Príprava kultivačných pôd a roztokov

3. Príprava kultivačných pôd a roztokov

Laboratórny protokol

  • Téma: Príprava kultivačných pôd a roztokov.

  • Definícia: Kultivácia je postup, pri ktorom zabezpečujeme rast a rozmnožovanie mikroorganizmov v laboratórnych podmienkach.

    • Kultivačné pôdy: Môžu mať rôzne zloženie, pôvod, konzistenciu, pH a slúžia ako médium, kde mikroorganizmy prežívajú, rastú, množia sa a produkujú metabolity či sporulujú.

  • Zásady prípravy: Pri príprave kultivačných pôd potrebujeme:

    • Suroviny - zložky kultivačnej pôdy

    • Destilovanú vodu

    • Analytické váhy

    • Odmerné nádoby

    • Vhodné nádoby na prípravu a rozdávkovanie

    • pH meter

    • Sterilizátor

  • Požiadavky: Pripravená kultivačná pôda musí byť sterilná, má svoju dobu použiteľnosti a podmienky na uskladnenie a použitie.

Zložky živných médií

  • Zdroje uhlíka: Hlavná časť kultivačných médií, často aj hlavný zdroj energie.

    • Príklady: Sacharidy (glukóza, laktóza, sacharóza, škrob), organické kyseliny, alkoholy, lipidy, proteíny (aminokyseliny, peptóny, proteíny).

    • Koncentrácia: V aeróbnych podmienkach 1-2%, v anaeróbnych 4-8%.

  • Zdroje dusíka:

    • Vzdušný dusík, dusitany, dusičnany, amónne soli, a organicky viazaný dusík.

    • Príklady: Amónne soli, močovina, kvasničný extrakt, sójová múka, výluhy (napr. kukuričný, fermentované výluhy otrúb olejnatých semien).

    • Koncentrácia: 0,1g dusíka na 1L média.

    • Pomer medzi uhlíkom a dusíkom: Ideálny pomer 4:1, najčastejšie 10-20:1, pre drevokazné huby 200:1 až 400:1.

  • Biogénne prvky:

    • Fosfor: Soli kyseliny fosforečnej, vyvažujú pH (6,4-7,2).

    • Horčík: Horečnaté zlúčeniny.

    • Síra: Soli kyseliny sírovej, sírne aminokyseliny (metionín, cystín, cysteín).

    • Draslík, Vápnik, Železo, Chlór.

    • Stopové prvky: Molibdén, meď, kobalt, bór, nikel, zlato, antimón.

  • Rastové faktory: Vitamíny, aminokyseliny, purínové a pyrimidínové zásady, vyššie mastné kyseliny.

    • Optimálne koncentrácie na 1l média: Vitamíny 1-500 μg, AMK 20-60mg, zásady 10-20mg.

  • Voda: Tvoria najväčší podiel médií.

    • Typy vody: Vodovodná s nízkou tvrdosťou (nestálemu zloženiu), destilovaná, redestilovaná, deionizovaná pre syntetické a špeciálne pôdy.

  • Požiadavky na vodu: Pre stanovenie požiadaviek mikroorganizmov na stopové prvky, aminokyseliny a vitamíny.

Príprava živných médií

  • Postup:

    • Postupné rozpúšťanie zložiek vo vode.

    • Niektoré zložky sa rozpúšťajú za tepla.

    • Stopové množstvá pridávame z koncentrovaných roztokov.

    • Po rozpustení: úprava pH, obvykle najbližšie k neutrálnej oblasti (pH 7-7,4 pre baktérie).

    • Zrazeniny odfiltrujeme (Fe, Ca asepticky pridáme do sterilného média).

    • Prídavok stužujúcich látok (agar, želatína - necháme napučať).

Sterilizácia médií

  • Sterilizácia sa uskutočňuje:

    • Do kultivačných nádob pomocou lievika (čisté hrdlo!) maximálne do 2/3 objemu (médium bude vrieť).

    • Autoklávovanie: Pri pretlaku 100-150kPa. Čas závisí od objemu:

    • 10-20 min v skúmavkách,

    • 30-60 min pre objemy do 2L.

    • Média s vyšším obsahom sacharidov: Sterilizácia v prúdiacej pare pri 100°C, 30 min, 3 dni po sebe (Kochov sterilizátor).

  • Termolabilné zložky: (rastové faktory, antibiotiká, 10-20% roztoky sacharidov) sa sterilizujú samostatne filtráciou cez bakteriologické filtre (0,2 μm) a asepticky pridávajú do sterilnej pôdy ochladenej na teplotu 45°C.

    • 10-20% roztoky sacharidov sa sterilizujú samostatne (zabránenie rozkladu).

Rozlievanie sterilných stužených médií

  • Médium ochladené na 50-60°C.

  • Použitie: Petriho misky, agarové platne – 3-4 mm Ф, 90mm ~ 15 ml.

  • Šikmé agary: ¼ objemu a nakloníme na tyčinku alebo hadicu (šikmá plocha max na 2/3 dĺžky skúmavky).

Kontrolné úlohy a videá

  1. Úloha 1: Zoraďte pôdy podľa konzistencie.

  2. Úloha 2: Rozdiely medzi nasledujúcimi kultivačnými pôdami:

    • Živný bujón / Živný agar.

    • Agarová platňa / Šikmý agar.

    • Mac Conkeyho agar / Deoxycholátový agar.

    • Krvný agar / Čokoládový agar.

    • Médium na dôkaz skvasovania cukrov s Glu / s Mal.

  3. Úloha 3: Urobiť kontrolu rastu na pripravenej pôde.

  4. Úloha 4: Z 24h bakteriálnej kultúry inkubovanej pri 37°C pripravte bakteriálnu suspenziu s optickou hustotou 0,5 McFarlanda a zistite koľko kolónií tvoriacich jednotiek je v 1 ml.

    • Rovníc:
      CFU/ml = (n{5/1} + n{5/2}) imes 10^6 + (n{6/1} + n{6/2}) imes 10^7

    • Kde:

      • $n{5/1}, n{5/2}$ = KTJ z každej polovice platne #5

      • $n{6/1}, n{6/2}$ = KTJ z každej polovice platne #6

      • $p$ = počet ½ platní s 15 ≤ n ≤ 300 KTJ/½ platni.

Dvojstupňové riedenie

  • Postup: Rozlievanie do t. č. 100μl z desiatkového riedenia pre rôzne koncentrácie.

Kontrolné otázky

  1. Ako sa sterilizuje bežné kultivačné médium napr. Živný bujón?

  2. Ako sterilizujeme termolabilné zložky média?

  3. Načo slúži kontrola rastu na kultivačnej pôde?

  4. Čo je desiatkové riedenie?

  5. Je pri optickej denzite 0,5 McFarlanda rovnaká hodnota KTJ/ml pre rôzne druhy baktérií?