Telomere, Transkription und Bakteriengenetik

Lecture 5: Telomeres, Telomerase, RNA Transcription, and Transcriptional Gene Regulation in Eukaryotes

Telomere Replication Problem

• Issue with Chromosome Ends:
    - During the synthesis of the "Lagging Strand," the outermost end of chromosomes cannot be replicated.
    - The last primer or Okazaki fragment results in an incompletely synthesized "Lagging Strand."
    - Consequence: With every replication round, chromosomes would shorten from both ends.

• Visual Aid:
    - Figure illustrating the phenomenon, modified from "Molecular Biology of the Gene" by Watson et al.

mRNA Maturation

• Recruitment of RNA-processing Enzymes:
    - RNA polymerase II (RNA Pol II) possesses a C-terminal domain which binds various RNA-processing enzymes during elongation, guiding them to the RNA.
      - Important processes include:
        - Capping
        - Splicing
        - Polyadenylation

Capping of mRNA

• 5'-End Capping Process:
    - Removal of 5'-γ-Phosphate and Nucleophilic Attack:
      - The 5'-β-phosphate from GTP undergoes nucleophilic attack by the 5'-α-phosphate, leading to a 5'-5'-linkage via phosphate residues.
      - Methylation of Guanine:
        - Final cap structure is m7-G-ppp.

Polyadenylation of RNA

• Process Following Transcription:
    - Polyadenylation Signal: The sequence AAUAAA recruits proteins CPSF and CstF to the RNA, leading to the recruitment of an endonuclease that cleaves the RNA approximately 30 nucleotides downstream.
    - Poly-A Polymerase Action:
      - Poly-A polymerase is directed to the 3' end, where it adds 50 to 300 adenine nucleotides to the RNA's 3' end without a template.

Genomic DNA vs. mRNA Non-Collinearity

• Hybridization Observations:
    - Electron microscopy shows hybridization between genomic DNA and mRNA of the ovalbumin gene.
    - Graphic Representation:
      - mRNA in red; DNA in blue, illustrating genomic DNA containing seven introns (loops) and eight exons.
    - Introns and Exons: Eukaryotic genes often consist of non-coding sequences (introns), which are spliced from the primary transcript.

Differential Splicing

• Definition and Importance:
    - The same primary transcript may undergo differential splicing in various cells, leading to distinct transcripts of the same gene, resulting in the production of different proteins.
    - Example: Troponin T gene illustrating the concept.   - Terminology: Differential splicing is synonymous with alternative splicing.

Levels of Gene Regulation

• Multilayered Control:
    - There is temporal and spatial control over the amount and activity of a gene product (protein) at several levels:
      - Transcription
      - Stability/Degradation/Transport of mRNA
      - Translation
      - Posttranslational Modification of Proteins
      - Stability/Degradation/Transport of Proteins

Post-Transcriptional Gene Regulation

• Key Mechanisms:
    - Includes alternative splicing, mRNA transport, and mRNA stability control or degradation, which can occur at various stages.

RNA Interference (RNAi)

• Mechanism Overview:
    - Double-stranded RNA (dsRNA) is recognized by cells, triggering its degradation, serving as a form of defense against RNA interference.

• Example Organism: C. elegans used to study RNAi effects.

Key Enzymes in RNA Interference

• Roles of Key Enzymes:
    1. DICER:
       - Recognizes dsRNA and cleaves it into small RNA fragments.
    2. Argonaut (RISC):
       - Binds the small RNAs, identifying and cutting homologous mRNAs.
    3. RNA-dependent RNA Polymerase:
       - Produces dsRNA as a mechanism to counteract viruses (specifically double-stranded RNA viruses).

Role of RNA Interference in Gene and Genome Regulation

• Functions:
    - Defense against RNA viruses and pathogenic RNA molecules.
    - Gene regulation via microRNAs in the cytoplasm.
    - Defense against mobile genetic elements, preservation of heterochromatin and centromere integrity, and epigenetic gene regulation in the nucleus.

Generation of siRNA and dsRNA

• Effect on Gene Regulation:
    - siRNA and dsRNA can regulate gene expression and repetitive elements.

MicroRNAs and Gene Regulation

• Post-Transcriptional Role:
    - MicroRNAs are encoded in the genome and share homology with genes.
    - Processing from a hairpin precursor leads to degradation of complementary RNAs and/or translation inhibition.

