Northern blot-RNA

Northern Blotting Analysis

Introducción

El análisis Northern blot es un método para obtener información del tamaño y abundancia de un RNA específico en una mezcla compleja.
La muestra de RNA se separa por tamaño mediante electroforesis en gel.
El RNA se transfiere a una membrana y se analiza mediante la unión (hibridación) de sondas marcadas específicas para el RNA en cuestión.
Es una evolución de la técnica Southern blot (análisis de DNA).
Información:
- Longitud de la molécula de RNA.
- Posibles variantes de longitud.

Consideraciones Generales

La electroforesis se realiza en condiciones denaturantes (junto con un marcador de peso molecular).
Moléculas de RNA ramificadas o circulares tienen movilidades aberrantes.
Se usa para demostrar la presencia de un RNA específico en una muestra y para mediciones cuantitativas.
Se mide el nivel estacionario del RNA (suma de su producción y eliminación).
La actividad transcripcional se mide mediante experimentos de "nuclear run-on".
La degradación del RNA se mide determinando el nivel del transcrito en varios puntos temporales tras añadir un inhibidor de la iniciación de la transcripción.
Se usa para comparar el nivel de RNA en diferentes situaciones experimentales, más que para determinar cantidades absolutas.
Se podría usar un estándar interno de longitud diferente pero secuencia similar (creado por transcripción in vitro) para estimar los niveles absolutos, pero es raro.

Proceso General

Figura 7.1: Esquema de un análisis Northern blot.
El RNA de entrada puede ser de cualquier tipo, pero mayormente es RNA total celular.
Para el RNA total celular se usa el método de extracción ácido fenol/guanidinio tiocianato o purificación en una matriz de afinidad.
Si se analiza mRNA y la sensibilidad es importante, se aísla el polyA+ RNA mediante cromatografía de oligo(dT) antes de la electroforesis.
El RNA citoplasmático poliadenilado constituye aproximadamente el 3% del RNA total celular en células humanas.
El fraccionamiento también se usa para analizar RNAs pequeños; se pueden aplicar protocolos de fraccionamiento simples basados en columnas de unión a RNA para aumentar la capacidad de los geles, por ejemplo, para microRNAs celulares.
RNAs grandes (tamaño de mRNA) se separan en geles de agarosa (0.8% - 1.4%).
RNAs pequeños se separan en geles de poliacrilamida (4–20% acrilamida).
La separación por tamaño se realiza en condiciones denaturantes.
Las moléculas de RNA se pliegan en estructuras complejas que involucran segmentos de doble cadena por apareamiento de bases.
La separación por tamaño en condiciones nativas dependerá no solo de la longitud de la cadena de RNA sino también del plegamiento.

Desnaturalización

Geles de agarosa:
- Formamida/formaldehído.
- Glioxal.
Formaldehído:
- Se usa en el buffer de carga (con formamida) y en el gel.
- La formamida desnaturaliza el RNA.
- El formaldehído mantiene el estado desnaturalizado reaccionando covalentemente con los grupos amino de las bases.
- La reacción se revierte tratando el filtro tras el blotting para permitir el apareamiento de bases con la sonda.
Glioxal:
- No se usa en el gel, solo en el pretratamiento de la muestra.
- Desnaturaliza el RNA reaccionando covalentemente con las bases de guanina.
- La reacción también se revierte tratando el filtro antes de la hibridación.
- Tienden a producir bandas más nítidas.
- Se debe prevenir la reversión dependiente del pH de la glioxalación.
En el análisis Northern blot de RNAs pequeños, la muestra se desnaturaliza calentando en buffer de carga con formamida o urea y los geles se hacen con 50% urea.

