11เทคนิคอณูจำแนกแบค

• ความสำคัญของเทคนิคทางอณูชีววิทยา

  • ช่วยให้การวินิจฉัยโรคติดเชื้อทำได้รวดเร็วขึ้น

  • ลดระยะเวลาในการจำแนกเชื้อและการทดสอบความไวต่อยา

  • วินิจฉัยเชื้อที่เพาะเลี้ยงยากได้

  • ช่วยลดความเสี่ยงของการแพร่ระบาดสู่ชุมชน ทำให้ผู้ป่วยได้รับการรักษาที่เหมาะสมและทันท่วงที

• หลักการพื้นฐาน

  • เป็นเทคนิคที่ใช้ในการตรวจหา DNA, RNA หรือโปรตีนของเชื้อก่อโรค

  • การตรวจหาลำดับเบสที่จำเพาะในสิ่งมีชีวิตแต่ละชนิด (species-specific DNA sequences)

• เมื่อใดที่ควรใช้เทคนิคทางอณูชีววิทยา

  • เมื่อวิธีการตรวจแบบดั้งเดิมให้ผลตรวจที่ไม่ดีหรือไม่ถูกต้อง

  • ใช้ตรวจสอบเชื้อที่เพาะยากหรือใช้เวลานาน เช่น Mycobacteria, Mycoplasma

  • ใช้ในการศึกษาเชื้ออันตราย เช่น Yersinia pestis, Bacillus anthracis

  • เชื้อที่ต้องใช้ปริมาณสูงหรือยากในการทดสอบทางชีวเคมี เช่น Streptococcus pyogenes, N. gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis

  • Intracellular pathogens เช่น Mycoplasma genitalium

• เทคนิคหลักที่ใช้ในการตรวจวินิจฉัยทางอณูชีววิทยา

  • Nucleic acid-based detection methods

    • Hybridization

    • Diagnostic PCR

    • Real-time PCR (qPCR)

  • Molecular typing methods

    • Plasmid profiling

    • RFLP analysis (restriction fragment length polymorphism)

    • Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)

    • Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD)

    • Amplified fragment length polymorphism (AFLP)

    • Variable number of tandem repeats (VNTR)

    • Single nucleotide polymorphism (SNP) typing

    • Microarray typing

• รายละเอียดของแต่ละเทคนิค

  • DNA Hybridization: การจับกันของ DNA สองสายที่เป็นคู่สมกัน ใช้ศึกษาความสัมพันธ์ของเชื้อแบคทีเรีย 2 ชนิด

    • Colony hybridization ใช้ DNA probe ที่ติดฉลากด้วยสารรังสีหรือสารเรืองแสง เพื่อหาว่าโคโลนีใดของแบคทีเรียมียีนที่เราสนใจจะศึกษา

  • Diagnostic PCR: ใช้เทคนิค PCR ในการเพิ่มจำนวนยีนของเชื้อแบคทีเรีย เป็นเทคนิคที่สามารถใช้ตรวจหาเชื้อจำนวนน้อย ๆ ได้อย่างรวดเร็ว

    • ขนาดของ PCR product สามารถบอกชนิด (species) และสายพันธุ์ (strain) ของเชื้อได้

    • มี commercial kits สำหรับตรวจหาเชื้อก่อโรคจำหน่ายหลายชนิด

  • Real-time PCR (qPCR): ตรวจติดตามและบอกปริมาณของ PCR product ที่เพิ่มในแต่ละ cycle ของปฏิกิริยา

    • ใช้วัดปริมาณเชื้อก่อโรค หรือใช้ติดตามผลการรักษาโรคติดเชื้อ

    • มีความไวและความจำเพาะสูงกว่า PCR ทั่วไป

    • การตรวจสอบทางเคมีของ real time PCR: TaqMan vs. SYBR Green

  • Plasmid profiling: ใช้ในการศึกษารูปแบบของ plasmid ในแบคทีเรีย โดยเชื้อแต่ละชนิดจะมีจำนวน plasmid และขนาดของ plasmid แตกต่างกัน

    • มักใช้ในการศึกษาทางระบาดวิทยาของเชื้อก่อโรคและเชื้อดื้อยา

  • RFLP (restriction fragment length polymorphism): ใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะตัดสายของ DNA เพื่อดูลักษณะรูปแบบของชิ้นส่วน DNA ที่ถูกตัด

