Notas de estudio: Infectología General IAAS - SP
Normas de bioseguridad y material de trabajo en microbiología
NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
Actitud responsable y crítica en la manipulación microbiológica.
Siempre utilizar el delantal blanco en el laboratorio.
Dejar abrigos, libros, etc. en casilleros o closets; no colocar objetos personales sobre los mesones.
Respetar indicaciones sobre uso de mechero, asas, tubos y otros materiales durante primeras prácticas.
Prohibiciones: fumar, comer, ingerir líquidos y maquillarse en el laboratorio.
No tocarse boca o nariz con las manos durante procedimientos.
No utilizar el delantal para limpiar objetos del laboratorio.
Trabajar de modo ordenado y tranquilo, evitar movimientos innecesarios; no bloquear accesos o rutas de escape.
No hacer bromas con el material de laboratorio; avisar al profesor ante accidentes (corto punzante, rasguño, quemadura).
Desechos: colocar en recipientes indicados por norma REAS; no salpicar mesones y piso; derrames de material infeccioso deben ser contenedos, limpiados y desinfectados.
Colocar vidrio reutilizable, desechable y corto punzante en recipientes indicados.
Cultivos de desecho en recipientes adecuados para su descontaminación.
Pipetas contaminadas deben depositarse en recipientes con desinfectante.
Lavar cuidadosamente las manos antes de abandonar el laboratorio.
Importancia de la bioseguridad durante Infectología General IAAS.
II. Bioseguridad en el laboratorio de microbiología
El trabajo en microbiología es de alto riesgo por manejo de muestras clínicas potencialmente contaminadas y cultivos de microorganismos.
Minimización y control del riesgo mediante un plan de bioseguridad en el laboratorio clínico.
Riesgos biológicos más comunes: cultivos de microorganismos (bacterias, micobacterias, hongos, virus, parásitos), muestras clínicas humanas o animales, toxinas, alérgenos, productos recombinantes, etc.
Cuatro elementos necesarios para iniciar una infección:
hospedero susceptible
agente infeccioso
dosis infectante (concentración)
ruta de transmisión (la única que se puede controlar con normas de bioseguridad)
Rutas de transmisión priorizadas (controladas): oral, respiratoria, percutánea y contacto directo con piel/mucosas.
Toda muestra clínica debe ser manejada bajo contención adecuada (barreras, diseño de laboratorio, cámaras de bioseguridad).
Vacunas seguras y eficaces como mecanismo adicional para reducir infecciones ocupacionales.
Responsabilidad del establecimiento: programa de bioseguridad; no es posible un ambiente seguro sin responsabilidad individual.
Evaluación del riesgo:
Riesgo = probabilidad de daño, lesión o enfermedad.
En laboratorios microbiológicos y biomédicos: enfoque en prevención de infecciones de laboratorio.
Ayuda a asignar niveles de bioseguridad (instalaciones, equipo y prácticas) para minimizar exposición.
Puede ser cualitativa o cuantitativa; desafíos con agentes infecciosos, vectores, recombinantes, etc.
El director del laboratorio es responsable de evaluar el riesgo y establecer el nivel de bioseguridad adecuado.
Barreras: clasificación en Primarias y Secundarias.
BarrerasPrimarias (Equipos de Seguridad)
Gabinetes de bioseguridad (GBS) y recipientes cerrados para contener aerosoles y salpicaduras.
Cubetas centrífugas de seguridad para evitar liberación de aerosoles durante centrifugación.
Equipos de protección personal (EPP): guantes, delantales, cobertores de zapatos/botas, respiradores, mascaras, antiparras/oculares.
En algunas situaciones, EPP puede actuar como barrera primaria cuando no es práctico trabajar en gabinetes biológicos.
Barreras Secundarias (Diseño y Construcción de Instalaciones)
Diseño de instalaciones que protejan a trabajadores, a terceros y a la comunidad.
La jefatura del laboratorio debe proveer instalaciones acorde al nivel recomendado de bioseguridad.