Carga de la Muestra

Es importante asegurar una carga equitativa de las muestras, especialmente al comparar niveles de RNA en diferentes condiciones experimentales.
Cuando se usa RNA total celular, se aplican cantidades iguales (hasta 20 μg) basadas en espectrofotometría.
El RNA ribosómico citoplasmático (70–80% del RNA total) junto con otros RNAs estables son poco afectados por variables experimentales.
Si se enriquece el RNA por aislamiento de polyA+ RNA u otros medios, los niveles de RNA se expresan en relación con un RNA detectado en paralelo por otra sonda y que se sabe que no es afectado por la variable experimental.
Ejemplos de estándares:
- RNAsm de citoesqueleto (actina, tubulina).
- Ciclofilina.
- mRNA que codifica para la enzima glucolítica glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).
La elección del estándar debe realizarse cuidadosamente para cada tipo de experimento porque existen ejemplos de variación en los niveles de expresión de estos.
Se ha sugerido que el RNA ribosómico sería un buen estándar general.
En el análisis Northern blot, los RNAs ribosómicos pueden saturar el filtro, imposibilitando la hibridación cuantitativa.

Sensibilidad y Degradación

El análisis Northern blot de mRNA es muy sensible a la degradación de la muestra.
Es importante inspeccionar visualmente el RNA tras la electroforesis.
El RNA se puede teñir convenientemente con bromuro de etidio, aunque es menos eficiente que con DNA porque la unión es por interacción iónica en lugar de intercalación.
Se puede incluir bromuro de etidio en el buffer de carga para geles de formaldehído para la inspección durante la corrida.
Esto no es posible con geles de glioxal porque el bromuro de etidio reacciona con el glioxal e interfiere con su capacidad de desnaturalizar el RNA.
Alternativamente, el gel se puede teñir tras la corrida.
No se recomienda incluir bromuro de etidio en el gel porque migra hacia el cátodo creando un frente de tinción.
La calidad del RNA se puede evaluar inspeccionando las bandas de RNA ribosómico.
Las subunidades ribosómicas grande (LSU) y pequeña (SSU) se encuentran en proporción 1:1 en las células.
En humanos, la diferencia de tamaño es de 5,035 nt para LSU (28S) y 1,871 nt para SSU (18S), lo cual es una proporción de 2.7:1.
Si la proporción es menor, indica que el RNA está parcialmente degradado.
La unión de etidio al RNA puede reducir la transferencia y la eficiencia de hibridación.
Si esto es un problema, se debe correr un carril de prueba del RNA en paralelo y teñirlo tras la corrida.

Blotting

Existen dos métodos principales para el blotting:
- Blotting capilar.
- Electroblotting.
El método de transferencia capilar pasiva tradicional es simple y puede realizarse con materiales disponibles en el laboratorio.
Figura 7.2a: Un stack de toallas de papel u otro material absorbente se usa para extraer un buffer de transferencia de alta salinidad desde un reservorio, a través del gel y una membrana de unión a RNA colocada sobre el gel.
El flujo de buffer arrastra el RNA fuera del gel y lo atrapa en la membrana.
La transferencia toma varias horas y usualmente se realiza de noche.
Figura 7.2b: Una configuración más rápida es la transferencia capilar descendente (1 h).
Se puede acelerar la transferencia aplicando vacío debajo del gel o presión sobre el gel.
La transferencia capilar es el método de elección para geles de agarosa, mientras que el electroblotting se usa para geles de poliacrilamida.
Figura 7.2c: En el electroblotting, el gel y la membrana se colocan en una casete especial en una celda de electroforesis. Se aplica un campo eléctrico perpendicular a la casete y el RNA se transfiere a la membrana.
Existe el tipo semi-seco donde el gel y la membrana se intercalan entre papel Whatman 3MM humedecido con buffer de transferencia.
El electroblotting puede realizarse en menos de una hora.
La elección de la membrana es crítica. Las membranas de nylon con carga positiva son óptimas.
La carga positiva (debido a grupos amino) aumenta la afinidad por el ácido nucleico y facilita la inmovilización del RNA en la membrana, pero también causa más background debido a la unión no específica de la sonda.
Las membranas de nylon tienen alta resistencia a la tensión y alta capacidad de unión (4–500 μg/cm^2).
Tienen diferentes tamaños de poro (0.22 y 0.45 μm) y algunas están optimizadas para uso repetido o unión de RNAs pequeños.
Es importante seguir las recomendaciones del fabricante.
Es recomendable usar membranas que estén cargadas en ambos lados.
Si el gel fue teñido con bromuro de etidio, la transferencia exitosa puede confirmarse inspeccionando el filtro bajo luz UV.
También es posible inspeccionar el gel para verificar que la transferencia fue completa y no sesgada hacia RNAs pequeños.
Alternativamente, el RNA unido al filtro puede teñirse con azul de metileno.
RNAs transferidos a membranas de nylon con carga positiva en condiciones alcalinas se unen covalentemente al filtro.
En otras situaciones, es importante inmovilizar el RNA en el filtro para prevenir la pérdida durante la hibridación.
El método más común es usar una fuente de luz UV para inmovilizar el RNA.
La luz UV activa las bases de pirimidina (timina y uracilo) para formar enlaces covalentes con las aminas superficiales de membranas con carga positiva.
Las membranas de nylon húmedas generalmente requieren una dosis de 1.6 kJ/m^2, mientras que las membranas secadas al aire requieren solo 0.16 kJ/m^2.
Esto se puede hacer con equipo especializado con una fuente de luz UV calibrada (ej. Stratalinker de Stratagene) con un ajuste de "auto-crosslink" optimizado para membranas húmedas.
Otras fuentes UV pueden usarse, pero puede requerir optimización, cuidando de evitar radiación extensa a longitudes de onda cortas (254 nm).
Otra forma de inmovilizar RNA es incubar el filtro a 65°C por 1–2 h.
Algunos fabricantes afirman que la unión iónica a la membrana es suficiente y no se necesitan pasos adicionales.
Las membranas con RNA inmovilizado pueden almacenarse por períodos extendidos y pueden usarse como registro de experimentos de RNA para análisis posteriores.