    • ใช้จำแนกสายพันธุ์ของเชื้อแบคทีเรีย และตรวจลายพิมพ์ DNA (DNA fingerprint)

  • Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE): เป็นเทคนิคที่ใช้ในการวิเคราะห์ DNA ขนาดใหญ่ มักใช้ร่วมกับเทคนิค Genomic RFLP เพื่อเพิ่มความสามารถในการแยกและวิเคราะห์ band ของ DNA ที่เกิดจากการตัดด้วย restriction enzyme

  • Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD): เทคนิคที่ใช้ในการเพิ่มจำนวน DNA ที่ไม่รู้ลำดับเบสที่แน่นอน โดยใช้ random primer เข้าไปจับกับสาย DNA ในตำแหน่งต่าง ๆ แบบสุ่ม

  • Amplified fragment length polymorphism (AFLP): เพิ่มปริมาณชิ้น DNA ที่มาจากการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะด้วย PCR

  • Variable number of tandem repeats (VNTR): tandem repeats คือส่วนของ DNA ที่ลำดับเบสเรียงตัวซ้ำ ๆ กันเป็นชุด

  • Single nucleotide polymorphism (SNP) typing: เป็นการแปรผันของลำดับ DNA ชนิดหนึ่ง ทำให้ nucleotide หนึ่งตัวในจีโนมแตกต่างจากจีโนมของสิ่งมีชีวิตอื่นในสปีชีส์เดียวกัน

  • Microarray typing: ตรวจสอบ presence หรือ absence ของชุด markers ที่กำหนดไว้ใน genome

• Nucleotide sequencing: เทคนิคที่ใช้ในการหาลำดับเบสของสาย DNA

  • Chain termination (Sanger method)

  • Chemical cleavage (Maxam-Gilbert method)

  • Pyrosequencing

• Gene Xpert: ใช้หลักการของ real time PCR เพิ่มจำนวนของสารพันธุกรรมของเชื้อที่ต้องการตรวจ

  • นิยมใช้ในการตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อวัณโรคและการดื้อยา rifampicin ในโรงพยาบาลในประเทศไทย

• การประยุกต์ใช้เทคนิคทางอณูชีววิทยาในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยาคลินิก

  • ตรวจหาเชื้อก่อโรคในสิ่งส่งตรวจ

  • ตรวจหาเชื้อที่ตายแล้ว

  • ตรวจหาเชื้อที่ไม่สามารถเพาะเลี้ยงได้หรือเพาะเลี้ยงยาก

  • ตรวจหาเชื้อที่โตช้าได้อย่างรวดเร็ว

  • ตรวจหายีนดื้อยา

  • แยกสายพันธุ์เชื้อก่อโรคและไม่ก่อโรค

  • ตรวจหาปัจจัยก่อโรค (virulence factor)

  • ตรวจหาการกลายพันธุ์และการเปลี่ยนเบสในสาย DNA

• การตรวจหาเชื้อที่ไม่สามารถเพาะเลี้ยงได้ (Non-cultivable microbes)

  • Amplification-based methods

  • Hybridization with multiple probes, or nucleotide sequencing

• การตรวจหาการดื้อยา (Detecting antimicrobial-drug resistance)

  • สามารถตรวจสอบการดื้อยาปฏิชีวนะของเชื้อได้อย่างรวดเร็ว

  • ตรวจหาการกลายพันธุ์ที่เป็นสาเหตุให้เชื้อดื้อยา

ข้อควรระวัง:

• เทคนิคทางอณูชีววิทยายังไม่ได้ใช้เป็นงานประจำ (routine) ในห้องปฏิบัติการแบคทีเรีย

• การตรวจเจอยีนดื้อยาไม่ได้แปลว่าเชื้อจะดื้อยาเสมอไป

• ควรใช้วิธีทดสอบความไวของเชื้อต่อยาแบบดั้งเดิมควบคู่กันไปด้วย

คำถาม: เลือกคำศัพท์ที่เหมาะสมที่สุดจากตัวเลือกที่กำหนดให้ เพื่อเติมลงในช่องว่างให้ข้อความสมบูรณ์

