Microscopía y Técnicas Histológicas

Microscopía y Técnicas Histológicas

Microscopía Electrónica de Transmisión (MET)

• Dirige un haz de electrones hacia la muestra.

• Los electrones que atraviesan la muestra forman una imagen en una placa fotográfica.

• La muestra debe ser cortada en capas finas, no mayores de un par de miles de ángstroms.

• Aumentos típicos: $60,000X$, $1,500X$

Microscopía Electrónica de Barrido (MEB)

• El haz de electrones recorre toda la muestra.

• Los electrones se dispersan o provocan la aparición de electrones secundarios.

• La imagen se genera contando los electrones perdidos y generados; cada punto corresponde a un píxel.

• Aumento: Hasta 200,000 veces mayor.

• Produce imágenes tridimensionales realistas.

• Aumentos típicos: $5,000X$, $20,000X$

Comparación entre Microscopios Ópticos y Electrónicos

Conceptos importantes

• Límite de resolución: Mínima distancia que tiene que haber entre dos puntos para que puedan distinguirse como dos puntos separados.

• Poder de resolución: Capacidad que tiene un instrumento para poder brindar imágenes distintas de puntos muy cercanos.

• Aumento: Es la relación entre el tamaño de la imagen y el tamaño del objeto en valores lineales

Microscopios Ópticos

• Fuente de luz.

• Sistema de lentes ópticos.

• Límite de resolución: micrómetros (μm).

• Aumento: Hasta 1000X.

• Imágenes 2D y 3D.

• Relativamente económico.

Microscopios Electrónicos

• Fuente de electrones.

• Bobinas electromagnéticas.

• Límite de resolución: nanómetros (nm).

• Aumento: Millones de veces.

• Imágenes 2D y 3D realistas.

• Costoso.

Selección del Microscopio Adecuado

• Depende del objetivo de la investigación.

• Consideraciones sobre presupuesto y escenario de uso.

Técnicas Histológicas

• Intravitales: Observación dentro del cuerpo.

• Supravitales: Las muestras crecen fuera del cuerpo (in vitro).

• Postvitales: Las células mueren durante el proceso, pero se conservan sus características morfológicas y moleculares.

Objetivo de las Técnicas Histológicas

• Observar y estudiar la estructura general o detallada de los componentes tisulares.

• Asegurar que las características observadas sean iguales a las que poseían en su estado vivo.

Proceso General de Preparación de Muestras Histológicas

1. Obtención de la Muestra

   • Porción de tejido vegetal, tejido animal, órgano, o animal completo.

   • Biopsia: De un organismo vivo.

     • Incisional: Sección de una lesión.

     • Excisional: Lesión completa.

     • Tipos de tejido: PAAF (punción aspiración con aguja fina), PAAG (punción aspiración con aguja gruesa), o citología exfoliativa.

   • Necropsia: De un organismo muerto.

2. Fijación

   • Inmersión o perfusión.

   • Congelación.

3. Inclusión

   • Resinas, parafina o celoidina.

4. Corte

   • Ultramicrotomo, microtomo, vibratomo, criostato, o microtomo de congelación.

5. Contraste

6. Tinción

7. Observación

   • Microscopio electrónico o microscopio óptico.

Autólisis y Putrefacción

• Procesos a evitar en la preparación de muestras.

Fijación

• Proceso para preservar las características morfológicas y moleculares de una muestra.

  • Mata las células y protege la muestra de ataques bacterianos.

  • Evita la autolisis.

  • Preserva elementos solubles.

  • Evita distorsiones y retracciones tisulares.

  • Endurece las muestras para facilitar el corte.

  • Protege la muestra de soluciones hipo e hiperosmóticas.

  • Proceso irreversible.

Tipos de Fijadores

• Físicos

  • Congelación rápida:

    • Isopentano enfriado con nitrógeno líquido ($-196 °C$).

    • Directo en nitrógeno líquido.

    • Hielo seco y acetona ($-70 °C$).

    • Helio líquido ($-268 °C$).

    • Uso de crioprotectores (DMSO, glicerol o sacarosa).

    • Criodisecación y criosustitución.

  • Calor:

    • Mayor probabilidad de deterioro.

    • Coagulación de proteínas y disolución de lípidos ($55 °C$).

    • Se utiliza en conjunto con un fijador químico para microorganismos y células sanguíneas.

• Químicos

  • Características a tomar en cuenta:

    • Velocidad de penetración y fijación.

    • Endurecimiento.

    • Ósmosis y pH.

    • Temperatura.

    • Efecto mordiente para facilitar la coloración.

    • Artefactos.

  • Por su acción en el tejido:

    • Coagulantes: Extraen agua y desnaturalizan las proteínas (ej., fijadores a base de alcohol como Bouin, Carnoy).

