BIAŁKA I METODY ICH ILOŚCIOWEGO OZNACZANIA

Białka:

- liniowe peptydy

- aminokwasy

Jest 20 typów aminokwasów

Atom węgla do którego się przyłączają aminokwasy to węgiel alfa

Aminokwasy zaweirają:

- grupę aminową ( -NH2)

- grupę karboksylową ( - COOH )

Połączone wiązaniami peptydowymi ( CONH ), między grupą aminową jednego aminokwasu, a grupą karboksylową drugiego aminokwasu.

Każdy aminokwas ma skrót 3 literowy

Białak są zbudowane od kilkuset - kilku tysięcy aminokwasów

N- koniec ( wolna grupa NH3+ )

C - koniec ( wolna grupa COO - )

Sekwencję białek podaje się od N - końca do C - końca

Białka proste i złożone

Połączenia:

2 x aminokwas = dipeptyd

> 2 x aminokwas = oligopeptyd i polipeptydy

Enzymy = białka katalizujące reakcje chemiczne

Cztery struktury białek:

1) PIERWSZORZĘDOWA

- struktura pierwotna

- cztery atomy w jednej płaszczyźnie nie mają swobodnej rotacji

2) DRUGORZĘDOWA

- pofałdowane

- beta - fałdowa struktura

- wiązania stabilizujące te strukture to wiązanie wodorowe ( między tlenem grupy karboksylowej jednego aminokwasu a wodorem grupy aminowej aminokwasu drugiego )

3) TRZECIORZĘDOWA

- oddziaływania jonowe, między grupami aminowymi/guanidynomwymi łańcuchów bocznych aminokwasów zasadowych, a grupami karboksylowymi aminokwasów kwaśnych

- hydrofobowe wystpujące pomiędzy łańcuchami bocznymi aminokwasów hydrofobowych

- wiązania dwusiarczkowe ( mostki disulfidowe )

4) CZWARTORZĘDOWA

- wzajemne ułożenie łańcuchów polipeptydowych

WŁAŚCIWOŚCI FIZYKO - CHEMICZNE BIAŁEK:

- biopolimery

- charakter wielkocząsteczkowy

- są związkami amfoterycznymi ( cząsteczka białka wykazuje ładunek elektryczny - to wielowartościowy jon )

- ulega wysalaniu

- wrażliwy na czynniki chemiczne i fizyczne ( denaturacja )

Kształty białka:

- białka globularne ( kształt kulisty, elipsodalny )

- białka fibrylarne ( pałeczkowaty, włokienkowy )

Budowa:

- białka proste ( tylko z aminokwasów )

- białka złożone ( aminokwasy i część nie aminokwasowa )

pI = punkt izoelektryczny aminokwasu

pH roztwpru w którym cząsteczka zachowuje się jakby nie była naładowana

rozpuszczalność białek jest najmniejsza ( najłatwiej wytrącić i wykrystalizować )

białka mają najmniejszą lepkość nie reagują z anionami i kationami

Jon obojnaczy aminokwau ( amfolit )

DENATURACJA BIAŁEK

- zmiany w konformacji łańcucha polipeptydowego

- zniszczenie/zniekształcenie struktury II, III i IV rzędowej białka

Czynniki denaturujące:

- kwasy - detergenty

- zasady - fenol

- jony metali ciężkich - chloroform

- mocznik - alkohol/aceton

- chlorowodorek guanidyny

METODY ILOŚCIOWEGO OZNACZANIA BIAŁEK

METODA BIURETOWA

Zasada:

im więcej wiązań peptydpwych tym intensywniejszy mkolor fioletowy uzyskuje próbka ( im więcej wiązań, tym więcej białek )

nazwa od biuretu, który przypomina białka i też zmienia kolor w połączneiu z jonami. Najlepiej jest ten kolor widoczny przy długości fali 530 nm

Zalety:

- wysoka specyficzność dla wszystkich białek

- prosta w wykonaniu

Wady:

- niska czułość

METODA BRADFORDA:

Na początku barwnik ma brązowy kolor, jak się połączy z białkami to zmienia kolor na niebieski

Czym mocniejszy kolor niebieski - tym więcej białek

Najlepiej pochłania światło o długości 595 nm

Zalety:

- prosta i szybka

- duża czułość

Wady:

- mała specyficzność wobec różnych białek

- detergenty dodają kolor

WSPÓŁCZYNNIKI ABSORBANCJI

Prawo Lamberta - Beera:

A= k x l x c

- współczynnik absorpcji pozwala ocenić czułość metody

- można wyliczyć stężenie absorpcji danej substancji w próbie badanej

CZUŁOŚĆ METODY

Im większa jest wartość (a), czyli im większą intensywność

zabarwienia w danej metodzie wykazuje kolorymetrowany

roztwór białka o stężeniu 1 mg/ml, tym bardziej czuła jest

metoda