• Notable Discoveries:
    - Nobel Prize in Physiology or Medicine 2024:
      - Awarded to Victor Ambros and Gary Ruvkun for discoveries of microRNAs and their regulation.       - MicroRNA Example: lin-4, which regulates lin-14 mRNA.

Molecular Genetics - Part 2: Bacterial Genetics

• Mechanisms of Genetic Exchange in Bacteria:
    - Conjugation, Transduction, Transformation.
    - Bacterial Characteristics: Bacteria have a circular chromosome and are haploid, not undergoing meiosis.   - While reproducing asexually through cell growth and division, bacteria can exchange genetic material, drawing parallels to gene recombination in sexual reproduction.

Mechanisms of Genetic Exchange (Genaustausch) in Prokaryotes

• Transformation:
    - Uptake of external DNA from the environment through the cell wall and membrane.   - This process is natural and occurs via uptake of DNA from dead microorganisms, frequently used in laboratories for cloning and molecular biological applications, often utilizing plasmids as vectors.

Conjugation**

• Conceptual Insight:
    - Bacteria possess mechanisms similar to sexual reproduction for gene exchange.   - Notable Experiment: Conducted by Joshua Lederberg and Edward Tatum in 1946 with auxotrophic strains A and B, leading to prototrophy.

Conjugation and Recombination in E. coli

• Historical Recognition:
    - Won Nobel Prize in Physiology or Medicine 1958 recognizes contributions of George Wells Beadle, Edward Lawrie Tatum, and Joshua Lederberg for discoveries relating to genetic recombination in bacteria.

Discovery of Fertility Factor (F)

• William Hayes's Findings (1953):
    - Gene exchange in E. coli occurs unidirectionally; a receptor cell cannot act as a donor cell.
    - Donor cells contain an F-plasmid coding for proteins that form sex pili to interact with recipient cells, establishing a channel.

Mechanism of F-Plasmid Replication

• Rolling Circle Mechanism:
    - F-plasmid replicates via this mechanism, transporting a single strand to the recipient where it will be completed to a double strand.

High Frequency of Recombination (Hfr) Strains

• Integration of F-Plasmid into Chromosome:
    - Occasionally, F-plasmids recombine into the bacterial chromosome, resulting in Hfr strains, which can transfer chromosomal DNA much more efficiently than F+ strains.   - The rare recombinants observed by Lederberg & Tatum were attributed to spontaneous formation of Hfr strains.

Hfr Strains' Chromosomal DNA Transfer

• Chromosomal DNA Transfer:
    - Hfr strains transfer donor chromosomal DNA "left" of the origin (rcr-ori) located on the integrated F-plasmid into a recipient cell.

F-Plasmids Release through Recombination

• Recombination Dynamics:
    - The inserted F-plasmid within Hfr strains is stable but can occasionally be released from the chromosome through recombination.   - Clean excision occurs when recombination happens at the same sequences as insertion.

Formation of F'-Plasmids

• Hybrid Plasmid Formation:
    - Occurs when recombination happens at incorrect loci, resulting in hybrid F'-plasmids containing portions of chromosomal DNA.
    - Transfer of F'-plasmids may lead to partially diploid (merodiploid) bacterial cells.

Other DNA-Transferring Plasmids

• R-Plasmids:
    - Confers resistance against antibiotics or toxins, typically found on transposons.

• Col-Plasmids:
    - Codes for toxins (Colicine) that can kill other bacteria and also provide immunity against its produced toxin.

• Degradative Plasmids:
    - Enable degradation of unusual substances such as toluene or salicylic acid.

• Ti-Plasmids:
    - Found in Agrobacterium tumefaciens, responsible for inducing tumors (galls) in plant tissues for transformation.

Ti-Plasmid Induced Galls

• Agrobacterium tumefaciens:
    - Ubiquitously found soil bacterium that infects plants at wounds leading to gall formation.

Ti-Plasmid Applications in Biotechnology

• Cloning Utilization:
    - Plasmids can be employed for cloning, involving ori (origin of replication), selection markers, and cloning sites.   - T-DNA from Agrobacterium is utilized for plant transformation, and modified T-DNA vectors encompass ori, selection markers for both bacteria and plants, and T-DNA limits.

Molecular Genetics - Part 3: Bacterial Defense Systems

• Key Elements in Bacterial Defense:
    - Restriction Endonucleases: Enzymes that cut foreign DNA to combat invading viruses.
    - Methyltransferases: Protect bacterial DNA from being cut by their own restriction enzymes.