Hibridación

Implica la aplicación de una sonda al material unido a la membrana en condiciones que favorecen la unión específica a moléculas diana complementarias.
La sonda está marcada para permitir la detección posterior de su complejo con el objetivo. El enfoque más común es el marcaje radiactivo (preferiblemente 32P), pero existen alternativas no isotópicas.
Las sondas pueden ser DNA o RNA que puede marcarse de varias maneras.
Los plásmidos de doble cadena o los productos de PCR marcados con el método de marcaje de cebado aleatorio han sido los tipos de sondas más populares, pero los productos de PCR asimétricos (de cadena única) y las sondas de RNA hechas por transcripción in vitro son más sensibles debido a la ausencia de una cadena competidora en la sonda.
Las sondas de oligonucleótidos son mucho menos sensibles y se utilizan cuando se trata de discriminar entre moléculas diana de secuencias estrechamente relacionadas.
Existe una gran variedad de buffers o sistemas de hibridación disponibles que pueden utilizarse con éxito para las hibridaciones de membranas.
La teoría de la hibridación no se aplica a los ácidos nucleicos inmovilizados en una membrana y el éxito se basa principalmente en la experiencia.
El valor crítico es la temperatura de fusión (Tm), definida como la temperatura a la que el 50% de todos los híbridos se disocian en cadenas sencillas.
La tasa máxima de hibridación se encuentra típicamente alrededor de 20°C por debajo de la temperatura de fusión.
Para sondas largas, la Tm para los híbridos DNA:RNA es:

Tm= 79.8◦C + 18.5 log[Na^+] + 58.4 (%G+C) + 11.8 (%G+C)^2 – 0.5 (% formamide) – (820/L)

(%G+C) es el porcentaje de contenido de guanina+citosina expresado como una fracción molar, [Na+] es la concentración molar de sodio y L es la longitud efectiva de la sonda que participa en el apareamiento de bases con el objetivo. Las constantes son ligeramente diferentes para los híbridos DNA:DNA y RNA:RNA.
La formamida se utiliza para reducir la temperatura de hibridación, lo que es particularmente importante cuando se utilizan sondas de RNA y cuando los filtros se van a utilizar para múltiples hibridaciones.
Para la mayoría de los propósitos, se adopta un enfoque práctico utilizando condiciones "estándar". La temperatura de hibridación y la astringencia del lavado se varían entonces de acuerdo con los requisitos del experimento de forma empírica.
La composición del buffer de hibridación es importante.
El DNA de cadena sencilla de un origen no relacionado con las muestras experimentales (principalmente DNA de esperma de salmón) se utiliza para bloquear la unión no específica de ácido nucleico a la membrana.
Un aditivo conocido como solución de Denhardts (Ficoll, polivinilpirrolidona y albúmina de suero bovino) se utiliza con frecuencia para bloquear la membrana y aumentar la concentración de la sonda reduciendo el volumen activo.
Un desarrollo importante son los buffers de hibridación con una alta concentración de SDS.
Desafortunadamente, muchas soluciones de hibridación de alta calidad se venden sin una declaración de su contenido y se basan en el argumento convincente de que están optimizadas para su uso con las membranas de hibridación vendidas por la misma empresa.