Barreras secundarias para laboratorios de bajo riesgo (BSL-1/BSL-2):
separación del área de trabajo del público, sistemas de descontaminación (autoclave) y lavado de manos.
Si hay riesgo de exposición por aerosoles, puede requerirse contención adicional y barreras secundarias múltiples: sistemas de ventilación direccional, tratamiento de aire, zonas de acceso controlado, esclusas de aire, módulos aislados.
Clasificación de microorganismos por grupos de riesgo
Concepto: clasificación por virulencia para humanos/animales/plantas.
Cuatro grupos de riesgo.
Niveles de bioseguridad (BSL)
Descripción general: cuatro niveles (BSL-1 a BSL-4) con combinaciones de prácticas, equipos e instalaciones para controlar virus y bacterias.
Director de laboratorio: responsable de evaluar riesgos y aplicar niveles de bioseguridad.
Nivel 1 (BSL-1): microorganismos con baja o nula virulencia para adultos sanos; acceso limitado; mobiliario lavable; lavamanos; desechos autoclavados/incinerados; entrenamiento inicial; guantes cuando aplica; procedimientos escritos y accesibles.
Nivel 2 (BSL-2): similar a BSL-1 pero con capacitación específica; acceso limitado; manejo de aerosoles en cabinas de bioseguridad u otros contenedores; protección adicional para manejo de materiales infecciosos; instrucción específica para vecindarios y personal.
Nivel 3 (BSL-3): trabajos con agentes patogénicos y exóticos que pueden causar enfermedades graves por inhalación; procedimientos en cabinas de bioseguridad Clase II o contención; instalaciones con diseño especial; separación física de áreas; lavamanos cerca de salidas y controles para abrir grifos sin uso de manos.
Nivel 4 (BSL-4): agentes peligrosos/extremadamente peligrosos (generalmente sin vacuna/tratamiento); acceso estrictamente controlado; ubicaciones aisladas; uso de cabinas de bioseguridad Clase III o BSL-2 con trajes presurizados; ventilar externamente; manual de operaciones específico; áreas separadas del edificio; instalación con 27 características de ingeniería para evitar diseminación.
Relación entre grupos de riesgo, niveles de bioseguridad, prácticas y equipo: se adaptan a la virulencia, patogenicidad, antibiorresistencia y disponibilidad de vacunas/tratamientos.
III. Material de trabajo en microbiología
Mechero: utilidad principal para trabajo estéril; esterilización de asas, bocas de tubos, pipetas, portaobjetos; ambiente de trabajo estéril; uso reducido en favor de asas desechables y cabinas.
Placas de Petri: vidrio o plástico; base y tapa; mantener cerradas; abrir solo al sembrar.
Asas de cultivo: mango y alambre; tipos: asa recta (con punta) y asa en anillo; uso para sembrar en superficie y en profundidad; asas calibradas para recuento bacteriano.
Pipetas Pasteur: tubo angosto; esterilizar punta; romper punta antes de usar; trasladar líquido.
Tubos de ensayo: para preparación de medios y reacciones; esterilización en horno Pasteur; flamear boca del tubo cada vez que se saque o cierre tapa.
Microscopio: objetivo 40× para observación al fresco; objetivo 100× para inmersión en preparaciones teñidas; limpieza completa tras uso.
Estufa de cultivo: para crecimiento de siembras a 35–37 °C.
IV. Morfología bacteriana y técnicas de tinción
Introducción: la observación microscópica revela forma, disposición, agrupación y movilidad; tinciones revelan cápsula, flagelo, pared celular; etapa inicial para diagnóstico bacteriológico.
Formas bacterianas: cocos y bacilos; organización en cadenas, racimos o pares; variaciones por entorno.
Preparación de frotis: fijación sobre portaobjetos para adherir células y eliminar desorganización durante coloración; fijación por calor es el método ideal; otras opciones: alcoholes.