Restriction Endonucleases Overview

• Function and Types:
    - Types:
      1. Type I: Endonuclease + Methylase
      2. Type II: Endonuclease (with palindromic recognition sequences of 4-8 bases)
      3. Type III: Endonuclease + Methylase (with asymmetric recognition sites)
    - Common Characteristics:
      - All types recognize specific sequences to cut DNA at defined locations.

Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978

• Winners:
    - Werner Arber, Daniel Nathans, Hamilton O. Smith for discovery of restriction enzymes and their significance in molecular genetics.

CRISPR-Cas9 – Bacterial Immune System

• Mechanism Outline:
    - CRISPR/Cas9 involves guide RNA, target DNA, and the Cas9 protein which cuts the target DNA at specified sequences, providing a method for genomic editing.

Applications of CRISPR-Cas9 in Biotechnology

• Nobel Prize in Chemistry 2020:
    - Awarded to Emmanuelle Charpentier and Jennifer Doudna for developing genome editing methods through CRISPR/Cas9.

Comparison of CRISPR/Cas9 and Restriction Enzymes

• Restrictiveness:
    - Restriction enzymes lack specificity for certain phages and may act on the first infection.

• Adaptability:
    - CRISPR/Cas9 is sequence-specific and adaptive, requiring infection for immunity yet being less prone to suppression – allows genome editing in virtually all organisms.

Post-Transkription mRNA Modifikation

Bei Prokaryoten kann die mRNA aus Transkription mit kontinuierliche codonsequenz auf Cytoplasma direkt für Ribosom in Translation nutzen.

mRNA nach der Transkription ist pre mRNA. Pre mRNA wird in Zellkern modifiziert und dann ins Cytoplasma bewegen.

5’-Cap: Kappe am 5’Ende der pre mRNA. Abspaltung des Gamma-Phosphatrest durch die Phophohydrolase, entsteht ein 5’-Diphosphatende. Durch 5',5'-Triphosphatbindung zwischen dem Riboserest des angefügten (attached) GMPs und dem Riboserest des zuvor ersten Nucleotids der pre RNA. Dann die Guanosin nukleotide durch Methylierung an der 7 Position wird 7-Methylguanosinrest bildet. Schutz der mRNA vor Abbau und stabilisiert mRNA und mRNA kann ins Cytoplasma bewegen.

Spleißen der Exons

Exon ist die Region, die für Protein codiert wird. Intron ist die Region, die nicht für Protein codiert wird. Spleißsom und Ribozym wird schneidet Intron und Exon spleißen.

Gruppe I und II der Intron benötigen kein ATP, Gruppe III der Intron benötigt 3 ATP.

Cofaktor für die Gruppe I: Guaninnucleosid oder -nucleotid, 3’-OH-Gruppe des Guanosins wirkt als nukleophile Gruppe und bildet mit dem 5’-Ende des Introns eine normale 3’-5’- Phosphodiesterbindung. Die 3’-OH-Gruppe des Exons 1, die im 1. Schritt frei wurde, greift nun als nukleophile Gruppe am 3’-Ende des Introns an. Intron dann rausgeschnitten.

Gruppe II: Spleißen mit Ribozym. Cofaktor für die Gruppe II: 2’-OH-Gruppe eines Adenylrestes. Adenylrestes im Intron selbst wirkt als nukleophile Gruppe. Die 3’OH Gruppe des Exon 1 („5’-Exon“) wird zur nukleophilen Gruppe und greift am 3’-Ende des Introns an. Exon 1 und Exon 2 durch eine neue Phosphodiesterbindung miteinander verknüpft.

Poly-(A)-Schwanz: Am 3’-Ende: Schutz der mRNA vor Abbau.

3’Ende der pre mRNA ist entfernt und 200 Adenosin nukleotide wird durch Poly A Polymerase mit ATP zu AMP hinzugefügt. Das heißt Poly-(A)-Schwanz.

Cotranskriptionales Prozessieren

• pre mRNA zu mRNA

• Capping

  • wird am 5’ Ende der RNA eine besondere Struktur angefügt

  • durch Spleißen nicht codierende Abschnitte aus der mRNA entfernt

  • Poly A Schwanz angefügt

  • Enzyme wird über hyperphosphorylierte CTD = widerholung der AS abfolge dirigiert (conducted)

  • RNA Polymerase II, am 5’ Kappe Ende anfügen

  • Schutz gegen Abbau durch 5’-3’Exonuclease

• Spleißen: Cut and Paste

  • eukaryotische Gene besteht aus mehreren Exons und Introns, wobei die Exons die kodierenden Bereiche sind, die nach dem Spleißen zusammengefügt werden, während die Introns entfernt werden.

