Notatki z transkryptu o strukturze białek

Wprowadzenie do struktury białek

  • Rola białek w organizmie:
    • utrzymanie struktury komórki: białka strukturalne, błony komórkowe i elementy włókniste (np. cytoszkielet) oraz struktury zewnątrzkomórkowe (np. kolageny)
    • aktywność metaboliczna: obecność białek enzymatycznych katalizujących reakcje chemiczne
    • ekspresja genów: liczne białka kooperują z kwasami nukleinowymi w procesach takich jak replikacja DNA, synteza RNA i synteza białka

Izomery aminokwasów

  • Izomery absolutne aminokwasów występujące w białkach to L-izomery; izomery D są ich lustrzanymi odbiciami (Rys. 2-7)
  • Szczególny fragment: łańcuch boczny (R) różnie odmienia chemicznie w zależności od aminokwasu

Jonizacja aminokwasów i punkt izoelektryczny (pI)

  • Jonizacja alaniny (BOX 2.1) – procesy jonizacji na różnych pH:
    • pk(a) karboksylowej α-COOH = 2.3
    • pk(a) amino α-NH3+ = 9.9
    • pI (alanina) =
      pI = rac{pK{a( ext{carboxyl})} + pK_{a( ext{amino})}}{2} = rac{2.3 + 9.9}{2} = 6.1
  • Rys. 2.1– krzywa titracyjna alaniny: dwie strefy buforujące – przy pH≈2.3 (grupa karboksylowa) i ≈9.9 (grupa amino)
  • Ionizacja kwasów asparaginowego (asparaginowy) i lizyny (lizyna) – zmienne stany jonizacji w zależności od pH; izoelektryczny punkt (pI) dla asparaginowego ≈ 2.95, dla lizyny ≈ 10.0 (zob. Fig. 2.2)
  • Charakterystyka jonizacji w pH niskim, wyższym:
    • pH 1.0 (bardzo kwaśny): COOH pozostaje niezestryfikowana; NH3+ na końcach amino
    • pH 2.95 (dla kwasu asparaginowego) – punkt izoelektryczny dla tego aminokwasu
    • pH 6.95 – różne stany utleniania/utleniania reszt
    • pH 11.0 – deprotonacja wielu grup
  • Ogólne wartości pK (zestawione w Tabeli 2.1 i Box 2.1):
    • kwasy karboksylowe: typowe pK około 2–4; kwasy B-karboksylowe mają własne wartości (np. Asp 3.9)
    • kwasy aminowe: typowe pK około 9–11 dla α-NH3+; dodatkowe grupy zasadowe (np. e-aminowe w resztach bocznych) mają własne pK (np. Lys ≈ 10.8)
    • wartości pK zależą od temperatury, siły jonowej i mikrośrodowiska grup jonizujących

Struktura białek – konformacja i ładunki

  • Konformacja białka = kształt cząsteczki, przestrzenne ułożenie atomów; utrata konformacji prowadzi do utraty właściwości biologicznych
  • Struktura I-rzędowa (forma) = liniowa sekwencja aminokwasów związanych wiązaniami peptydowymi
    • zawiera także kowalencyjne wiązania dwusiarczkowe między resztami cysteiny, które sąsiedują się w przestrzeni, ale niekoniecznie w sekwencji liniowej
  • Jednostka peptydowa (ramka) – charakter płaski i sztywny; długości wiązań ~
    • C–N ~ 0.132 ext{ nm}
    • C=N ~ 0.127 ext{ nm}
    • C–N (peptydowe) ~ 0.149 ext{ nm}
    • Wiązanie peptydowe ma częściowy charakter podwójnego (sztywna płaszczyzna) i ogranicza ruchy; wokół wiązań Cα–N i Cα–C (łańcuch główny) występuje swoboda rotacji
  • Konformacja II-rzędowa: regularne pofałdowanie łańcucha polipeptydowego; dwie główne struktury II-rzędowej:
    • α-helisa
    • β-struktura (β-nitka) – nici β
  • Modele prawa: prawoskrętna helisa; stabilizowana przez wiązania wodorowe NH–CO w obrębie helisy; w β-strukturach wiązania wodorowe między NH a CO między różnymi resztami
  • Konformacja dipeptydu i łańcucha β: odcinki z równoległymi i antyrównoległymi układami w β-strukturze; dipeptyd w typie B-łańcucha ma cechy charakterystyczne dla stabilizacji przez wiązania wodorowe
  • Struktura III-rzędowa: całkowite zagięcie łańcucha, dotyczy przestrzennego ułożenia reszt zarówno bliskich, jak i odległych w sekwencji; przykład: mioglobina
  • Struktura IV-rzędowa: białka z co najmniej dwoma podjednostkami; wzajemne ułożenie przestrzenne podjednostek i typy interakcji między nimi; przykład: hemoglobina

Przykłady i ilustracje konformacyjne

  • Przykłady domen białek: struktury II-rzędowe w domenach kinazy fosfoglicerynianowej i kinazy pirogronianowej (ilustracje Fig. 2.8)
  • Struktura globularnych domen: połączenie α-helis i β-pleated sheets (oddzielone niehelical częściami)
  • Struktura mioglobiny (III-rzędowa): domena z hema; dwie helisy α i reszta; aminokwas histydynowy ściśle powiązany z grupą hemową
  • Wnętrze mioglobiny – niepolarne łańcuchy boczne; interior protein entirely nonpolar
  • Struktury enzymów trawiących RNA – rybonukleaza A – złożone konformacje; przykładowo helisy α w kolorze czerwonym