    • Aditivos.

    • Por enlaces cruzados: Establecen enlaces químicos entre las moléculas del tejido (ej., formaldehído).

    • No aditivos.

  • Por su composición:

    • Fijadores simples.

    • Mezclas fijadoras.

Fijadores Simples

• Metanol, etanol y acetona: Deshidratación y coagulación para extensiones citológicas.

• Formaldehído (~4%): Inactiva enzimas por su unión a grupos funcionales; útil para tejidos, incluyendo aquellos con altas concentraciones de lípidos.

• Ácido acético (1-5 %): Cambia el estado coloidal de las proteínas; útil para ácidos nucleicos.

Mezclas fijadoras

• Solución de Bouin: Ácido pícrico, formaldehído y ácido acético glacial; para tejidos que se incluirán en parafina (lavar antes).

• Solución de Clarke: Etanol y ácido acético glacial (3:1); para muestras que se incluirán en parafina.

Métodos de Fijación Química

• Inmersión: Sumergir la muestra en el fijador (biopsias y plantas de hasta 0.5 cm de grosor).

  • Volumen del fijador: 10 a 20 veces superior a la muestra.

  • pH similar al fisiológico (pH ~ $7.45$).

  • Tiempos cortos de fijación (excepción: formaldehído).

• Perfusión: Introducir el fijador a través del sistema vascular (modelos biológicos sin sangre).

  • La velocidad de penetración no es limitante, pero sí la presión y el tiempo de fijación.

Inclusión

• Proceso para infiltrar las muestras con sustancias líquidas que se solidificarán y endurecerán la muestra.

Inclusión en Parafina

• Considerar la dureza, viscosidad y fragilidad de la parafina.

• Parafinas con punto de fusión en torno a los $60°C$.

• La parafina no es miscible con el agua, se debe deshidratar la muestra con alcoholes y usar una sustancia intermedia (xileno).

• Incubaciones en la parafina líquida.

• Para secciones de 5 a $20 μm$ de grosor.

Inclusión en Resinas

• Resinas de alta dureza (tipo epoxy y acrílicas).

• Deshidratación y un líquido intermediario (óxido de propileno).

• La resina se polimeriza dentro de la muestra a $60 °C$. A veces se requieren aceleradores y plastificantes.

• Para secciones de 50 a $90 nm$ de grosor (ultraestructuras).

Corte

• Proceso para generar secciones de la muestra con grosores de micrómetros a nanómetros.

• Microtomo: Instrumento para cortar en láminas muy finas los objetos.

  • Microtomo para parafina.

  • Vibratomo.

  • Criotomos.

  • Ultramicrotomo.

Microtomo para Parafina

• Las cuchillas son inmóviles, se mueve la muestra.

• Cortes con grosor: 5 a $20 μm$.

• Tipos: De rotación o deslizamiento.

• Requiere un retallado y desbastado previo.

• Los cortes se colocan en agua para estirarse y se secan a $35-40 °C$.

Vibratomo

• La cuchilla se mueve, la muestra se pega en un bloque portamuestras.

• Cortes con grosor: 50 a $300 μm$.

• El proceso se lleva a cabo dentro de una solución acuosa.

• Los cortes flotan y se deben secar en un portaobjetos.

• Los cortes gruesos permiten la permeabilización de las células para teñir.

Criotomo

• Equipos para cortes en frío.

• Cortes con grosor: 10 a $30 μm$.

• Tipos: Microtomo de congelación y criostato.

• Las muestras no requieren fijarse, solo congelarse.

• Antes de la congelación, las muestras se encastran.

• La cámara de corte tiene una T = $-50 °C$.

Ultramicrotomo

• Produce cortes ultrafinos.

• Cortes con grosor: 50 a $190 nm$.

• Las muestras deben ser inclusiones en resina, previamente retalladas y desbastadas.

• Se requieren cortes previos: semifinos.

• Las secciones ultrafinas se recogen en rejillas de níquel o cobre. Estas rejillas pueden utilizarse directamente en los microscopios electrónicos.

Tinción

• Añadir color a una muestra utilizando colorantes específicos.

• Uso de anticuerpos, lectinas o sondas para marcar una zona de la muestra y pueda ser identificada por microscopía.

Tinciones Generales

• Se utilizan sustancias coloreadas capaces de unirse a estructuras celulares de manera más o menos específica.

  • Ejemplos: Tinción Wright, Tinción Gram, Safranina, Hematoxilina, Azul de metileno, Rojo Nilo.