1. เทคนิค __________ ใช้ในการตรวจหา DNA, RNA หรือโปรตีนของเชื้อก่อโรค

   • (ก) การเพาะเลี้ยงเชื้อ

   • (ข) ทางอณูชีววิทยา

   • (ค) ทางเคมี

   • (ง) ทางกายภาพ

2. __________ เป็นการหาลำดับเบสที่จำเพาะในสิ่งมีชีวิตแต่ละชนิด

   • (ก) การเพาะเลี้ยงเชื้อ

   • (ข) Microscopy

   • (ค) Molecular diagnostics

   • (ง) Seropositivity

3. __________ ใช้ DNA probe ที่ติดฉลากด้วยสารรังสีหรือสารเรืองแสง

   • (ก) Diagnostic PCR

   • (ข) Colony hybridization

   • (ค) Real time PCR

   • (ง) Plasmid profiling

4. __________ เป็นเทคนิค PCR ที่สามารถตรวจหาเชื้อได้รวดเร็วและตรวจหาเชื้อที่โตช้าหรือเพาะเลี้ยงยากได้

   • (ก) Diagnostic PCR

   • (ข) Colony hybridization

   • (ค) Real time PCR

   • (ง) Plasmid profiling

5. __________ ตรวจติดตามและบอกปริมาณของ PCR product ที่เพิ่มในแต่ละ cycle ของปฏิกิริยา

   • (ก) Diagnostic PCR

   • (ข) Colony hybridization

   • (ค) Real time PCR (qPCR)

   • (ง) Plasmid profiling

6. __________ ใช้ในการศึกษารูปแบบของ plasmid ในแบคทีเรีย

   • (ก) RFLP analysis

   • (ข) Real time PCR

   • (ค) Pulsed-field gel electrophoresis

   • (ง) Plasmid profiling

7. __________ ใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะตัดสายของ DNA เพื่อดูลักษณะรูปแบบของชิ้นส่วน DNA ที่ถูกตัด

   • (ก) RFLP (restriction fragment length polymorphism)

   • (ข) Real time PCR

   • (ค) Pulsed-field gel electrophoresis

   • (ง) Plasmid profiling

8. __________ เป็นเทคนิคที่ใช้ในการวิเคราะห์ DNA ขนาดใหญ่

   • (ก) RFLP analysis

   • (ข) Real time PCR

   • (ค) Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)

   • (ง) Plasmid profiling

9. __________ ใช้ random primer เข้าไปจับกับสาย DNA ในตำแหน่งต่าง ๆ แบบสุ่ม

   • (ก) AFLP

   • (ข) Real time PCR

   • (ค) Pulsed-field gel electrophoresis

   • (ง) RAPD

10. __________ เพิ่มปริมาณชิ้น DNA ที่มาจากการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะด้วย PCR

    • (ก) AFLP

    • (ข) Real time PCR

    • (ค) Pulsed-field gel electrophoresis

    • (ง) RAPD

11. __________ คือส่วนของ DNA ที่ลำดับเบสเรียงตัวซ้ำๆ กันเป็นชุด

    • (ก) SNP

    • (ข) Microarray

    • (ค) Sequencing

    • (ง) VNTR

12. __________ เป็นการแปรผันของลำดับ DNA ชนิดหนึ่ง ทำให้ nucleotide หนึ่งตัวในจีโนมแตกต่างจากจีโนมของสิ่งมีชีวิตอื่นในสปีชีส์เดียวกัน

    • (ก) SNP

    • (ข) Microarray

    • (ค) Sequencing

    • (ง) VNTR

13. __________ ตรวจสอบ presence หรือ absence ของชุด markers ที่กำหนดไว้ใน genome

    • (ก) SNP

    • (ข) Microarray typing

    • (ค) Sequencing

    • (ง) VNTR

14. __________ เป็นเทคนิคที่ใช้ในการหาลำดับเบสของสาย DNA

    • (ก) SNP

    • (ข) Microarray typing

    • (ค) Nucleotide sequencing

    • (ง) VNTR

15. __________ ใช้หลักการของ real time PCR เพิ่มจำนวนของสารพันธุกรรมของเชื้อที่ต้องการตรวจ