Tinciones (clasificación general):
Tinción simple: un colorante para observar morfología.
Tinción diferencial: dos colorantes con mordiente y decolorante para distinguir grupos bacterianos.
Tinción especial: resalta estructuras específicas.
Tinción de Gram: clásica para dividir bacterias en Gram positivas y Gram negativas.
Tinción de Gram: reactivos y secuencia
Colorante primario: (colorante básico, tiñe violeta)
Fijador/mordiente:
Agente decolorante:
Colorante de contraste:
Resultado de Gram: Gram positivas retienen el color púrpura tras decoloración; Gram negativas se decoloran y toman el color rojo de la safranina.
Explicación de la base estructural: el peptidoglicano grueso bloquea pérdida de cristal violeta en Gram positivo; en Gram negativo, la membrana externa y menor peptidoglucano facilitan decoloración.
Paso crítico: la decoloración debe ser controlada para evitar falsos positivos/negativos.
Actividad práctica propuesta:
Frotis de microbiota oral; tinción de Gram; observación de morfología celular y morfotipos.
Tinción de Gram de cultivo entregado por docente; observación de morfología y morfotipos.
V. Medios de cultivo, técnicas de siembra y observación macroscópica
Medios de cultivo: conjunto de nutrientes y factores de crecimiento que permiten el desarrollo de microorganismos.
Componentes básicos de un medio:
Fuente de carbono
Fuente de nitrógeno
Elementos no metálicos (S, P)
Elementos metálicos (Ca, Zn, Na, K, Cu, Mn, Mg, Fe2+/Fe3+)
Vitaminas
Agua
Energía (fotótrofos usan luz; quimiótrofos oxidan compuestos químicos)
Agar: solidificante; se licua a ebullición y se solidifica alrededor de 40 °C; no modifica pH; retiene agua; permite conservación a 4 °C; la gelatina puede licuarse por algunas bacterias; suele ser inerte.
Tipos de medios de cultivo (clasificación por estado físico): líquidos, semisólidos (0.25% agar), sólidos (1.5% agar).
Tipos de medios por composición química:
Medios básicos o fundamentales
Medios enriquecidos o mejorados
Medios diferenciales
Medios selectivos
Medios selectivos diferenciales
Medios simples/básicos: base de agar o caldo peptonado.
Medios enriquecidos: añadir sangre, suero, etc. (ejemplos: Agar Sangre, Agar Chocolate).
Medios diferenciales: señalan propiedades bioquímicas (p. ej. TSI, LIA, MIO, Citrato de Simmons).
Medios selectivos: inhiben crecimiento de ciertas bacterias; permiten aislar otras (p. ej. Thayer Martin, Chapman, Skirrow).
Medios selectivos diferenciales: combinan selección y diferenciación (p. ej. MacConkey, XLD, SS).
Medios de cultivo comunes:
Agar Sangre: enriquecido; permite detectar hemólisis; crecimiento de gran diversidad bacteriana.
Agar Chocolate: enriquecido para Haemophilus y otros organismos fastidiosos.
Agar MacConkey: selectivo diferencial para enterobacterias; lactosa como carbono; rojo neutro como indicador; lactosa fermentadores tiñen de rojo.
Agar SS: selectivo para Salmonella y Shigella; verde brillante y sales biliares; no fermentadores incolores; Salmonella con centro negro por H2S.
Agar Muller–Hinton: medio nutritivo para pruebas de susceptibilidad a antibióticos; no contiene inhibidores.
Métodos de siembra y aislamiento bacteriano
Surfaces (superficie): sembrar para obtener colonias aisladas, depósito en borde y estriado en zig-zag.
Método por estría (quadras): estrías en cuadrantes para obtener aislamiento secuencial.
Siembra en césped: extender por toda la placa para estudiar susceptibilidad antimicrobiana.
Siembra en tubo (picadura o profundidad): colocar la inoculación hasta el fondo para observar crecimiento en profundidad.
