné velikosti buněk)

Cyklus u mnohobuněčných organismů

• sladění buněčného dělení s vývojem tkáně/organismu

• udržování homeostáze u dospělých organismů

• buňky se dělí jen tehdy, je-li to potřebné (např. nahrazení odumírajících buněk, hojení poranění)

• vnější i vnitřní signalizace/kontrola

• ztráta kontroly nad buněčným cyklem: nádorové transformace

Růstové faktory a cyklus

Vysoké nároky na přesnost

• správné řazení fází (replikace/mitóza)

• bezchybná replikace DNA

• přesná segregace chromozomů

• koordinace s vývojovými programy, opravnými procesy a vnějším prostředím

Kontrola buněčného cyklu

• specifické proteiny v každé fázi díky proměnlivým expresním profilům

• syntéza proteinů indukujících návaznou fázi

• likvidace nepotřebných proteinů dokončených fází

• logická návaznost fází:

  • mitóza nesmí začít před dokončením replikace DNA (riziko ztráty genetického materiálu)

  • nesmí dojít k opakované replikaci téhož chromozomu v rámci jednoho cyklu (riziko amplifikace a navýšení exprese genů - snížení životaschopnosti)

Historicky:

• cyklus = střídání M fáze / interfáze

• M fáze:

  • jaderné dělení (mitóza) + dělení cytoplazmy (cytokineze)

• dobře pozorovatelná mikroskopií

• interfáze: příprava na fázi M

  • G1- metabolická aktivita, růst buňky, zdvojování organel

  • S - replikace DNA

  • G2- metabolická aktivita, syntéza proteinů potřebných pro vstup do mitózy

Přesnost cyklu

• využívá kontrolních bodů, které znemožňují zahájení následného kroku před dokončením kroku předchozího

• kontrolní body mohou být poškozeny mutacemi - riziko nadměrného růstu/dělení buněk – tvorba nádorů

• systém regulace replikace DNA a segregace chromozomů je u všech eukaryotických buněk totožný

• podobně jako transkripce a translace je i řízení buněčného cyklu optimalizováno v průběhu evoluce a dlouhodobě se udržuje

Principy regulace cyklu

• centrální ovladač aktivuje cyklus a řídí jej v pevně dané posloupnosti fází

• průběh cyklu kontrolován v kritických bodech

  • v případě potřeby může být v nich pozastaven

  • posloupnost fází se nemění i když se některá z nich protáhne

Dva hlavní kontrolní body:

• pozdní G1 a G2

  • pozastavení cyklu před vstupem do fáze S, resp. M

  • kontrola velikosti buňky

  • kontrola dostupnosti živin

  • kontrola celistvosti DNA

Ústřední regulační systém

• cykliny a cyklin-dependentní kinázy (CDK)

• specifické degradační systémy

Cykliny

• proteiny schopné vazby na cyklin-dependentní kinázy

• pozitivní regulátory

• zajišťují správné časování jejich aktivity

• nemají enzymovou aktivitu, ale interakcí s CDK ji aktivují

Cyklin-dependentní kinázy

• fosforylují klíčové regulátory jednotlivých fází

• fyzicky přítomny v průběhu celého cyklu

• aktivují se jen v jeho určité fázi

• aktivita cyklicky stoupá a klesá

Pro každou fázi existují specifické komplexy cyklin-Cdk

• každý z komplexů má za úkol zajistit specifickou fázi cyklu

• fázi M zajišťuje komplex cyklinu B a CDK (MPF)

• cyklin fáze G1 se váže na Cdk a zajišťuje procesy fáze G1, včetně iniciace tvorby cyklinu fáze S

• cyklin fáze S se váže na Cdk a zajišťuje vstup do fáze S

Cykliny a Cdk jsou evolučně konzervativní

• jen nepatrné strukturní odlišnosti u různých organismů

• defektní cyklin nebo Cdk u kvasinek může být nahrazen lidskými variantami těchto proteinů

MPF: Mitosis-promoting factor

• komplex Cdk a cyklinu zodpovědný za vstup buněk do M-fáze

Objev MPF

• mikroinjekce cytoplazmy vajíček drápatky ve fázi M do interfázových oocytů

• M-fázová cytoplazma (nikoliv interfázová kontrola) indukuje zahájení mitózy oocytů

  • důsledek přítomnosti MPF

Funkce MPF

• rozpad jaderné membrány:

  • důsledek fosforylace proteinů jaderné laminy

• tvorba mitotického vřeténka:

  • důsledek fosforylací proteinů asociovaných s mikrotubuly

• kondenzace chromozomů:

  • důsledek fosforylace chromozomových proteinů

• degradace cyklinu B:

