STRATEGIE CATALITICHE
Gli enzimi impiegano uno o più dei seguenti meccanismi di catalisi:
catalisi covalente: l’enzima forma temporaneamente un legame covalente con il gruppo funzionale attivo del substrato;
catalisi acido-base: vengono forniti o estratti protoni dal substrato, forniti da molecole di acqua o dalle catene laterali dei residui circostanti;
catalisi per distorsione/prossimità/orientamento: la distorsione avviene in reazioni unimolecolari, la prossimità e l’orientamento in reazioni bimolecolari;
catalisi da metalli, con effetti elettrofilici di diverso tipo (ridistribuzione di carica, promozione di reazioni redox, formazione di nucleofili a livello dei substrati);
Idrolasi
Le idrolasi sono una classe di enzimi che catalizzano le reazioni di tipo 3, reazioni di idrolisi dove una molecola di acqua partecipa alla rottura del legame. Più nello specifico le nucleasi idrolizzano il legame fosfodiestere, le peptidasi il legame peptidico, le glicosilasi il legame O-glicosidico e le lipasi il legame estere. Possono essere di tipo endo- se tagliano legami all’interno della catena o eso- se rimuovono residui terminali.
Ribonucleasi A
Si tratta di un piccolo enzima digestivo globulare formato da ponti disolfuro (quando si rompono si denatura molto rapidamente). Presenta un piccolo solco che gli permette di raccogliere la catena e posizionare il legame da idrolizzare nel sito catalitico.
Sito catalitico
2 istidine, che possono agire sia da residui acidi che basici avendo un pka molto vicino al neutro. Una è deprotonata e neutra e agisce come proton accettore, mentre la seconda è protonata e agisce come proton donatore.
1 lisina, che può formare legami H multipli;
Selettività
Agisce sia da esonucleasi che da endonucleasi. Taglia dal lato 3’ di basi pirimidiniche (timina e citosina) e non idrolizza filamenti di DNA.
Meccanismo d’azione
VEDERE APPUNTI
La carica positiva della RNasi A giace principalmente in un solco profondo tra i due lobi. L'RNA substrato giace in questo solco e viene tagliato da due istidine catalitiche, His12 e His119, attraverso intermedio fosfato 2'-3' ciclico che è stabilizzato dalle lisine vicine, Lys7, Lys41 e Lys66.
Chimotripsina
Si tratta di un enzima facente parte della classe delle serina proteasi, fondamentali per la digestione del materiale proteico e caratterizzate dalla presenza della serina, avente un ruolo chiave nella catalisi. E’ una piccola proteina globulare con un solco nel quale si inserisce la catena proteica da idrolizzare. E’ ampiamente formato da beta foglietti distorti. E’ prodotto dal pancreas come zimogeno (inattivo), pertanto viene attivato solamente a livello del duodeno da un taglio proteolitico.
Sito catalitico
serina
istidina, protonata, forma un legame H molto forte con l’aspartato e un secondo legame con il gruppo OH della Serina. Il residuo di His serve a posizionare e
polarizzare il gruppo OH della serina stessa per renderlo disponibile alla
deprotonazione e formazione dello ione alcossido, un migliore nucleofilo rispetto a -OH.
aspartato, carico negativamente e dunque buon proton accettore
Selettività
E’ un’endopeptidasi che taglia selettivamente dopo residui aromatici (fenilalanina), poichè la sua tasca è ampia e foderata di residui idrofobici.
La tripsina ha una tasca molto profonda e relativamente idrofobica con all’interno un aspartato, pertanto taglia dopo lisina e arginina, grandi e cariche positivamente. Se sostituissi l’aspartato l’enzima continuerebbe a fare catalisi perchè non si è agito sul sito catalitico in sé. Ciò che cambierebbe sarebbe la selettività di taglio (Asp —> Val: taglia dopo residui idrofobici, Asp —> Lys: seleziona piccole catene anioniche). L’elastasi taglia invece dopo alanina, poiché alcuni residui si sono intromessi nella tasca rendendola molto piccola e idrofobica.
Meccanismo d’azione
Molto complesso, avviene in due fasi: acilazione e deacilazione. Coinvolge la formazione di un legame covalente temporaneo, una catalisi acido-basica, alcuni effetti sterici e la stabilizzazione dell’intermedio tetraedrico attraverso mediante il buco dell’ossianione.