  • bei Prokaryoten auch in Mitochondrien und Chloroplaseten stattfinden

  • Selbstspleißen: Intron Gruppe I mit Faktoren und II mit Adenosins

    • Lasso Struktur

  • Im Zellkern werden Introns in Spleißosom ausgeschnitten, Energie in ATP

• differenzielles Spleißen

  • werden die Exons in der Abfolge miteinander verknüpft, um eine Gene zwei oder mehrere Variante entstehen

  • mit cis wirkende und trans wirkende Squenzelemente beteilgt

  • Spleißprocess förden oder inhibieren

    • Splicing enhancer

    • Splicing silencer

    • innerhalb Exon oder Intron

• Ployadenylierung

  • an das 3’Ende

    • 3 Stufe

      • Erkennung des RNA Abschnittes

      • Spaltung der RNA

      • das Anfügen der Adenosinreste

  • RNA Polymerase II und Proteine

  • Startpunkt durch pre mRNA determiniert

• RNA Interferenz bei miRNA

• Regulierung der Genexpression durch Bindung an Ziel-mRNA

• Hemmung der Translation und Anstieg des RNA-Abbaus

• Beteiligung an der Kontrolle von Entwicklungsprozessen und Zellfunktion.

• ds RNA ist ein entscheidendes Element in der RNA-Interferenz, da es die Aktivierung von Dicer und die Bildung von siRNA fördert, die dann gezielt mRNA abbaut.

• 1. DICER

   Erkennt dsRNA und zerschneidet diese in kleine RNAs

  2. Argonaut (RISC = RNA induced Silencing Complex)

   Bindet kleine RNAs und findet homologe mRNAs und

  schneidet diese

  3. RNA-abhängige RNA Polymerase

  Stellt dsRNA her

  Mechanismus zur Virus-Abwehr

   Doppelsträngigen RNA Viren

• Abwehr von RNA-Viren und pathogenen RNA Molekülen

  • Gen Regulation: microRNAs

   Regulation im Cytoplasma

  • Abwehr von mobilen genetischen Elementen

  • Heterochromatin und Zentromer Integrität

  • Gen Regulation: Epigenetik

   Regulation im Kern

• micro RNA

  • kleine RNA, die im Genom codiert werden und sich nach ihrer Prozessiung an mRNA lager und über gebundene Proteine deren Abbau initiiert oder Translation verhindert

• siRNA

• small interfering RNA (siRNA): Eine Klasse von doppelsträngigen RNA-Molekülen, die eine wichtige Rolle in der RNA-Interferenz spielen, indem sie die mRNA gezielt abbauen und somit die Genexpression regulieren.

Konjugation

• Die Konjugation ist der direkte Genaustausch zwischen zwei lebenden Bakterienzellen durch physischen Kontakt.

  • Der F-Faktor: Voraussetzung ist das F-Plasmid (Fertilitätsfaktor). Die Geberzelle (F+) besitzt einen Sexpilus, mit dem sie die Empfängerzelle (F-) kontaktiert.

  • Ablauf: Es bildet sich eine Plasmabrücke (Konjugationsbrücke). Ein DNA-Einzelstrang des Plasmids wird in die F- Zelle übertragen und dort zum Doppelstrang ergänzt. Am Ende sind beide Zellen F+.

  • Hfr-Zellen: Ist das F-Plasmid in das Hauptchromosom integriert, werden bei der Konjugation auch chromosomale Gene übertragen.

  • Wichtig: Benötigt direkten Zellkontakt (siehe U-Rohr-Experiment von Davis).