Superficie (tendida): inoculación sobre la superficie de un agar inclinado.
Medios líquidos (caldo): depositar la cepa en medio líquido o transferir con pipeta.
Observación macroscópica de colonias
Las colonias varían en tamaño (grande >1 mm; mediano ~1 mm; pequeño <1 mm; puntiforme), forma, borde, elevación, superficie, aspecto (brillante, opaco, mate), pigmento, hemólisis (Alfa, Beta, Gamma) y consistencia (mucoide, liso, rugoso).
Las características pueden cambiar con tiempo de incubación y composición del medio.
Morfología de colonias y su uso en identificación.
VI. Microbiota normal
Definición: microbiota o microbioma es el conjunto de genomas de microorganismos que residen en el cuerpo humano.
Microbiota normal: convive con el huésped de forma habitual, en estado de mutualismo o comensal; composición característica por especie y distribución.
Colonización latent a partir del nacimiento; transmisión de la vagina materna y áreas perineales a piel, boca, nariz y región faríngea; desarrollo posterior a partir de distintas fuentes ambientales.
Microbiota basal/residente vs microbiota transitoria:
Basal/residente: gérmenes siempre presentes en ese sector (ej.: Staphylococcus epidermidis en piel, E. coli en intestino).
Transitoria: variabilidad entre humanos; compuesta por gérmenes que colonizan intermitentemente; pueden incluir patógenos potenciales.
Papel de la microbiota:
Efectos directos: bacteriocinas, metabolitos tóxicos, consumo de nutrientes, competencia por receptores, reducción del potencial redox.
Efectos indirectos: estimulación de anticuerpos, fago-fagocitosis, inducción de interferón, conjugación de ácidos biliares.
Órganos y tejidos normalmente estériles (sitios diagnósticos): sangre; LCR; riñones/uréteres/vejiga (orina estéril); tracto respiratorio inferior; útero; oído medio/ interno; líquidos de cavidades estériles (sinovial, pleural).
Desequilibrio de microbiota puede ocurrir por: aumento de masa crítica, traslación desde sitio original, ruptura de barreras.
Determinantes de infecciones: deficiencia inmunitaria, inmunosupresión, cirugías, uso de antibióticos.
Actividad práctica propuesta: sembrar flora microbiana normal en placas; incubación; observación y descripción de cultivo.
VII. Desinfección, antisepsia y esterilización
Introducción y objetivo: controlar microorganismos perjudiciales para la salud humana; esterilización = muerte de formas de vida microbianas incluidas esporas; clave para clínica y hospitales.
Clasificación de métodos de esterilización
Métodos físicos:
Llameado: exposición a llama ~10 segundos; combustión produce agua y CO2; llama poco luminosa y de alto poder calorífico.
Calor seco: Hornos Pasteur o Poupinel; 200 °C durante 30–60 minutos para material de vidrio; para jeringas y agujas.
Calor húmedo: autoclave; temperatura 105–120 °C; mayor penetración; desnaturalización de proteínas.
Radiaciones: UV; daña ADN; útil para plásticos y descontaminación de aire/superficie.
Métodos químicos:
Óxido de Etileno (ETO): esteriliza artículos sensibles al calor/humedad; alkilación de paredes celulares; riesgos de inflamabilidad, toxicidad y cancerogénesis si no se manejan adecuadamente.
Gas Plasma: peróxido de hidrógeno en estado plasma; esterilización a ≤50 °C; baja humedad; sin toxicidad significativa.
Métodos mecánicos:
Filtración: filtration de líquidos termolábiles (azúcares, sueros, antibióticos, etc.); porosidad de filtros (asbesto, membrana, celulosa, cerámica).
Limpieza: eliminación de contaminantes por arrastre mecánico; no garantiza destrucción de microorganismos.
Desinfección y antisepsia:
Desinfección: eliminación de formas vegetativas; puede ser de alto/medio/bajo nivel; no destruye esporas en todos los casos.