  • důsledek fosforylace jednoho z proteinů, který za rozklad cyklinu B zodpovídá

Degradační systémy

• odstraňují nepotřebné proteiny předchozích fází pomocí proteazomu

• zapojují se do regulačních procesů

APC/cyklozom

• APC (anaphase-promoting complex) je ubikvitinligáza, která zajišťuje specifické značení proteinů určených k likvidaci (cyklin B) polyubikvitinovou značkou

• kovalentně připojený polyubikvitinový řetězec nasměruje svůj substrát do proteazomu, kde je enzymaticky rozložen

Značení proteinů ubikvitinem

• kovalentní připojení několika kopií ubikvitinu k lyzinu substrátového proteinu ubikvitinligázou

APC/cyklozom a regulace cyklinu B

• cyklozom zajišťuje pokles hladiny cyklinu B tím, že zprostředkovává jeho proteazomovou degradaci

Aktivita Cdk je regulována také fosforylací/defosforylací

• koncentrace cyklinu narůstá postupně, zatímco MPF se aktivuje náhle na konci interfáze

• přítomnost cyklinu není jedinou podmínkou aktivace Cdk

  • aktivační fosforylace určité aminokyseliny Cdk

  • aktivační defosforylace jiné - odstranění inhibičního fosfátu

• aktivní MPF pozitivní zpětnou vazbou posiluje funkci aktivační fosfatázy a inhibuje inhibiční kinázu

Likvidace cyklinů:

• ubikvitin/proteazom

• inaktivace Cdk je důsledkem prudkého poklesu koncentrace cyklinů

• hladina cyklinů klesá po ubikvitinaci a následné degradaci v proteazomu

Proliferaci buněk řídí signály

• u mnohobuněčných:

  • jsou produkovány buňkami téhož organismu

  • zajišťují růst a dělení buňky jen v případě potřeby (vývoj / homeostáze / náhrada tkáně)

• u jednobuněčných:

  • proliferaci určuje jen dostupnost živin

Zastavení buněčného cyklu

• vstup do klidové fáze G0:

  • např. v důsledku absence růstových faktorů (po jejich dodání se cyklus obnoví)

• vstup do postmitotické fáze:

  • týká se vysoce diferencovaných buněk, které se až do své smrti nedělí

Jak růstové faktory stimulují cyklus?

• aktivují receptory a ty signál předají do vnitřního prostředí buňky

• konečným důsledkem je zvýšená exprese proliferačních genů, např. genu pro cyklin D (regulátor CDK fáze G1)

• buňka překonává důležitý kontrolní bod v pozdní fázi G1 (bod restrikce)

• později už průchod cyklem nemůže být z vnějších příčin pozdržen

Jak cyklin D pomáhá překonat bod restrikce?

• spojí se s CDK fáze G1

• komplex cyklin D/CDK4 fosforyluje protein Rb

• nefosforylovaný Rb váže klíčový faktor fáze S – transkripční faktor E2F

• následkem interakce s RB je inaktivace E2F

• fosforylovaný Rb ztrácí schopnost vazby E2F

• aktivovaný E2F zajistí expresi genů S-fáze

Protein Rb

• nádorový supresor

• negativní regulátor buněčného cyklu

• objeven při studiu dětských očních nádorů – retinoblastomů

• jaderný protein, který váže regulační proteiny (např. E2F) a tlumí jejich transaktivační schopnost, čímž znemožní expresi proliferačních genů

• za přítomnosti růstových faktorů se Rb fosforyluje, čímž uvolní E2F a umožní mu zajištění exprese proliferačních genů

Růstové faktory stimulují buněčný cyklus inaktivací Rb

• povrchové receptory - nitrobuněčná signalizace tvorba a aktivace komplexů cyklin-Cdk fáze G1

• fosforylace Rb

• uvolnění regulačních proteinů (E2F)

• transkripce cílových genů E2F

• aktivace cyklu

• proliferace buněk

Růstový faktor PDGF

• růstový faktor krevních destiček (platelet-derived growth factor)

• poranění – srážení krve – krevní destičky uvolňují PDGF

• v místě poranění se PDGF váže na receptorové tyrozinkinázy přeživších buněk a stimuluje jejich buněčný cyklus

• dráha: ligand – receptor – cyklin D – Rb – E2F => zhojení rány

Jak zastavit buněčný cyklus?

