High Throughput Screening (HTS) dalam Penemuan Obat Baru

High Throughput Screening (HTS) dalam Penemuan Obat Baru

Prof. Dr. Apt. Roihatul Mutiah, M.Kes

Pengantar Drug

• Penemuan obat adalah proses kompleks dan multidisipliner.

• Tujuan: Menemukan senyawa baru yang efektif sebagai obat (misalnya, antitumor).

• Tantangan: Hanya 1 dari 1 juta senyawa yang berhasil menjadi obat yang dipasarkan.

HTS (High Throughput Screening)

• Sebuah metode dalam penelitian dan penemuan obat yang digunakan untuk menyaring dan menguji ribuan hingga jutaan senyawa kimia secara cepat dan efisien guna menemukan senyawa yang memiliki aktivitas biologis terhadap target tertentu, seperti enzim, reseptor, atau protein lain yang berperan dalam penyakit.

Proses Penemuan Obat

• Target discovery

• Target validation

• Assay development

• Screening

• Hit to lead

• Lead optimization

• Preclinical toxicology

• Non Clinical human trials

• Market evaluation

Kelebihan HTS

• Kecepatan tinggi: menghemat waktu penelitian.

• Kapasitas besar: ribuan hingga jutaan senyawa diuji.

• Reproduksibilitas tinggi karena otomatisasi.

• Memungkinkan identifikasi awal senyawa aktif (hits).

Tantangan HTS

• Biaya infrastruktur awal yang tinggi.

• Diperlukan validasi lanjutan untuk hasil yang positif.

• Banyak senyawa aktif palsu (false positives/negatives).

• Kompleksitas data membutuhkan analisis lanjutan.

Contoh 1: Isolasi Artoindonesianin Q-T (Isoprenylated Flavons) dari Artocarpus champeden (Phytochemistry, 61 (2002))

• Serbuk kayu (2,6 kg)

• Maserasi berturut-turut dengan n-heksana, CHCl3, MeOH

• Ekstraksi Heksana → Ekstraksi CHCl3 (30 g) → Ekstraksi MeOH

• Fraksinasi fase diam SiO2, eluen n-heksana-EtOAc

  • Fraksi A → Fraksi B (5 g) → Fraksi C → Fraksi D

• Fraksi I → Fraksi II → Fraksi III

• Purifikasi secara kromatografi radial Fase diam SiO2, Eluen PE, CHCl3, Aseton

  • Artoind. Q (45 mg) → Artoind. R (25 mg) → Artoind. S (7 mg) → Artoind. T (17 mg)

Contoh 2: Isolasi Geranylated Chalcon dari Artocarpus incicus (Phytochemistry 54 (2002))

• Serbuk daun (1,2 kg)

• Ekstraksi dengan Aseton

• Ekstrak Aseton (47 g)

• Suspensi dengan Air

• Partisi berturut-turut dengan n-heksana, eter EtOAc

  • Fr. n-Heksana (1,5 g) → Fr. Eter (7,2 g) → Fr. EtOAc → Fr. Air (1,3 g)

• Fraksinasi dengan kromatografi kolom terbuka Fase diam SiO2, Eluen n-Heksana-EtOAc secara gradien

  • Fr. Dari 70-90% EtOAc (0,5 g)

• HPLC preparatif Fae diam SiO ODS, eluen H2O-CH3CN

  • Geranylated Chalcon (239 mg)

Contoh HTS dengan Pendekatan Network Farmakologi

• Exploring the Therapeutic Potential of Oxo berberine Compound in Arcangelisia flava Root Extract for Breast Cancer Treatment: Metabolite Profiling, Pharmacological Network Analysis, and In Silico and In Vitro Evaluation

• Tujuan: Mengidentifikasi senyawa potensial dalam AFRE dan menjelaskan mekanisme kerjanya terhadap kanker payudara.

• Metode: Senyawa dalam AFRE diidentifikasi melalui LC-MS/MS. Software ADMET dievaluasi untuk absorpsi dan bioavailabilitas. Mekanisme anti-kanker molekuler diprediksi menggunakan network pharmacology dengan tools seperti Cytoscape, GeneCards, Disgenet, STRING, GO, KEGG pathways, dan SRplot. Interaksi antara oxo berberine dan key breast cancer receptors dianalisis melalui molecular docking dengan PyRx Autodock Vina dan Biovia Discovery Studio. Cytotoxicity diukur menggunakan metode MTT pada sel T47D, dan flow cytometry mengevaluasi potensi inhibisi siklus sel dan induksi apoptosis.

• Hasil: 16 senyawa aktif teridentifikasi melalui LC-MS/MS, dengan oxo berberine sebagai yang paling banyak (41.43%). Oxo berberine menunjukkan sifat anti-kanker dengan berinteraksi dengan 84 gen dan mempengaruhi 13 signaling pathways terkait dengan kanker payudara. Oxo berberine memiliki binding affinity yang lebih negatif dengan PI3KCA, TP53, BCL2, CDKI, EGFR, dan MAPK14 dibandingkan dengan native ligand.

• In vitro validation mendukung hasil ini, menunjukkan bahwa AFRE treatment menyebabkan lebih banyak sel T47D mati (36.6%) dibandingkan kontrol dan doxorubicin, serta lebih banyak sel berkumpul di fase G1.

• Kesimpulan: Oxo berberine dalam AFRE memiliki efek anti-kanker yang poten terhadap kanker payudara.

Contoh HTS untuk Penentuan Gen Target dan Pathway Potensial dari Suatu Tanaman

• Analisis senyawa menggunakan UPLC Qtof MS/MS

Hasil Analisis Senyawa

Table 1. The Results of Metabolite Identification of Arcangelisia flava Roots Extract Using UPLC Qtof MS/MS Method

Penentuan Sifat Fisikokimia Obat

Table 2. The Results of the Physicochemical Prediction of 16 Compounds in Arcangelisia flava Root Extract

Network Farmakologi, Senyawa Mentarget Gen yang Sama dengan Diseases

• Diagram menunjukkan hubungan antara senyawa, gen, dan penyakit (kanker payudara).
  Arcangelisia flava berpotensi menarget gen yang terkait dengan kanker payudara.

Gene Target Senyawa

Table 3. The Target Gene of the Compound in Arcangelisia flava Roots Extract and Relevance Score of Target Gene

Protein-Protein Interaction

• Diagram interaksi protein-protein untuk apoptosis, p53 signaling pathway, dan microRNAs in cancer.

Gene Onthology

• Menunjukkan biological process, cellular component, dan molecular function yang terkait dengan senyawa yang diteliti.

Penentuan Signaling Pathway Potensial

Table 4. Signaling Pathways with KEGG Enrichment Target Numbers Equal to or Greater than 10.

Penentuan Pathway Potensial

• PI3K-Akt Signaling Pathway

• Diagram jalur PI3K-Akt yang melibatkan 29 gen target potensial dalam pengobatan kanker payudara dengan ekstrak akar Archangelesia flava.

Validasi In Silico

Validasi In Vitro

• Analisis apoptosis dan distribusi siklus sel menggunakan flow cytometry.

• AFRE (Arcangelisia flava root extract) menunjukkan peningkatan cell death dan perubahan distribusi siklus sel pada sel kanker payudara.

Thank You

• Aidyn Zhanbolat | aidyn@adatum.com | www.adatum.com