Evoluzione
Chimotripsina, tripsina e elastasi sono prodotti di evoluzione divergente, ovvero un gene ancestrale si è evoluto per sviluppare tasche diverse. Si tratta di proteine eucariotiche omologhe. La subtilisina è invece una proteina batterica con meccanismo simile, prodotto dell’evoluzione convergente. Questo enzima ha una struttura primaria molto differente da quella della chimotripsina, ma la triade catalitica ha una posizione spaziale e un sito di legame molto simili nelle due.
Metodi di studio (di tutte le serina proteasi)
Viene utilizzata la mutagenesi sito-specifica che conferma il ruolo della triade catalitica. Vengono mutati i residui chiave in alanina, una serina senza gruppo -OH, quindi inattiva.
Ser —> Ala: crollo di molti ordini di grandezza dell’attività catalitica
His —> Ala: crollo simile al precedente (=anche l’istidina svolge un ruolo importante)
Asp —> Ala: crollo minore
Ser, His, Asp —> Ala: crollo dell’attività ma non del tutto
La cinetica di catalisi viene seguita con substrati cromogenici o fluorogenici. I cromogeni sono molecole che contengono un gruppo incolore nel substrato che diventa colorato nel prodotto. Molte proteasi idrolizzano esteri, pertanto per lo studio può essere utilizzato l’N-acetil-fenilalanina-p-nitrofenil estere, che viene scisso dall’enzima e libera p-nitrofenil estere, che si colora. E’ poi possibile utilizzare uno spettrofotometro. Si possono usare anche altri peptidi modificati per renderli cromogenici, come nel caso dell’effetto FRET. Il peptide modificato ha un residuo che assorbe luce e uno che dovrebbe emetterla ma per effetto FRET non lo fa. La fluorescenza è visibile se si ha una molecola che assorbe luce e poi la riemette. Non è percepibile se questa trasferisce luce al solvente o a un’altra molecola che funziona da quenciante. Il taglio proteolitico permette di notare la fluorescenza.
Transpeptidasi batterica
La transpeptidasi batterica è un enzima responsabile della costituzione dei legami crociati che si formano per rafforzare la struttura del peptidoglicano, una molecola presente nella parete dei batteri gram positivi e in piccola parte nei batteri gram negativi. Il peptidoglicano è formato da una catena di oligosaccaridi. Su uno ogni due zuccheri è legato covalentemente un piccolo peptide non proteinoginico. Si ha inoltre la presenza di tetrapeptidi, legati tra loro da pentapeptidi di glicina.
Meccanismo simile alle serina proteasi
Questo enzima ha una serina nel sito catalitico che forma un legame covalente al carbonile tra le due alanine. Si forma inoltre un intermedio tetraedrico.
Cisteina proteasi
Usano il gruppo reattivo sulfidrilico della cisteina per formare un legame covalente transiente con il sito di legame (carbonio carbonilico del legame peptidico) che devono scindere. Non è più presente una triade catalitica ma un’istidina che rende reattivo il gruppo -SH. Alcuni esempi di questa tipologia di enzima sono la papaina e la caspasi.
Aspartil proteasi
Attivano direttamente l’acqua idrolitica tramite l’utilizzo di due aspartato, i quali deprotonano la molecola di H2O. Tra di essi si annovera l’aspartico proteasi di HIV.
Struttura
Si tratta di un enzima omodimerico formato da due catene identiche che si associano tra loro formando una struttura quaternaria. Ha una struttura simmetrica, piatta e a ciambella con un tunnel al suo interno nel quale si posiziona la catena da scindere. Il peptide viene abbracciato nel sito catalitico dai due lembi, che si chiudono grazie alla presenza di una molecola di acqua strutturale che costituisce un ponte di legami a idrogeno. Sono presenti tre subsiti di legame all’interno dei quali sono contenuti residui del substrato (fenilalanina, prolina e glutammato).
Selettività
E’ un’endopeptidasi.
Sito catalitico
E’ costituito da due aspartati che però si comportano in modi diversi: uno è protonato (forte proton donatore), l’altro invece è deprotonato (forte proton accettore).
Meccanismo d’azione
A seguito dell’attivazione dell’acqua si forma un intermedio di transizione detto gem diolo (presenza di due gruppi -OH sullo stesso carbonio), altamente instabile. Avviene la scissione e infine viene ripristinato il sito catalitico.