Técnicas Alternativas

El análisis Northern blot no es la única técnica para demostrar la presencia y cuantificar la cantidad de un RNA específico.
En los experimentos de protección de nucleasas, una hebra de sonda marcada se hibrida en solución al RNA de la muestra.
A continuación, las hebras sencillas no hibridadas se eliminan mediante digestión con nucleasas y los híbridos se analizan en geles.
Esta técnica se considera tradicionalmente un orden de magnitud más sensible (límite de detección 0,1–1 pg) que el análisis Northern blot clásico (límite de detección 1–10 pg) y más fiable porque el paso de hibridación está en solución.
Las mejoras más recientes del análisis Northern blot han cerrado la brecha y se afirma que en algunos sistemas se pueden detectar tan solo 10.000 moléculas en una membrana. Esto corresponde a un mRNA de abundancia media en menos de 100 ng de RNA celular total.
Los experimentos de protección de nucleasas son relativamente laboriosos y requieren cierta optimización.
Los métodos basados en RT-PCR son un orden de magnitud adicional más sensibles que el análisis Northern blot.
El principal problema es que requieren controles estrictos para evitar artefactos y que las versiones cuantitativas de la técnica requieren una instrumentación costosa.

Conclusión

El análisis Northern blot sigue siendo una técnica importante que es simple de realizar, de bajo costo y proporciona información cualitativa y cuantitativa en el mismo experimento.
En muchos casos, todavía se requiere un Northern blot para convencer a los revisores de la validez de una observación.
Una última nota de precaución se refiere a la interpretación del resultado del experimento. Cada vez está más claro que el nivel de mRNA está correlacionado con el nivel de proteína para menos del 20% de los genes en los humanos.
Esta observación obviamente enfatiza la importancia de la regulación post-transcripcional. Por lo tanto, la cuantificación de un mRNA en la mayoría de los casos proporciona poca información sobre la expresión génica en sentido proteico.
Por otro lado, el creciente interés en el RNA hace que la observación del nivel de transcripción sea importante por derecho propio.

Materiales

El análisis Northern blot es muy sensible incluso a una ligera degradación del RNA.
Por esta razón, es importante usar guantes durante todas las manipulaciones.
El equipo debe estar libre de RNasas.
Una simple precaución es reservar el equipo para el trabajo de RNA.
Alternativamente, el equipo debe limpiarse a fondo antes de su uso, especialmente si ha estado en contacto con RNasas, por ejemplo, durante la preparación de DNA plasmídico.
Los tanques de electroforesis deben limpiarse con detergente, enjuagarse con agua y secarse con etanol. A continuación, se tratan con 3% de H2O2 durante 10 min a temperatura ambiente, seguidos de un enjuague con agua DEPC.

Gel de Formaldehído - Agarosa

Agarosa (Seakem GTG; FMC BioProducts, o similar).
20× MOPS: 0.4 M MOPS ((ácido 3-(N-morfolino) propano-sulfónico), 0.1 M acetato de sodio, 20 mM EDTA. Para 1 L, disolver 83.6 g de MOPS y 8.2 g de acetato de sodio en 800 mL de agua tratada con DEPC. Ajustar el pH a 7.0 con 2 N NaOH. Añadir 40 mL de 0.5 M EDTA, pH 8.0, y ajustar el volumen final a 1 L. Autoclavar o esterilizar por filtración a través de un filtro Millipore de 0.2-μm (ver Nota 1).
37% de formaldehído (solución estándar de 12.3 M conocida como "formalin") (ver Nota 2).
Buffer de carga: 250 μL de formamida desionizada (ver Nota 3), 88 μL de formaldehído al 37%, 25 μL de MOPS, 2 μL de EtBr (3 mg/mL).
Escalera de RNA (disponible comercialmente de varias empresas).
Membrana de nylon cargada positivamente (Hybond N+ (GE Healthcare Life Sciences), BrightStar Plus (Ambion), Gene Screen Plus (PerkinElmer), o similar).
20× SSC: 3 M NaCl, 0.3 M citrato de sodio, pH 7.0. Para 1 L disolver 175.3 g de NaCl y 88.2 g de citrato de sodio en 800 mL de agua tratada con DEPC. Ajustar el pH a 7.0 con unas gotas de 10 N NaOH. Ajustar el volumen a 1 L con agua tratada con DEPC y autoclavar.
2× SSC hecho de 20× SSC por dilución con agua tratada con DEPC.
Parafilm.
Papel Whatman 3MM.
Toallas de papel planas.
Envoltura de plástico.

