Celcultuur
Inleiding
==Wat zijn de voordelen van cel- en weefseltechnologie?==
- controle van de omgeving
- fysiochemische parameters: pH, temperatuur, osmotische druk, zuurstof en koolstofdioxide
- fysiologische parameters: voedingsstoffen (+ percentage serum)
- temp: incubator +- 1graad
- verschillende kikkers=> verschillend bloed
- pH: neutraal bij mens, cellen klein pH bereik => strenge controle
- osmotische druk isotoom bv NaCl 0,9%, lucht 21% O2 en 0,03% CO2
- buffer: bicarbonaat
- alles strikt gecontroleerd => stabiel houden van omgeving
- karakterisatie en homogeniteit
- redelijk homogeen
- opletten bij passage: aanmaak cryostok
- cellen isoleren bv enkel fibroblasten → andere eigenschappen door fleswisseling
- overbrengen 1 cultuurfles naar andere, anders cellen dood
- cellen los door trypsine
- slechts deel overbrengen: andere fles experimenten of met trypsine losmaken en invriezen in vloeibare stikstof
- na aantal passages cellen slecht en oud
- niet telkens terug cryostok nemen, want anders steeds verschillende cellen dan oorspronkelijke
- als cellen oud zijn groeien ze heel traag => terug jonge cellen uit cryostok
- cryostok: uit jonge cellen die nog dicht bij oorspronkelijke zijn, lijken nog op oorspronkelijke, (3-4 passages), na 40 geen zin meer, overleven niet
- eig veranderen, dus verschillende uitkomsten
- kostprijs (vs proefdierexperiment)
- miniaturisatie: kleine hoeveelheden monster en reagentia
- proefdier experimenten heel duur
- goedkoop, proefdier duurder en meer exp met kleine hoeveelheid, weinig reagentia
- Ethiek
- geen proefdier
- geen opoffering
- kan je ook kopen
==Wat zijn de beperkingen van cel- en weefseltechnologie?==
- expertise
- aseptisch werken
- tragere groei dan meeste bacterien en schimmels
- moeilijk om kiemvrij te houden, vaak besmetting (aseptisch= zonder besmetting)
- hoeveelheid
- laboschaal: max 10^9 cellen => gram cellen
- industriele schaal vereist opschaling
- max 1 gram is te weinig
- moeilijk om in labo grote hoeveelheid te maken
- industrie: heel moeilijk onder controle, opschaling veel problemen bv grotere vat
- minder O2 in suspensie, kunnen kapot gaan wegens rondzwieren tegen wand
- instabiliteit
- normale cellen, beperkte levensduur ( senescentie)
- bepaalde levensduur, sterven af
- tumor cellen?
- cultuuromgeving vs in vivo
- 2D (in vivo: 3D) (bv. in lichaam verbonden aan weefsel)
- cel-cel en cel-matrix interacties
- cellen zijn beweeglijk
- snelle celdeling ( snelle groei wegens extreme goeie omstandigheden)
- 1 of 2 celtypes blijven over ( trage groeiers niet verspreid)
- oversimplificatie van cultuurmedium ( geen neurotransmitters, O2 concentratie lager)
- zenuwtelsel en endocriene organen ontbreken
- cellulaire metabolisme is meer constant ( overleven van cellen die snel en weinig eten)
- energiemetabolisme: glycolyse ( minder citroenzuurcyclus, meer energie)
Definities
==Bespreek orgaanculturen==
- voordeel: cellulaire interacties
- nadelen :
- telkens vers weefsel nodig
- reproduceerbaarheid
- angiogenese: bloed uit bloedvaten
- placenta makkelijk BV vormen
- niet rigide=> cultuurmedium en fibrine
- belangrijk dat voedingsstoffen er zijn
- incubatie => uitgroei BV
- probleem orgaanculturen: altijd vers weefsel, altijd verschillend
- controle inbouw bij experiment
- weefsel in cultuur blijven houden en experiment uitoefenen
==Bespreek explant culturen==
= rechtstreeks geisoleerd uit organisme
bv huidbiopten, spierbiopten en tumorweefsel
- Werkwijze
- chirurgisch uitsnijden → grote hoeveelheid weefsel
- naaldbiopt
- Voordelen:
- cel-cel en cel- matrix interacties behouden
- makkelijk manipuleerbaar
- nadelen:
- beperkt houdbaar
- cellen kunnen de-differentieren
- weefsel niet volledig behouden, welke cellen groeien eruit hechten aan plastic
- cellen aan buitenkant en plastic contact → eruit groeien
- weefsel beperkt houdbaar
- cellen die eruit komen kunnen de-differentieren → eigenschappen van cellen veranderen
- bv spiercel moet controleren , niet mogelijk: eigenschap weg, niet meer uitvoeren, leeft gewoon, specifieke eigenschappen kwijtraken
==Bespreek primaire celculturen==
= cellen rechtstreeks afkomstig van een bepaald orgaan of weefsel, meestal een heterogene mix van verschillende celtypes
- Voordelen
- Co-cultuur → cel-cel interacties
- ene celtype kan groeifactoren uitscheiden voor andere celtype
- Nadelen