Genetische Unterschiede zwi-

schen pathogenen und nichtpathogenen

Bakterien. (A) Genetische Unterschiede zwi-

schen nichtpathogenen E. coli-Bakterien und

zwei eng verwandten Krankheitserregern, die

durch Nahrungsmittel übertragen werden –

Shigella flexneri, der Erreger der Bakterienruhr,

und Salmonella enterica, häufiger Verursacher

von Lebensmittelvergiftungen. Nichtpatho-

gene E. coli-Stämme besitzen ein einzelnes

zirkuläres Chromosom. Das Chromosom von

S. flexneri unterscheidet sich von dem von

E. coli nur an wenigen Stellen. Die meisten

Gene, die für die Krankheitsentstehung erfor-

derlich sind, liegen auf einem extrachromoso-

malen Virulenzplasmid. Im Chromosom von

S. enterica befinden sich zwei lange Einschübe

(Pathogenitätsinseln), die im E. coli-Chromo-

som nicht vorhanden sind – beide enthalten

zahlreiche Virulenzgene. (B) Pathogene Bakte-

rien entwickeln sich über horizontalen Gen-

transfer. Dieser kann über drei Mechanismen

ablaufen: natürliche Transformation, bei der

nackte DNA von einem kompetenten Bakte-

rium aufgenommen wird; Transduktion, bei

der Viren, die Bakterien infizieren (Bakterio-

phagen), DNA von einem Bakterium auf ein

anderes übertragen; und Konjugation, in de-

ren Verlauf Plasmid-DNA und sogar chromo-

somale DNA von einem Spenderbakterium auf

ein Empfängerbakterium übertragen werden.

• Die Transformation ist die Aufnahme von freier, nackter DNA aus der Umgebung.

  • Vorgang: Wenn Bakterien sterben und lysieren (platzen), wird ihre DNA in die Umgebung freigesetzt. Andere Bakterien können diese Fragmente aufnehmen.

  • Kompetenz: Nur „kompetente“ Bakterien können DNA aufnehmen. Manche sind es von Natur aus (z. B. Bacillus subtilis), andere müssen im Labor (durch Hitze oder Stromschläge) kompetent gemacht werden.

  • Ablauf: Ein DNA-Einzelstrang wird in die Zelle gezogen und kann durch homologe Rekombination gegen einen Teil des eigenen Genoms ausgetauscht werden.

  • Besonderheit: Bekannt durch das Griffith-Experiment (S- und R-Stämme bei Pneumokokken).

• Die Transduktion ist der Genaustausch mithilfe von Bakteriophagen (Viren) als Gen-Taxi.

  Man unterscheidet zwei Typen, je nachdem, wie der Fehler beim Verpacken der Viren entsteht:

  A. Allgemeine (generalisierte) Transduktion

  • Wann: Während des lytischen Zyklus.

  • Fehler: Das Bakterien-Chromosom wird zerstückelt. Ein beliebiges Stück Bakterien-DNA wird versehentlich in einen neuen Phagenkopf eingebaut (Packaging-Fehler).

  • Inhalt: Nur Bakterien-DNA, keine Phagen-DNA.

  • Transfer: Der Phage injiziert diese DNA in das nächste Bakterium.

  B. Spezielle (spezialisierte) Transduktion

  • Wann: Beim Übergang vom lysogenen zum lytischen Zyklus.

  • Fehler: Der eingebaute Prophage wird unpräzise aus dem Bakterien-Chromosom ausgeschnitten (Exzisions-Fehler).

  • Inhalt: Eine Mischung aus Phagen-DNA und den unmittelbar benachbarten Bakterien-Genen.

  • Transfer: Nur spezifische Gene (die neben dem Integrationsort) werden übertragen.

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CRISPR/Cas9

In Prokaryoten gibt es Palindrom Sequenzen, für ein einzelstrang und Komplementäre Strang sind gleiche von 5’ zu 3’ Sequenz ablesen . GAATTC. CRISPR bei Prokaryoten ist adaptive Immunität. Schutz vor Angriff von Viral DNA und Plasmid. Spacer ist zwichen die Palindrom Sequenzen. Spacer sind fremde DNA aus Plasmid oder Bakterialphages. Viral DNA wird an der CRISPR bindet und CRISPR sequenz z.B. Palindrom Sequenzen erstellt. Diese Viral merken. Die CRISPR sequenz kann zu pre CRISPR RNA transkribieren. Cas9 ist Nuklease, welche DNA schneiden kann. Cas 9 wird mit Tracer RNA und pre CRISPR RNA bindet und RNAase III wird die Strand zwischen Cas 9 Komplex schneidet. Es gibt jetzt die Effektor Komplex. Dann kann die Bakterien vor die Angreifer schutzen. Wenn Viral DNA ein Sequenz komplementäre zu CRISPR RNA hat, Nuklease wird koordiniert. PAM wird auf der Upstream der PAM an beide Stränge der DNA schneiden. Es gibt keine Transkription von Viral DNA und deswegen gibt es keine Infektion.

Biotechnologie für Krebs immunotherapie oder Pflanze für Krankheiten resistent.