Antisepsia: desinfección de piel y mucosas.
Principales antisépticos y desinfectantes: tabla resumen (basada en Brock et al.).
Actividad práctica (antisépticos y desinfectantes): dividir placa y probar diferentes antisépticos; aplicar soluciones salinas en manos/antebrazo; incubación 24–48 h a 37 °C; observar crecimiento; Gram de colonias de interés.
VIII. Antibiogramas y difusión en agar
Concepto y objetivo: determinar sensibilidad bacteriana a antimicrobianos; clasificar como susceptible, intermedio o resistente.
Propiedades generales de antibacterianos:
Espectro de actividad: bacterias Gram negativas suelen ser más resistentes; amplio vs reducido espectro.
Tipo de actividad: bacteriostática (inhibe crecimiento) vs bactericida (matan bacterias).
Mecanismos de acción de antibióticos (resumen):
Actúan sobre la pared celular, membrana, síntesis proteica, síntesis de ácidos nucleicos, o vías metabólicas básicas en procariontes.
Resistencia bacteriana: natural o adquirida; mutaciones y transferencia genética (plásmidos, transposones, integrones) pueden generar multirresistencia.
Métodos in vitro de susceptibilidad:
Pruebas por difusión en agar (Kirby-Bauer) con discos; uso de inóculo estandarizado según 0.5 McFarland.
Pruebas por dilución para CIM (Concentración Inhibidora Mínima) y CMB (Concentración Bactericida Mínima).
Estándares CLSI para interpretación de zonas de inhibición; uso de nombres genéricos y agrupación por clases de antibióticos.
Principales clases de antibióticos y ejemplos abreviados:
ß-Lactámicos (penicilinas, cefalosporinas, carbapenemas, monobactámicos)
Glicopéptidos (vancomicina)
Aminoglicósidos
Macrólidos
Tetraciclinas
Quinolonas
Sulfonamidas + trimetoprim
Cloranfenicol, clindamicina, linezolid, quinupristin/dalfopristin
Rifampicina
Nitrofurantoína, fosfomicina
Procedimiento de ensayo: uso de placas de Mueller-Hinton; preparación de inóculo; aplicación de discos; incubación a 35–37 °C; lectura de zonas de inhibición y comparación con tablas CLSI; interpretación como S, I o R.
Recomendaciones prácticas: incluir discos sin marcas; agrupar por clase; almacenar discos correctamente; usar inóculos estandarizados; controlar condiciones de incubación.
Interacciones clínicas: el tamaño de la zona depende de difusión del fármaco y de la carga del inóculo; guía CLSI se actualiza periódicamente.
IX. Identificación de cocáceas Gram positivas e Enterobacterias
Cocáceas Gram positivas patógenas: agrupamiento por morfología y pruebas bioquímicas.
Staphylococcus aureus: coagulasa positiva; grandes colonias cremosas; pigmentación amarilla; beta-hemólico.
Staphylococcus coagulasa negativo: no hemolítico.
Streptococcus: 13 grupos Lancefield (A–O); grupo A (S. pyogenes) causa faringitis; colonias 1–2 mm; beta-hemólisis; sensibles a Bacitracina.
Streptococcus del grupo B (S. agalactiae): beta-hemolíticos; prueba CAMP positiva.
Streptococcus pneumoniae (neumococo): colonias 1–3 mm, apigmentadas, alfa-hemolíticas; virulencia asociada a cápsula.
Enterococcus: toleran 6.5% NaCl y bilis-esculina; antig. del grupo D; parte de la flora intestinal; patógenos en urinarias nosocomiales, heridas, bacteremias, endocarditis.
Actividad práctica: caracterización microscópica y macroscópica de cocáceas; pruebas bioquímicas para identificación.
Enterobacterias (bacilos gramnegativos): mayor crecimiento en agares nutritivos; colonias variables en MacConkey; patógenos clásicos (Salmonella, Shigella) y colonizadores oportunistas.