Gel de Glioxal - Agarosa

Agarosa (Seakem GTG; FMC BioProducts).
20× MOPS: 0. 4 M MOPS ((ácido 3-(N-morfolino) propano-sulfónico), 0.1 M acetato de sodio, 20 mM EDTA. Para 1 L, disolver 83.6 g de MOPS y 8.2 g de acetato de sodio en 800 mL de agua tratada con DEPC. Ajustar el pH a 7.0 con 2 N NaOH. Añadir 40 mL de 0.5 M EDTA, pH 8.0 y ajustar el volumen final a 1 L. Esterilizar por filtración a través de un filtro Millipore de 0.2-μm (ver Nota 1)
6 M glioxal (40%; recién desionizado) (ver Nota 4).
DMSO.
Buffer de carga: 50% glicerol, 1× MOPS, 0.25% azul de bromofenol.
Escalera de RNA (disponible comercialmente de varias empresas).
Membrana de nylon cargada positivamente (Hybond N+ (GE Healthcare Life Sciences), BrightStar Plus (Ambion), Gene Screen Plus (PerkinElmer), o similar).
Parafilm.
Papel Whatman 3MM.
Toallas de papel planas.
Envoltura de plástico.

Gel de Poliacrilamida Desnaturalizante

40% acrilamida (40:1.3): 400 g de acrilamida, 13 g de bisacrilamida. Disolver en agua; ajustar a 1 L. Filtrar a través de un filtro 3MM y guardar en una botella oscura en frío (ver Nota 5).
Buffer de electroforesis 10× TBE: 0.9 M Tris, 0.9 M ácido bórico, 0.02 M EDTA. Para 5 L disolver 544 g de Tris, 278 g de ácido bórico y 37.2 g de EDTA. Disolver en agua y ajustar a 5 L. Autoclavar para almacenamiento a largo plazo.
5% UPAG-mix/1× TBE: 125 mL de stock de acrilamida al 40% (40:1.3), 500 g de urea, 100 mL de TBE 10×. Añadir agua para disolver la urea; ajustar a 1 L. Filtrar a través de un filtro 3MM y guardar en una botella oscura en frío.
10% (p/v) persulfato de amonio. Guardar en alícuotas congeladas. Una vez descongelada, la solución se guarda a 4◦C y se puede usar durante unas semanas.
TEMED (N, N, N’, N’-tetrametiletilendiamina)
Buffer de carga: 1× TBE, 50% urea, 1 mg/mL azul de bromofenol, 1 mg/mL xileno cianol FF.
Escalera de RNA (disponible comercialmente de varias empresas).
Membrana de nylon cargada positivamente (Hybond N+ (GE Healthcare Life Sciences), BrightStar Plus (Ambion), Gene Screen Plus (PerkinElmer), o similar).
Parafilm.
Papel Whatman 3MM.