Właściwości i techniki badawcze dotyczące białek

  • Widmo UV typowe dla białek i kwasów nukleinowych (Fig. 2.11):
    • szczyt przy ext{λ} ext{(protein)} o 280 ext{ nm} z powodu bocznych łańcuchów aromatycznych tyrozyny i tryptofanu
    • kwasy nukleinowe absorbują przy ext{λ} o 260 ext{ nm} ze względu na aromatyczne zasady puryn i pirymidyn
  • Wpływ soli i pH na rozpuszczalność białek (Fig. 2.10):
    • w wodzie bez soli białko tworzy mostki soli między sobą i wytrąca się (niepruszczalne)
    • w 5% NaCl jony soli pokrywają powierzchze ładunkowe białek, ograniczając tworzenie międzycząsteczkowych soli i redukując wytrącanie
    • zbliżenie do pl powoduje tworzenie soli międzycząsteczkowych; przy pH ≈ pl dominują interakcje elektrostatyczne, co sprzyja agregacji
  • Rozdział białek – metody purifikacji:
    • dializa – przepuszczanie przez porowitą membranę małych cząsteczek i jonów; w roztworze bogatym w białko i buforze jony i małe cząsteczki odlatują, duże białka pozostają
    • filtracja żelowa (sączenie molekularne): rozdział na podstawie wielkości cząsteczek w żelu
    • chromatografia jonowymienna: rozdział na podstawie ładunku elektrostatycznego
    • chromatografia powinowactwa: rozdział na podstawie specyficznego powinowactwa do ligandu
  • Elektroforeza – różne techniki:
    • elektroforeza na żelu SDS-PAGE (elektroforeza w żelu z SDS): denaturuje białka i rozdziela według masy cząsteczkowej; żel poliakrylamidowy; zabarwienie umożliwia ocenę przebiegu
    • elektroforeza na włóknach (na papierze/celulozowym) – rozdział według ładunku netto; przy pH 8,6 białka są ujemnie naładowane i przemieszczają się w kierunku anody
  • Edman degradowanie – sekwencjonowanie białek: proces polega na usuwaniu aminokwasów jeden po drugim w cyklach; PTH-aa (fenylotiokarbamamonian) identyfikowany chromatograficznie; umożliwia sekwencjonowanie etapami
  • Inne techniki: pomiar aktywności UV, kształt domen, klasyfikacja interakcji bocznych w analizie sekwencji

Znaczenie poznania sekwencji aminokwasów w białkach

  • Dlaczego sekwencja aminokwasowa jest ważna?
    • dostarcza informacji o strukturze I-rzędowej
    • pozwala ustalić pokrewieństwo strukturalne między białkami (np. trypsyna i chymotrypsyna – rodziny proteaz serynowych, wspólny mechanizm katalityczny)
    • umożliwia porównanie sekwencji między gatunkami – wykrywanie pokrewieństwa ewolucyjnego
    • identyfikuje sekwencje sygnałowe odpowiedzialne za dojrzewanie i modyfikacje potranslacyjne
    • identyfikuje mutacje i ich rolę w chorobach
    • umożliwia uzyskanie przeciwciał specyficznych dla białka (badania struktury i funkcji)
    • prowadzi do otrzymania sond DNA specyficznych dla genów kodujących dane białko

Dodatkowe Boxy i przykłady konfiguracyjne

  • BOX 2.4 i BOX 2.5 – acetylo i amidacja końców łańcucha (acetylated amino terminus; amidated carboxyl terminus) – znaczenie modyfikacji końców sezonowych i ich wpływ na właściwości białek
  • BOX 2.1 – jonizacja alaniny: przykładowo stany jonizacji na różnych pH (ilustracja i wartości pK) – pomaga zrozumieć koncept pI i pH wpływające na ładunek cząsteczki
  • Rysunki i opisy dotyczące długości wiązań peptydowych, płaskości grupy peptydowej i ograniczeń rotacji wokół wiązań wokół atomów Cα–N i Cα–C
  • Rys. 2-31, 2-32, 2-33 – przykłady konformacji i układów β i helis w kontekście rzeczywistych białek

Uzupełniające przypomnienie: też podstawy logiczne

  • Każda z czterech warstw organizacji białek ma swoją rolę w funkcji i stabilności:
    • I-rzędowa: sekwencja aminokwasów
    • II-rzędowa: lokalne powłoki z helis α i β-nici
    • III-rzędowa: całościowe złożenie łańcucha – natężenie, torowanie funkcji (np. mioglobina)
    • IV-rzędowa: interakcje między podjednostkami (np. hemoglobina)
  • Ogólne zasady: konformacja i stabilność białka zależą od interakcji bocznych, w tym interakcji hydrofobowych, wiązań wodorowych, mostków jonowych (salt bridges) i czasem wiązań kowalencyjnych (np. disiarczkowych)
  • Znaczenie praktyczne: zrozumienie konformacji pomaga wyjaśnić mechanizmy katalityczne, transport gazów (mioglobina), a także diagnostykę i projektowanie leków