Métodos de diferenciación de enterobacterias: pruebas bioquímicas en medios como MacConkey, TSI, LIA, MIO, Citrato de Simmons; interpretación de resultados para identificar especies.
X. Observación de hongos
Hongos: diversidad de colonias que varían desde levaduras (similar a bacterias) hasta hongos filamentosos algodonosos.
Factores que influyen en la morfología de colonias: medio, temperatura, tiempo de incubación.
Medio de cultivo universal para hongos: agar Sabouraud–glucosa; incubación a 37 °C para levaduras; 25 °C para filamentosos; adecuado para micosis profundas o sistémicas.
Observación microscópica: hongos se componen de micelio; levaduras pueden ser unicelulares; necesidad de observar estructuras reproductivas.
Actividad práctica: observar y describir cultivo y colonias en agar Sabouraud; dibujar estructuras microscópicas de hongos levaduriformes.
XI. Observación y estructuras reproductoras de hongos
Tipos de micelio:
Micelio vegetativo: absorbe nutrientes y sustenta al micelio reproductor.
Micelio reproductor: se proyecta verticalmente y desarrolla estructuras de reproducción (sexual o asexual).
Estructuras reproductoras (reproducción):
Reproducción interna: esporangióforo, esporangio, columela, esporangiosporas.
Reproducción externa: célula-pié, conidióforo, vesícula/métula, fiálide, conidios.
Actividad práctica: observar, dibujar y caracterizar estructuras reproductoras de hongos.
XII. Observación de parásitos
Conceptos clave: parasitismo = asociación entre dos seres, a veces uno vive dentro o sobre el huésped; parásito = organismo que se aloja/se alimenta a expensas de otro ser vivo.
Ciclo de vida de un parasito:
Ciclo directo (monoxénico): huésped infectado expulsa formas infectantes al ambiente; el huésped susceptible se infecta por fecalismo.
Ciclo indirecto (heteroxénico): requieren dos o más huéspedes para completar el ciclo; pasos: huésped definitivo (madurez sexual), huésped intermediario (larvas), ambiente; posibilidad de transmisión por carnivorismo, etc.
Vectores: biológicos (esenciales para completar ciclo) o mecánicos (transmiten sin ser esenciales para el ciclo).
Trabajo de laboratorio para parásitos: formato de ficha con taxonomía, formas evolutivas, morfología, hábitat, huéspedes, vector y mecanismos de infección.
Referencias de bioseguridad y prácticas
Importancia de mantener normas, evitar exposiciones, usar equipo adecuado y seguir protocolos establecidos.
Evaluación de riesgo y niveles de bioseguridad deben ajustarse a organismos, condiciones y instalaciones disponibles.
Mantener prácticas estandarizadas y actualizadas conforme a guías CLSI, OMS y textos de microbiología clínica.
Observaciones finales
Este material cubre normas de seguridad, conceptos de bioseguridad, herramientas de laboratorio, morfología/ tinciones, medios de cultivo, técnicas de siembra, microbiota, desinfección/esterilización, antibiogramas, identificación de bacterias y hongos, parásitos y prácticas de laboratorio.
Es fundamental entender las relaciones entre el nivel de bioseguridad, las prácticas de laboratorio y la selección de equipos e instalaciones para mitigar el riesgo ocupacional y ambiental.
Fórmulas y notación científica (resumen)
Concentración mínima inhibidora (CIM): ext{CIM}= ext{min}igrace C ig| ext{crecimiento inhibido de la cepa}igrace
Concentración mínima bactericida (CMB): ext{CMB}= ext{min}igrace C ig| ext{destrucción de la cepa}igrace
Standard de turbidez para inoculación (0.5 McFarland):
Intervalos de temperatura para esterilización por calor húmedo: 105^\u00b0 ext{C} ext{ a } 120^\u00b0 ext{C}
Intervalos de temperatura para calor seco (hervor/horno): $$180^\u00b0 ext{C} ext{ por 60 minutos} \