CRIPSR RNA mit Tracer RNA bindet. Sigle guide RNA erstellt. Sigle guide RNA mit Cas 9 aus Bakterien kann Effektor Komplex erstellt und dann kann die DNA Sequenz schneiden. Effektor Komplex wird DNA ablesen, bis PAM erreicht. Dann kann DNA schneiden. Geschnitten DNA kann durch HDR oder NHEJ reparieren. NHEJ benötigt keine Template. Ein DNA Strang mit ähnlichen Sequenzen kann als Template werden. Es gibt auch Deletion und Insertion mit Indel machen. Indel ist mit DNA Sequenzen, die wird Deletion und Insertion haben, bindet. NHEJ ist meistens in Eukaryoten.

Transformation

• einen avirulenten Bakterienstamm, der in der Lage ist, genetische Materialien effizient in das Wirtsgenom zu integrieren. Durch Zugabe abgetöteter Zellen eines Virulenten Stammes in einen Virulenten Stamm umzuwandeln. Später wurde die Transformation durch die DNA des virulenten Stammes bewirkt.

• Konjugation ist DNA Übertragung von einer Zelle in eine andere Zelle mithilfe spezifischer Strukturen und Proteine

• Infektion ist Übertragung von DNA aus eiem Phagenpartikel in eine Zelle

• Transduktion ist Übertragung chromosomoler DNA eines Prokaryoten in eine andere Zelle über Phagenpartikel, in die die DNA fehlverpackt wurde.

• Transfektion ist Transformation freier Viren DNA aus der in der Zelle Viren Parktikel gebildet werden können

• Transformation ist der Prozess, bei dem freie DNA von der Umgebung in eine Zelle aufgenommen und in das Genom integriert wird.

• Pflanzen werden Zellen, Gewebe oder ganze Pflanzen eingesetzt. Es gibt transienter Transformation und stabiler Transformation

• Bei der transienten Transformation verbleibt die aufgenommene DNA nur kurzfristig in der Zelle, während sie bei der stabilen Transformation in das Genom integriert wird und somit über Generationen hinweg vererbt werden kann.

• stabiler Transformation ermöglicht es den Pflanzen, dauerhaft neue Eigenschaften zu besitzen, die durch gezielte Genveränderungen eingeführt wurden. Diese Methode wird häufig verwendet, um Nutzpflanzen mit verbesserten Eigenschaften wie Resistenz gegen Krankheiten oder verbesserte Nährstoffgehalte zu entwickeln. Die Intergration der DNA ins Genom, wie Pilze haben auch Pflanzenzellen eine massive Zellwand.

• Bei Tierischen Zellen gibt es auch transienten Transformation und stabiler Transformation

• Transformation der tierischen Zellen wird oft als Transfektion bezeichnet

• mit DNA und Calciumphosphat, DNA kann auch in Liposomen eingeschlossen werden

• Um diesen Prozess zu optimieren, werden häufig auch Elektroporation oder Mikroinjektion eingesetzt, um die Effizienz der Genübertragung zu erhöhen. Diese Methoden ermöglichen eine gezielte Steuerung der Genexpression und die Untersuchung der genetischen Funktion in einem spezifischen Zelltyp. Darüber hinaus zeigen Studien, dass die Auswahl geeigneter Promotoren entscheidend für die erfolgreiche Transfektion ist.

Erklären Sie die Ursache für den unterschiedlich ausgeprägten lila-gelb gesprenkelten Phänotyp der Maiskörner. Gehen Sie davon aus, dass der „normale“ Phänotyp dieses Maises lila ist

› Mutation basiert auf Transposons

› Gene, die für die lila Farbe verantwortlich sind, können durch die Insertion von Transposons inaktiviert werden → gelber Phänotyp tritt auf

› Mutation ist instabil, da Transposons aus Genen wieder herausspringen können

Einfluss des Entwicklungsstadiums auf den Phänotyp:

› Frühe Exzision des Transposons:

→ Große Reversionssektoren entstehen

→ Großteil des Maiskorns wird lila

› Späte Exzision des Transposons:

→ Kleine Reversionssektoren entstehen

→ Großteil des Maiskorns bleibt gelb

Wie bringt Agrobacterium tumefaciens das Ti-Plasmid in Pflanzen ein und welche Auswirkungen hat dieses auf Pflanzen?