- instabiel
samenstelling van primaire cultuur veranderd in tijd
- Groeien in celcultuur → niet meer de eerste, maar 2e, 3e,
- mix bv placenta, spiercellen, BW-cellen
- dichter bij in vivo want verschillende soorten in interactie
- weefsel → prim celcultuur, scheiden groeifactoren uit → ver van oorspronkelijke situatie, overheersing van 1 type → instabiel, cellen kunnen veranderen en samenstelling ook
==Bespreek eindige celculturen==
- na subcultivatiev prim celcultuur
- beperkt aantal celdelingen na in kweek brengen
- verkorting uiteinde van chromosomen (telomeren) na celdeling
- <→ stamcellen: verhoogde expressie van telomerase
- max 60 keer delen = Hayflick limiet
- bep einddatum
- groei stopt doordat telomeren zijn op chromosomen en korter worde
==Bespreek geimmortaliseerde cellijn==
cellen die oneindig lijken te delen
= continue cellijn => monolaag of celsuspensie
- onstaan
- in vivo (kankercellen)
- spontaan (mutaties)
- geinduceerd ( transformatie)
- continue cellijn blijven groeien
- tranfsormeren
- bv virus, hybridoma (kankerverwekkende stof)
- cel scheiden
- in cultuurfels
- normale cel groeit, monolaag
==Bespreek organotypische celculturen==
- gedeeltelijke reassociatie om 3D structuur te creeren
- creeren van model voor cell interacties
- geen weefselstructuur
- probleem normale cellen
- groeien 2D
=> bouwpakket voor 3D structuur
- van vivo naar vitro
- geen BW, gwn 2 cellagen boven mekaar
- filter-wall insert
==Bespreek de cel- en weefselculturen==
org cultuur na gebruik in vuilbak
prim cultuur: cellen uit weefsel
- explant cultuur of in stukjes verdelen van weefsel
- ook prim celcultuur, maar gedisspcieert, mengcultuur
- bij beiden krijg je cellen
- => subcultivatie/passeren naar nieuwe cultuurfles
- normaal→ oneindig => transformeren
==Bespreek de evolutie van een cellijn==
- deel cellen dood door uit weefsel in cultuur
- afdode,→ daling aantal cellen
- knik→ rechte lijn
- begin inmengcultuur
- na 1-2 => 1 celtype alleen aanwz => rechte lijn
- 1 groeit goed=> cellijn
- knik naar boven
- senesecentie: telomeren delen niet meer, niet meer goed groeien, celdood
- voorkomen
- 1) in begin cryostok maken wnnr je 1 type cel hebt
- 2) nieuw weefsel => veel variatie
- 3) transformatie: continu maken => rechte lijn met hogere groeisnelheid
Soorten cellen en culturen
==bespreek het migreren van cellen uit weefsel==
- voordelen
- meeste cellen migreren (vnl embryonale cellen)
- nuttig bij kleine hoeveelheden weefsel
- nadelen
- slechte adheieve eigenschappen van sommige cellen
- selectie op basis van uitgsroei
- procedure
- breng weefsel in petriplaat en was met steriel PBS
- snijdt weefsel in stukjes van 1mm
- cellen migreren uit weefsel => explant cultuur
- trypsine aggresief=> weinig cellen
- in cultuurfles weinif cellen => nooit uitgroeien tot monolaag, gwn uitsterven
- klein weefsel beter explant cultuur
- nadeel: alleen buitrnkant zal groeien
- PBS : fosfaat gebufferde zoutopl
- isotone opl op neutrale pH
- vet wegsnijden => stukje met cellen buiten anders niet goedd vasthechten
- 25m fles: opp waar cel op groeit
- overnacht incuberen met dunne laagje 40% serum
- veel serum: overmaat tov cellen
- alle cellen even veel kans om te groeien en aanhechte
- afhalen en nieux medium met 10-20%
- plaats waar cellen vasthechten = substraat
- na 1w cellen los=> selecteren en in cultuur
- cellen migreren uit weefsel
==geef de celdissociatie technieken en bespreek ze==
mechanisch: procedure
- met scalpels → zeven → op en neer zuigen met pipet of naald (trituratie)
- voordeel: ideaal voor zacht weefsel
- nadeel: lage opbrengst
- met 2 scalpels: weefsel zeven
- kleine sukjes met cellen
- trituratie: met pipet op en neer zuigen stukje xeefsel
- => mech krachten => botsen en los geraken
- BSS= balans salt solution: isotoon
- goed voor hersenweefsel
- voordeel: weinig beschadigen
- <→ niet alle cellen komen los
- lage opbrengst
enzymatisch
- trypsine : 2 methoden
- warm en koud
- eiwitbrug kapot door trypsine
- calc soms gebroken door EDTA
warme trypsine od trypsine -EDTA
- trypsine = protease
- EDTA= chelator van Ca en Mg
- voordeel:
- op koerte tijd veel cellen
- meer representatief voor weefdel
- nadeel:
- bij langere tijd celschade
- moeilijk bij oud weefsel
- collagenese, hyaluronidase
- enzym. cellen losmaken
- hoog rendement
- cellen aan binnenkant ook los
- meer representatief