• specifickými inhibitory komplexů Cdk/cyklin

• např. poškození DNA:

  • zvýšení koncentrace a aktivity transkripčního faktoru p53

  • p53 stimuluje transkripci genu CDKN1A kódujícího p21

  • protein p21 váže komplex cyklin fáze S/Cdk a inaktivuje jej

  • cyklus se zastaví – oprava DNA

Nádorový supresor p53

• Protein p53 chrání DNA před mutacemi

• transkripční faktor

• pozastavením cyklu umožňuje opravu poškozené DNA

• dokáže indukovat i programovanou smrt buněk s výrazně poškozenou DNA

• nedostatečná funkce p53 – genetická nestabilita

Absence funkčního p53

• nemožnost pozastavení buněčného cyklu

• replikace neopravené DNA

• hromadění mutací

• riziko vzniku nádorů

• Mutace v genu p53 se objevují u více než 50% lidských zhoubných nádorů

Buněčný cyklus a rakovina

• u nádorových buněk bývají mutovány dvě kategorie genů:

  • onkogeny (protoonkogeny u zdravých)

  • nádorové supresory

• ke kancerogenezi přispívá vysoká aktivita onkogenů a nedostatečná aktivita nádorových supresorů

Onkogeny a nádorové supresory

• onkogeny jsou odvozeny z proliferačních genů, tzv. protoonkogenů jejichž produkty napomáhají buněčnému dělení

• mutacemi jsou u nádorových buněk hyperaktivovány

• pro manifestaci poškození postačuje mutace v jedné alele diploidního organismu (dominantní účinek)

• nádorové supresory jsou odvozeny z antiproliferačních genů, jejichž produkty zpomalují buněčný cyklus v kontrolních bodech

• mutacemi jsou u nádorových buněk inaktivovány

• pro manifestaci poškození musí být inaktivovány obě alely diploidního organismu (recesivní účinek)

Jaké jsou funkce onkogenů?

• velmi rozmanité, kódují různé elementy prorůstových signálních drah:

  • růstové faktory

  • receptory

  • přenašeče signálů

  • transkripční faktory

  • nádorotvorné mutace funkce onkogenů posilují

Stárnutí buněk

• i za přítomnosti růstových faktorů je počet dělení buněk omezen

• fibroblasty lidského plodu se mohou dělit cca 80x, pak se dělit přestávají i za pro-proliferačních podmínek

• fibroblasty získané od dospělého člověka se přestávají dělit po menším počtu dělení

• molekulární podstata spočívá v postupném zkracování telomer, tj. koncových částí chromozomů

• nádorové buňky aktivací telomerázy erozi telomer eliminují – jsou nesmrtelné

Buňky HeLa

• odebrány v lednu 1951 ze sliznice děložního čípku Henrietty Lacksové (1920-1951) bez jejího vědomí

• stále plně životaschopné

• celosvětově laboratorně užívané

• testují se na nich nové léky

• nakazila se papilomavirem, který poškodil DNA buněk jejího děložního čípku

• agresivní nádorové buňky se rozšířily do všech tělních orgánů a způsobily smrt

Apoptóza - programovaná buněčná smrt

• signály jsou potřebné nejen pro proliferaci, ale i pro přežití buněk

• absence faktorů pro přežití:

  • aktivace sebedestrukčního programu a zánik buňky programovanou buněčnou smrtí

• tím je zajištěno přežívání buněk jen na správných místech a ve správném čase

• probíhá ve vyvíjejících se i dospělých tkáních

Proč smrt?

• tvarování orgánů v průběhu embryonálního vývoje: např. prsty

• odstraňování nepotřebných tělních struktur: např. přeměna pulce v žábu

• regulace počtu buněk: např. sladění počtu nervových buněk s buňkami cílovými

• u dospělých: vyvažování buněčné proliferace, zabránění nadměrnému růstu tkání

Průběh apoptózy

• spořádaná likvidace buněčných struktur bez zátěže pro okolní buňky

• zmenšení a kondenzace buňky

• fragmentace jaderné DNA

• štěpení proteinů

• změny v pl. membráně

• rozpad na apoptotická tělíska

• fagocytóza

Mechanismus apoptózy

• výkonný aparát zajišťují kaspázy, tj. proteázy, které se aktivují vlastní proteolýzou

• aktivace nastává po přijetí specifických signálů

• každá kaspáza má určité spektrum substrátů, které rozkládá

Selhání apoptózy

• poruchy vývoje

• poruchy homeostáze

• rakovina

Rakovinné buňky

• nereagují na regulační signály

• mutace vyřadí z provozu běžné regulační mechanismy

• buňka proliferuje bez zábran

• selhává apoptóza a regulace buněčného cyklu

• podobné vlastnosti získá potomstvo postižené buňky – vzniká nádor

Shrnutí

• buněčný cyklus zajišťují specifické kinázy, které se v jednotlivých fázích zapínají pomocí cyklinů a fosforylací aktivují takové substráty, které jsou nutné pro tvorbu proteinů dané fáze

• přísná regulace cyklu je důležitým předpokladem homeostáze a ochrany před tvorbou nádorů

• životaschopnost a programovaná smrt buněk jsou rovněž předmětem důsledné regulace

• onkogeny a nádorové supresory rozhodují o rychlosti, s jakou buňky proliferují a jejich nedostatečná funkce může ohrozit život mnohobuněčného organismu