Biologia Molecolare della Cellula - Metilazione del DNA ed Elementi Ripetuti

Definizione: Modificazioni dell'attività genica che non alterano la sequenza del DNA ma sono ereditabili e resettabili.
Meccanismi:
- Modificazione degli istoni: aggiunta di gruppi metilici, acetilici, fosfato alle code istoniche.
- Metilazione del DNA.

Generalmente avviene a livello della citosina.
Soprattutto in dinucleotidi CG (o CpG, dove P indica il legame fosfato).
Nell'uomo, circa il 5% delle citosine sono metilate, e il 60-80% si trovano in sequenze CG/CpG.
Enzimi coinvolti: metiltrasferasi.
Marker epigenetico ereditato dalla progenie.
Presente su entrambi i filamenti del DNA.
Replicazione:
- DNMT1 (DNA metiltrasferasi 1 o metiltrasferasi di mantenimento) riconosce e copia i residui metilici sui nuovi filamenti.
- Essenziale per il mantenimento della metilazione e per la metilazione de novo.

Knockout: delezione di una proteina specifica (es. tramite CRISPR).
Knockdown: riduzione dell'espressione di una proteina (es. tramite RNA interferenza).
Distrofia muscolare di Duchenne: mutazione che causa un codone di stop prematuro, producendo una proteina tronca non funzionale.

La metilazione delle citosine riduce il legame dei fattori trascrizionali, silenziando il gene.
Coinvolgimento delle methyl binding proteins per il silenziamento trascrizionale.

Citosina → Uracile
5-metilcitosina → Timina (non riconosciuta come esogena dai sistemi di riparazione del DNA).
Nel tempo, i dinucleotidi CG metilati diventano dinucleotidi TG.
Evolutivamente, la metil-citosina viene persa.

Distribuzione disomogenea nel genoma.
Densità dieci volte superiore alla media in regioni specifiche.
Lunghezza media di circa 1000 paia di nucleotidi.
Il genoma umano contiene circa 20.000 isole CG.
Il 60% dei geni umani codificanti proteine ha promotori incorporati nelle isole CG, inclusi i geni housekeeping.

Feedback positivo o negativo tra metilazione del DNA e metilazione delle code istoniche.
Modelli:
- Metilazione del DNA → Metilazione istonica:
  - Metilazione del DNA tramite metiltransferasi de novo.
  - Deacetilazione tramite istone-deacetilasi e legame di MBD.
  - Metilazione delle code istoniche tramite HMT1 e HP1.
- Metilazione istonica → Metilazione del DNA:
  - Aggiunta di gruppi metilici alle code istoniche.
  - Reclutamento di istone metiltransferasi.
  - Metilazione del DNA.
- Metilazione indotta da fattori trascrizionali:
  - Fattori trascrizionali e chromatin remodeling factors inducono la metilazione del DNA e delle code istoniche.

Mutazione nel gene MECP2 (Methyl-CpG Binding Protein 2).
Legata al cromosoma X, quasi sempre dovuta a mutazioni de novo.
Incidenza: circa 1 su 10.000 abitanti.
Colpisce principalmente le femmine (eterozigoti), letale nei maschi (emizigoti).
Sintomi: disturbi del linguaggio, coordinazione, movimenti ripetitivi simil-autistici.
Non è tessuto-specifico, ma i sintomi sono principalmente neurologici.

Immunoprecipitazione: utilizzo di anticorpi specifici per 5-metilcitosine, seguita da microarray.
Sequenziamento con bisolfito: conversione delle citosine non metilate in uracili, lasciando intatte le 5-metilcitosine.

Cruciale nei processi di gametogenesi e sviluppo embrionale.
Onde di metilazione durante la gametogenesi.
Demetilazione dopo la fecondazione (passiva negli spermatozoi, attiva nelle donne).
DNMT1 è reclutata nel nucleo durante lo sviluppo della blastocista, ripristinando i livelli di metilazione.

5-idrossimetilcitosina (5hmC) prodotta da proteine TET (Ten eleven translocation).
Ulteriori ossidazioni portano a 5-formilcitosina (5fC) e 5-carbossicitosina (5caC).
Queste modificazioni sono riconosciute come non self dai sistemi di riparazione del DNA e vengono eliminate, riformando la citosina non metilata.

Elementi di DNA che si muovono per trasposizione.
L'enzima trasposasi inserisce il trasposone in un nuovo sito bersaglio.
Frequenza di movimento controllata (circa ogni $10^5$ divisioni cellulari nei batteri).
Classificazione:
- Trasposoni a DNA.
- Retrotrasposoni simili ai retrovirus.
- Retrotrasposoni non retrovirali.

Considerati inizialmente junk DNA, costituiscono gran parte del genoma in alcuni organismi (es. mais).
Trasposoni a DNA:
- Sequenza codificante per la trasposasi.
- Regioni fiancheggianti con sequenze invertite.
Retrotrasposoni simili a retrovirus:
- Regione codificante per la trascrittasi inversa e integrasi.
- Sequenze ripetute alle estremità (non invertite).
Retrotrasposoni non retrovirali:
- Codificano per la trascrittasi inversa ed endonucleasi.
- Necessitano di una regione promotrice adiacente per la trascrizione.

Più diffusi nel genoma batterico.
Possono essere trasferiti all'interno della cellula o tra cellule.
Possono contenere geni di resistenza agli antibiotici, contribuendo alla resistenza batterica.

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