    • (ก) Sequencing

    • (ข) Microarray typing

    • (ค) VNTR

    • (ง) Gene Xpert

ฉันจะสร้างควิซแบบเติมคำศัพท์ที่เหมาะสม โดยจะให้ตัวเลือกศัพท์และประโยคที่ต้องเติม:

คำศัพท์ที่ให้:

- RAPD

- Ribotyping

- PFGE

- Plasmid profiling

- RFLP

- Real-time PCR

- TaqMan

- SYBR Green

- Gene Xpert

- Melting curve

จงเลือกคำศัพท์ข้างต้นมาเติมในช่องว่าง:

1. ____________ เป็นเทคนิคที่ใช้ในการวิเคราะห์ DNA ขนาดใหญ่ มักใช้ร่วมกับ Genomic RFLP

คำตอบ: PFGE

คำอธิบาย: เทคนิคนี้ช่วยเพิ่มความสามารถในการแยกและวิเคราะห์ band ของ DNA ขนาดใหญ่

2. ____________ ใช้ในการตรวจหารูปแบบของ plasmid ในแบคทีเรีย ซึ่งแต่ละสายพันธุ์จะมีจำนวนและขนาดของ plasmid แตกต่างกัน

คำตอบ: Plasmid profiling

คำอธิบาย: วิธีนี้มักใช้ในการศึกษาทางระบาดวิทยาของเชื้อก่อโรคและเชื้อดื้อยา

3. ____________ ใช้วิเคราะห์ PCR product ที่เกิดขึ้น โดย DNA แต่ละชนิดจะมีอุณหภูมิการแยกตัวเฉพาะตัว

คำตอบ: Melting curve

คำอธิบาย: ใช้ยืนยันความจำเพาะของ PCR product ที่ได้

4. ____________ เป็นเทคนิคที่ใช้ random primer ขนาด 8-12 nucleotide ในการเพิ่มจำนวน DNA segment

คำตอบ: RAPD

คำอธิบาย: เทคนิคนี้ใช้ primer เข้าจับกับสาย DNA แบบสุ่ม

5. ____________ มีความจำเพาะสูงและสามารถทำ multiplexing ได้ แต่มีต้นทุนสูงเนื่องจากต้องใช้ probe ที่ติดฉลาก

คำตอบ: TaqMan

คำอธิบาย: เป็นวิธีที่นิยมใช้เมื่อต้องการความแม่นยำสูงในการวัดปริมาณ PCR product

6. ____________ เป็นเทคนิคที่จำแนกสายพันธุ์แบคทีเรียโดยอาศัยรูปแบบของยีน 16S rRNA และ 23S rRNA

คำตอบ: Ribotyping

คำอธิบาย: เป็นเทคนิคที่มีความจำเพาะสูงเนื่องจากการเรียงตัวของลำดับเบสของยีนเหล่านี้เป็นลักษณะจำเพาะของแบคทีเรียแต่ละสายพันธุ์

7. ____________ ใช้ในการวินิจฉัยวัณโรคและตรวจการดื้อต่อยา rifampicin ได้ภายใน 2 ชั่วโมง

คำตอบ: Gene Xpert

คำอธิบาย: เป็นเทคนิคที่มีความไวสูงและให้ผลรวดเร็ว แต่มีข้อจำกัดคือราคาแพง

8. ____________ มีต้นทุนต่ำกว่าแต่ไม่สามารถทำ multiplexing ได้

คำตอบ: SYBR Green

คำอธิบาย: เป็นวิธีที่ง่ายและประหยัด แต่มีความจำเพาะต่ำกว่า TaqMan

9. ____________ สามารถวัดปริมาณ PCR product ได้ในแต่ละรอบของปฏิกิริยา

คำตอบ: Real-time PCR

คำอธิบาย: เทคนิคนี้มีความไวและความจำเพาะสูงกว่า PCR ทั่วไป

10. ____________ ใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะตัดสาย DNA เพื่อดูรูปแบบของชิ้นส่วน DNA ที่ถูกตัด

คำตอบ: RFLP

คำอธิบาย: สิ่งมีชีวิตต่างชนิดกันจะมีรูปแบบของชิ้นส่วน DNA ที่ถูกตัดแตกต่างกัน