La struttura dell’intermedio è di fondamentale importanza per progettare inibitori di questo bersaglio terapeutico. Inoltre il legame peptidico da idrolizzare viene sostituito con uno non idrolizzabile, mentre la dimensione dell’inibitore è ridotta al minimo, riducendo la natura peptidica che potrebbe generare instabilità. Inibitori naturali come la statina non si sono rivelati efficaci. L’ammide ridotto, molto facile da sintetizzare, si è rivelato ugualmente inefficace. Gli inibitori più efficaci, entrambi artificiali, sono il diidrossietilene e il monoidrossietilene.
Metallo proteasi
Usano un cofattore metallico Zn2+ che lega con un legame di coordinazione la molecola di acqua. E’ presente nel sito catalitico ed estrae un protone dalla molecola di acqua che diventa reattiva agendo da nucleofilo. Un esempio di questo tipo di enzima è la carbossipeptidasi A.
Struttura
Si tratta di una zinco proteasi globulare dotata di una cavernetta sulla superficie.
Selettività
In tutti i casi si tratta di un’esopeptidasi che stacca residui dal C terminale.
carbossipeptidasi A: stacca un residuo terminale grosso, alifatico o aromatico;
carbossipeptidasi B: stacca residui carichi positivamente;
Sito catalitico
Lo zinco è caratterizzato da quattro legami di coordinazione: due istidine, un glutammato e una molecola d’acqua.
Coenzimi
Sono essenziali per l’attività catalitica degli enzimi coniugati. Possono essere di due tipologie:
coenzimi catalitici: partecipano alla reazione agendo nel sito catalitico. Hanno le stesse caratteristiche e concentrazione dell’enzima ma non ne sono trasformati.
coenzimi stechiometrici: partecipano alla reazione come substrati e sono presenti alla stessa concentrazione di esso. Sono modificati dalla reazione perché vengono trasformati in prodotti prima di essere riconvertiti.
La maggior parte dei coenzimi deriva da vitamine idrosolubili, che conferiscono loro la capacità di trasferire gruppi chimici o potenziale redox.
intermolecolari: sono navette per gruppi e tendenzialmente coenzimi catalitici;
intramolecolari: trasferiscono gruppi all’interno di un enzima o complesso e sono di tipo stechiometrico;
ATP (catalitico)
Si tratta di un donatore immediato di energia, dunque i livelli di ATP sono mantenuti costanti e manca una riserva. Ha un elevato potenziale di trasferimento di fosfato Pi o PPi perché quando viene liberato esso ha varie forme ed è stabilizzato per risonanza. Il trasferimento avviene però solo in reazioni catalizzate da chinasi. Il fosfato può inoltre essere trasferito con altri nucleotidi (citosina, guanina, uracile).
Per quanto riguarda la struttura si tratta di un nucleoside (adenina+ zucchero pentoso ribosio) a cui è legato in 5’ un trifosfato. E’ sempre accompagnato da Mg2+, un cofattore necessario al suo funzionamento.
NAD E NADP (stechiometrici)
Il NAD partecipa alle reazioni di ossidoriduzione: NAD+ è la forma ossidata, NADH quella ridotta. Trasporta contemporaneamente 2 elettroni e 1 protone. Le reazioni in cui agiscono sono principalmente usate per scopi bioenergetici, ovvero per mandare avanti la sintesi di ATP. Il NADPH viene utilizzato invece in reazioni di biosintesi riduttiva, ovvero per creare o modificare molecole necessarie alla cellula.
FADH E FMN (catalitici)
La molecola è costituita da tre anelli condensati, che formano il cosiddetto gruppo isoallosazinico della flavina, il quale è a sua volta legato al ribitolo tramite l'atomo di azoto (N) dell'anello centrale. La molecola, se presenta il gruppo OH del carbonio 5 legato al gruppo fosfato, prende il nome di Flavin Mono Nucleotide (FMN). Se l'FMN reagisce con un'altra molecola di ATP viene a formarsi il FAD. Questo coenzima manda avanti reazioni di ossidoriduzione dove capta 2 elettroni e 2 protoni. E’ in grado di captare un solo elettrone alla volta: FAD-FADH (semichinone, parzialmente ridotto)-FADH2 (completamente ridotto). E’ molto versatile.
PIRIDOSSALFOSFATO (PLP) (catalitico)
Si tratta di un coenzima molto versatile poiché stabilizza intermedi carboanionici molto reattivi e agisce come trappola di elettroni. La transaminazione:
Inizia con la formazione della base di Schiff con un residuo di Lys nel
sito attivo dell’enzima;
l’amminoacido entrante lo sostituisce;
viene deaminato ad alfa-chetoacido;
il gruppo amminico viene poi trasferito sull’alfa-chetoacido 2 per formare il nuovo amminoacido;