Übertragung:

→ Ti-Plasmid codiert für Transfer-DNA

→ Transfer-DNA wird in Pflanzenzelle eingeschleust (nicht das ganze Plasmid)

→ Pflanzenzelle nimmt Transfer-DNA ins Genom auf

Auswirkungen:

→ Antreiben der Zellteilung = Proliferation im pflanzlichen Gewebe

→ Bildung von Tumoren ("Gallen"), die Platz und Schutz für Bakterienwachstum

bieten

→ Ti-DNA codiert außerdem Gene für Enzyme, die in der pflanzlichen Zelle die

Produktion stickstoffhaltiger Verbindungen (Opine) veranlassen

→ Agrobacterium tumefaciens kann Opine als Energiequelle nutzen, die Pflanze

kann Opine selbst nicht nutzen

→ Pflanze ist ein guter Wirt, produziert Nährstoffe und bietet Platz für das

Bakterium

Erklären Sie kurz, was Hfr-Stämme sind und warum sie chromosomale DNA mehr

als 1000 * häufiger übertragen als normale Stämme.

Hfr = High frequency of recombination

→ Haben das F-Plasmid in ihr chromosomales Genom integriert

→ Vom Ausgangspunkt des F-Plasmids startet immer die Übertragung der DNA

→ Benachbarte chromosomale DNA wird häufig mit in die rezipiente Zelle übertragen

→ Durch Integration des Plasmids in die chromosomale DNA erfolgt wesentlich häufiger eine zufällige Übertragung von chromosomaler DNA

Nennen Sie einen Typ von DNA-Abschnitt, der sich besonders gut als molekularer Marker für den genetischen Fingerabdruck eignet.

Minisatelliten DNA (15-100 bp lange Sequenzen, die häufig wiederholt werden)

› Microsatelliten DNA (1 kb lange Tandemrepeats aus Di- oder Trinukleotidmotiven)

Erklären Sie kurz, wie die Kartierung des E. coli-Genoms früher durch „Interrupted
Mating“ erfolgte.

Die Konjugation verläuft mit konstanter Geschwindigkeit. Durch gezielte Unterbrechung der Konjugation nach bestimmter Zeit konnte man den Übertragungsfortschritt nutzen, um die Reihenfolge der Gene auf dem Chromosom ausgehend vom integrierten F-Plasmid zu bestimmen.

Etwa 45 % des menschlichen Genoms besteht aus repetitiver Transposon-DNA. Überlegen Sie, weshalb die Transposon-DNA nicht ständig in aktive Gene springen und so Mutationen verursachen!

› Transposons tragen häufig Mutationen
   → die meisten Transposons sind nicht mehr zur Transposition fähig
› Zellen haben Mechanismen, um Transposons auszuschalten
   → beruhen auf epigenetischer Mutation
   → werden oft in Heterochromatinform gebracht
   → Stilllegung, können nicht transkribiert werden

Aber : Nicht mutierte Transposons können in aktive Gene springen und so in
einzelnen Fällen Auslöser für Krankheiten und Krebs sein.

Welche Aussagen über F-Plasmide sind richtig?

Bei der imperfekten Rekombination wird beim Ausschneiden des F-Plasmids ein Teil der chromosomalen DNA mit rausgeschnitten.

Merodiploide Zellen können durch das Einbringen eines F‘-Plasmids entstehen.

Das F-Plasmid wird bei der Konjugation als Einzelstrang übertragen (Rolling Circle Mechanismus).

Bei der perfekten Rekombination entsteht ein F‘-Plasmid.

Bei merodiploiden Zellen handelt es sich um partiell diploide Zellen

Nennen Sie drei Möglichkeiten zum Genaustausch bei Prokaryoten und erläutern Sie in jeweils einem Satz, was dabei passiert.

Konjugation

› Horizontaler Gentransfer zwischen zwei Bakterien über eine Cytoplasmabrücke

Transformation

› Aufnahme externer DNA aus einem Medium

Transduktion

› Prozess, bei dem Bakteriophagen Wirts-DNA in andere Bakterien einschleusen

CRISPR-Cas9 ist Teil des [1bakteriellen] Immunsystems. Im Gegensatz zu anderen Restriktionsenzymen handelt es sich bei CRISPR-Cas9 um eine [2indirekte] Immunantwort. CRISPR-Cas9 erfordert zunächst eine Infektion, um Immunität zu erlangen. Nach einem überstandenen Infekt können nun Teile der fremden DNA in das Genom des Bakteriums, den sogenannten [3CRISPR-Locus], eingebaut werden, was ein genetisches Wiedererkennen der viralen DNA bei erneuter Infektion ermöglicht. Dieser Locus wird nun [4transkribiert] und die Tracer-RNA und das Cas9-Enzym binden. Anschließend wird der Komplex von dem Enzym [5RNAse III] geschnitten. Cas9 kann dank der CRISPR-RNA an komplementäre virale DNA binden und diese
durch die [6Endonuklease]-Aktivität schneiden.

