TECHNIEK - AGAROSE vs SDS-PAGE

Wat scheiden we?

Agarosegel — SOP6

  • scheidt nucleïnezuren (DNA/RNA)

  • bepaling grootte (bp) van plasmiden of PCR-producten

SDS-PAGE — SOP7

Protein Electrophoresis and SDS-PAGE (article) | Khan Academy

  • scheidt eiwitten

  • inschatten massa (kDa) van eiwitten in een eiwitmengsel

Gel-Matrix

  • Agarosegel: Gemaakt van agarose (een polysacharide uit zeewier). Dit vormt een relatief "grof" 3D-maaswerk met grote poriën. Het wordt horizontaal gegoten en is ideaal voor zeer grote moleculen zoals plasmide-DNA (duizenden baseparen).

  • Polyacrylamidegel (PAGE): Gemaakt van polyacrylamide (een synthetisch polymeer gevormd door de polymerisatie van acrylamide en bisacrylamide). Dit vormt een veel compacter, fijner 3D-netwerk. Het wordt verticaal gegoten en is nodig om veel kleinere moleculen, zoals eiwitten, effectief van elkaar te scheiden.

Waarom migreren ze?

Beide technieken scheiden moleculen op basis van grootte, waarbij ze van de negatieve pool (kathode) naar de positieve pool (anode) migreren. Maar de manier waarop die lading tot stand komt, verschilt wezenlijk:

  • DNA in Agarose; DNA heeft van nature een sterke, intrinsiek negatieve lading door de vele fosfaatgroepen in de suiker-fosfaat ruggengraat. De lading is bovendien perfect proportioneel met de lengte. Je hoeft het DNA dus niet voor te behandelen om het te laten migreren op basis van grootte.

  • Eiwitten in SDS-PAGE; Eiwitten hebben sterk variërende natuurlijke ladingen (afhankelijk van hun aminozuursamenstelling en de pH). Om ze puur op grootte (massa) te scheiden, moet je die natuurlijke lading maskeren. Hiervoor voeg je SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) toe. SDS is een sterk negatief geladen detergens dat aan het eiwit bindt en het ontvouwt (denatureert). Hierdoor krijgen alle eiwitten een uniforme negatieve lading die evenredig is met hun massa, en migreren ze netjes van min naar plus, puur op basis van hun grootte in kDa.

opm; Als je geen SDS toevoegt, gaan

  • sommige eiwitten naar de pluspool, andere naar de minpool

  • compact opgevouwen eiwitten sneller door de gel dan uitgerekte eiwitten van dezelfde massa

opm; Een groot eiwit (vb. 100 kDa) bindt twee keer zoveel SDS-moleculen als een klein eiwit (50 kDa). Het grote eiwit is dus dubbel zo zwaar, maar ervaart ook een dubbel zo harde elektrische trekkracht richting de pluspool. Waarom gaat het dan toch trager?

  • Verklaring: lading-tot-massa verhouding. Omdat SDS in een strikt vaste verhouding aan aminozuren bindt (ongeveer 1,4 gram SDS per 1 gram eiwit), is de verhouding tussen de trekkracht (lading) en de zwaarte (massa) voor alle eiwitten exact gelijk.

  • Omdat de "elektrische motor" voor elk eiwit nu gelijk is getrokken, is de gel de enige overgebleven scheidsrechter. Deze fungeert louter als een fysieke zeef;

    • klein, lineair eiwit glipt makkelijk door de poriën, het ondervindt weinig wrijving

    • groot, lang eiwit raakt bij elke porie verstrikt in het gelnetwerk en botst overal tegenaan, waardoor het enorm afgeremd wordt

Hoe maken we het zichtbaar?

  • Agarosegel: De gel bevat (of wordt gekleurd met) een fluorescerende kleurstof zoals GelRed. Deze molecule intercaleert (schuift) tussen de baseparen van het DNA. Wanneer je de gel onder UV-licht legt, licht het DNA op.

  • SDS-PAGE: Na de run wordt de gel gekleurd met Coomassie Brilliant Blue. Deze blauwe kleurstof bindt fysiek aan de eiwitten in de gel (voornamelijk aan basische aminozuren). Omdat de hele gel aanvankelijk blauw wordt, is een ontkleuringsstap (destaining) nodig om de achtergrond weer helder te maken, zodat de blauwe eiwitbanden zichtbaar worden met het blote oog.

De merker of ladder

  • Agarosegel: Je laadt een DNA-ladder (mengsel DNA-fragmenten met gekende lengtes)

  • SDS-PAGE: Je laadt een eiwitmerker (mengsel van eiwitten met gekende massas)

Buffers voor agarosegelelektroforese

  • 5x Orange G ladingsbuffer: Deze buffer wordt aan de stalen toegevoegd vóór de elektroforese.

    • kleurstof Orange G (of als alternatief broomfenolblauw): . bindt niet aan het DNA, maar vergemakkelijkt het laden en laat toe de migratie visueel te volgen; beweegt aan snelheid v/e fragment van 50bp

    • sucrose: verhoogt dichtheid staal zodat het bij het laden niet uit het slotje drijft

  • TAE elektroforesebuffer (loopbuffer): buffer waarin de gel wordt geplaatst en bestaat uit 40 mM Tris, 20 mM azijnzuur en 1 mM EDTA, met een pH van 8,3

Buffers voor SDS-PAGE

  • 5x SDS-PAGE ladingsbuffer (Laemmli ladingsbuffer): Dit mengsel wordt aan de eiwitstalen toegevoegd en bevat vijf cruciale componenten:

    • β-mercaptoethanol: reduceert zwavelbruggen (covalente binding) in opgevouwen eiwitten, zorgt voor volledige denaturatie

    • Tris-HCl (pH 6,8): bufferende component met dezelfde pH als stacking gel

    • SDS: zorgt voor de verdere eiwitdenaturatie en voorziet alle eiwitten van een uniforme netto negatieve lading

    • bromofenolblauw: kleurstof die sneller migreert dan de eiwitten en gebruikt wordt om het migratiefront visueel te volgen

    • glycerol: verhoogt dichtheid staal zodat het bij het laden niet uit het slotje drijft

  • 10x elektroforesebuffer (loopbuffer): buffer die de tank vult, bestaat uit 60 g Tris, 144 g glycine en 10 g SDS, opgelost in 10 L gedestilleerd H2O met een pH van 8,3

  • Kleurvloeistof: gebruikt na de elektroforese en bevat 2,5 g Coomassie Brilliant Blue, 45 (v/v) % ethanol en 9 (v/v) % azijnzuur in water

  • Ontkleuringsvloeistof: bevat 5 v/v % ethanol en 7,5 v/v % azijnzuur

opm; extra uitleg over verschil stacking- en scheidingsgel, zie “onderzoekslijnen & sops”