Proceso de Tinción con Hematoxilina-Eosina

1. Desparafinado: Xileno (2x10 min).

2. Hidratación: Etanol 100° (2x10 min), Etanol 96° (10 min), Etanol 80° (10 min), Agua destilada (10 min).

3. Tinción: Hematoxilina (3 min), Agua de grifo (15 min), Eosina (30 segundos).

4. Deshidratación: Etanol 80° (15 s), Etanol 96° (30 s), Etanol 100° (5 min), Etanol 100° (10 min).

5. Aclaramiento: Xileno (2x10 min).

6. Montaje: Medio de montaje y cubreobjetos.

• Resultado: Núcleo (Hematoxilina), Citoplasma (Eosina).

Histoquímica

• Tinciones en las que se llevan a cabo reacciones químicas con moléculas propias de la muestra.

• Pone de manifiesto una molécula o familia de moléculas presentes en una sección histológica para estudiar su distribución tisular "in situ“.

• Pueden ser reacciones químicas o reacciones enzimáticas.

Inmunohistoquímica

• Tinciones en las que se utilizan anticuerpos altamente específicos para localizar una molécula o una estructura.

• Estos anticuerpos están acoplados a biotina o a un fluorocromo.

• Ejemplos: Detección de tirosina hidroxilasa con complejo avidina-biotina-peroxidasa, proteína marcadora olfativa (OMP) en rojo, citoqueratina 8 en verde en epitelio olfatorio.

Observación

• Microscopio óptico o microscopio electrónico.

• En microscopía electrónica, las muestras no se tiñen, sino que se contrastan.

Cortes Ultrafinos y Contraste en Microscopía Electrónica

• Tratamiento con metales que no aporta color, pero impide el paso de electrones para generar contraste.

Tarea

Okay, here's how you would carry out the procedures, based on the steps discussed and the provided note:

1. Identificación de bacterias Gram positivas en el tracto respiratorio:

   • Obtención de la muestra:

     • Realizar un exudado faríngeo en los ratones utilizando un hisopo estéril. Este método es de citología exfoliativa, como se indica.

   • Tratamiento de la muestra:

     • Extender la muestra del hisopo en un portaobjetos limpio para crear un frotis.

     • Dejar secar al aire y fijar la muestra. La fijación puede realizarse con calor suave o con un fijador químico como metanol o etanol, que son fijadores simples adecuados para extensiones citológicas.

   • Tinción:

     • Realizar la tinción de Gram. Este proceso implica varios pasos:

       • Teñir con cristal violeta (colorante primario).

       • Añadir lugol (mordiente).

       • Decolorar con alcohol o acetona.

       • Teñir con safranina (contraste).

   • Microscopía:

     • Utilizar un microscopio óptico. Las bacterias Gram positivas aparecerán de color púrpura/azul debido a la retención del cristal violeta en su gruesa pared de peptidoglicano.

2. Identificación de la proteína α-sinucleína en cerebro de ratón:

   • Obtención de la muestra:

     • Realizar una necropsia en los ratones para obtener el tejido cerebral. Asegurarse de obtener las muestras lo más rápido posible para evitar la autólisis y la putrefacción.

   • Fijación:

     • Fijar el tejido cerebral mediante perfusión o inmersión en formaldehído al ~4%. La fijación debe realizarse para preservar las características morfológicas y moleculares del tejido.

   • Inclusión:

     • Incluir el tejido fijado en parafina. Deshidratar el tejido con alcoholes graduales y aclarar con xileno antes de la inclusión en parafina.

   • Corte:

     • Realizar cortes del tejido incluido en parafina utilizando un microtomo para parafina. Obtener secciones de aproximadamente 5-20 μm de grosor.

   • Tinción (Inmunohistoquímica):

     • Desparafinar las secciones con xileno y rehidratar con alcoholes graduales.

     • Realizar la inmunohistoquímica utilizando los anticuerpos anti-α-sinucleína acoplados a FITC.

     • Incubar las secciones con los anticuerpos.

     • Lavar las secciones para eliminar el exceso de anticuerpos.

   • Microscopía:

     • Utilizar un microscopio de fluorescencia. La proteína α-sinucleína se visualizará con fluorescencia verde debido al FITC.

3. Identificación de la estructura de las mitocondrias en células de pulmón (alveolos) de ratón:

   • Obtención de la muestra:

     • Obtener tejido pulmonar del ratón mediante necropsia. Minimizar el tiempo post-mortem para evitar la autólisis.

   • Fijación:

     • Fijar el tejido pulmonar con glutaraldehído o formaldehído para microscopía electrónica. Para una mejor preservación de las ultraestructuras, se recomienda fijación con glutaraldehído.

   • Inclusión:

     • Incluir el tejido en resina epoxi para obtener secciones ultrafinas.

   • Corte:

     • Realizar cortes ultrafinos (50-90 nm) con un ultramicrotomo. Estos cortes se colocan sobre rejillas de níquel o cobre.

   • Contraste:

     • Contrastar las secciones con metales pesados como acetato de uranilo y citrato de plomo