Welche Aussage trifft auf welchen Transposon-Typ zu?

Überlegen Sie, welchen Vorteil Bakterien durch Konjugation in der natürlichen Umgebung haben könnten.

→ Erhöhen der genetischen Vielfalt → schnellere Anpassung an die Umwelt
→ Wichtiger Ersatz zur sexuellen Reproduktion
→ Verbreitung von vorteilhaften Mutationen, z.B Resistenzen gegen Antibiotika, Giftstoffproduktion, Metabolitenverstoffwechselung

Restriktionsendonukleasen haben häufig noch eine Methyltransferase-Funktion, wozu dient diese?

Methyltransferase setzt Methylgruppen an bestimmten Basen der eigenen DNA
→ eigene DNA wird so markiert und nicht von Restriktionsendonukleasen geschnitten

› Nicht methylierte Viren-DNA wird als fremd erkannt
→ kann geschnitten werden

Welcher Typ Restriktionsendonuklease trifft auf diese Aussagen zu?

Wer hat den Joghurt des Professors gegessen? Ermitteln Sie den Täter durch das gezeigte DNA-Agarose-Gel.

Die Tutorin, da ihre DNA-Zusammensetzung mit der DNA-Probe übereinstimmt.

Erklären Sie, wie Lederberg und Tatum belegt haben, dass ein Genaustausch
zwischen Bakterien stattfinden muss.

Ausgangspunkt: Zwei Bakterienstämme, auxotroph A und B
→ Auxotropher Stamm A wächst nicht auf dem Medium, in dem Methionin fehlt
→ Auxotropher Stamm B wächst nicht auf dem Medium, in dem Threonin fehlt

Fragestellung: Was passiert, wenn beide Bakterienstämme gemischt auf Minimalmedium gegeben werden?

→ Minimalmedium enthält weder Methionin noch Threonin
→ Theoretische Erwartung: Keiner der Stämme dürfte wachsen
→ Tatsächlicher Befund: Es entstehen Bakterienkolonien, die auf Minimalmedium wachsen können

Ergebnis: Es muss ein Austausch der DNA zwischen den Bakterien stattgefunden
haben. Nur so können Bakterien entstehen, die ohne beide Aminosäuren überleben können.

Erklären Sie den Unterschied zwischen allgemeiner und spezieller Transduktion.

Allgemeine Transduktion:
→ Lyse des Wirtsgenoms durch den Phagen
→ Wirt produziert nur noch Virusbestandteile
→ Beim Zusammenbau der neuen Viren wird statt der viralen DNA versehentlich bakterielle DNA verbaut
→ Zufällige Übertragung von DNA-Fragmenten aus dem Wirtsgenom

Spezielle Transduktion
→ Einbau der Phagen-DNA in eine bestimmte Stelle des Wirtsgenoms
→ Beim Herausschneiden kommt es zur fehlerhaften Exzision, bei der benachbarte Gene ebenfalls herausgeschnitten und verpackt werden
→ Nur DNA neben der temperenten Phage kann übertragen werden

Erklären Sie, wie das CRISPR-Cas-System in der Gentechnik eingesetzt werden kann.

→ In vitro Erstellung einer guide-RNA und Kopplung mit Cas9-Enzym
→ Guide-RNA führt den CRISPR-Cas9-Komplex zu gewünschter Zielsequenz
→ Erzeugung eines Doppelstrangbruchs
→ Reparaturmechanismen der Zelle treten in Kraft, zwei Möglichkeiten

Reparatur:
1. Re-Ligation: Verursacht oft Mutationen → Knock-out
2. Einbringen eines DNA-Abschnitts: Zugegebene DNA wird bei Reparatur eingebaut

Fazit: schnelle, günstige und gezielte Methode, DNA nach Belieben zu modifizieren

Wählen Sie die richtigen Aussagen zum Thema Transposons aus.

Retrotransposons transponieren multiplikativ.

IS-Elemente codieren für eine Transposase.

Transposons sind mobile genetische Elemente

DNA-Transposons sind in allen Domänen des Lebens vertreten.

Was versteht man unter einem Ti-Plasmid?

→ Tumor induzierendes Plasmid

Nennen Sie drei Vorteile von molekularen Markern gegenüber morphologischen
Markern.

› nahezu in unbegrenzter Anzahl im Genom vorhanden

› einfache Erbgänge

› codominant

› unabhängig von Gewebetyp und Alter

› unabhängig von Umweltbedingungen