Análisis de Hibridación

20× SSPE: 3 M NaCl, 200 mM NaH2PO4, 20 mM EDTA, pH 7.4. Para 1 L disolver 175.3 g de NaCl y 27.6 g de NaH2PO4 y 7.4 g de EDTA en 800 mL de agua tratada con DEPC. Ajustar el pH a 7.4 con NaOH aproximadamente 6.5 mL de una solución 10 N). Ajustar el volumen a 1 L con agua tratada con DEPC y autoclavar.
20× SSC: 3 M NaCl, 0.3 M citrato de sodio, pH 7.0. Para 1 L disolver 175.3 g de NaCl y 88.2 g de citrato de sodio en 800 mL de agua tratada con DEPC. Ajustar el pH a 7.0 con unas gotas de 10 N NaOH. Ajustar el volumen a 1 L con agua tratada con DEPC y autoclavar.
Solución de Denhardt 50×: 0.05% (p/v) BSA, 0.05% (p/v) polivinil pirrolidona y 0.05% (p/v) Ficoll 400. Para 50 mL disolver 0.5 g de Ficoll (tipo 400 Pharmacia), 0.5 g de polivinilpirrolidona y 0.5 g de albúmina de suero bovino (Fracción V; Sigma) en agua tratada con DEPC. Filtrar y guardar en pequeñas alícuotas a –20◦C.
Buffer de hibridación: 50% formamida, 5× SSPE, 0.5% SDS, 2× solución de Denhardts, 100 μg/mL de DNA portador desnaturalizado. Para 10 mL de buffer de hibridación, combinar 5 mL de formamida desionizada (ver Nota 3), 4 mL de 20 × SSPE, 0.25 mL de una solución al 20% de SDS, 0.2 mL de solución de Denhardts 50×, 50 μL de una solución de 20 mg/mL de DNA portador desnaturalizado (ej. DNA de esperma de salmón) (ver Nota 6).
Sonda marcada radiactivamente (ver Nota 7).
Buffer de lavado de baja astringencia: 2× SSC, 1% pirofosfato de sodio, 0.1% SDS.
Buffer de lavado de astringencia media: 0.2× SSC, 1% pirofosfato de sodio, 0.5% SDS.
Buffer de lavado de alta astringencia: 0.1× SSC, 1% pirofosfato de sodio, 0.5% SDS.
Buffer de eliminación de sonda: 50% formamida, 2× SSPE.

Métodos

Northern Blotting de un gel de agarosa con formaldehído

El ejemplo es un gel de agarosa al 1.2% blotted por tradicional blotting capilar pasivo ascendente a una membrana de nylon cargada positivamente. Este tipo de gel se utiliza para el análisis de mRNA de tamaño pequeño a mediano de células de mamíferos.

Verter 100 mL de dH2O en un matraz Ehrlenmeyer de 250 mL. Utilice un rotulador para indicar el nivel de agua en el matraz. Retire aproximadamente 10 mL del agua y añada 1.2 g de agarosa al matraz. Disuelva la agarosa hirviendo, por ejemplo, en un horno microondas. Cuando la agarosa esté completamente disuelta, enfríela a 60◦C bajo el grifo de agua corriente. Añada 5 mL de MOPS 20× y 5.36 mL de formaldehído al 37% en una campana extractora (ver Nota 2). Ajuste el volumen al original de 100 mL con dH2O utilizando la marca en el matraz. Mezclar y verter el gel en la cubeta. Inserte el formador de pocillos y deje que el gel se solidifique durante al menos media hora.
Inserte la cubeta de gel en el aparato de gel. Llenar con buffer de electroforesis (1× MOPS) y retirar con cuidado el formador de pocillos.
Tomar una alícuota de aproximadamente 10 μg de RNA en 6 μL o menos. Añada 2.7 vols de buffer de carga por μL de RNA a la muestra y caliéntela durante 10 min a 70◦C. Lave los pocillos de la muestra con buffer de electroforesis y cargue las muestras. Cargue un marcador de peso molecular junto a las muestras.
Ejecute el gel a 2 V/cm durante aproximadamente 3 h. El buffer de carga contiene bromuro de etidio, lo que permite seguir la electroforesis inspeccionando el gel bajo luz UV. Tenga en cuenta que no todas las cubetas de electroforesis de gel son transparentes a los rayos UV.
Fotografíe el gel en el transiluminador UV. Observe la intensidad de las dos bandas principales de RNA. La superior (LSU rRNA) debe tener aproximadamente el doble de intensidad que la inferior (SSU rRNA).
Prepare el gel para el northern blotting cortando las partes del gel que no se van a transferir (por debajo del rRNA 5S, por encima de los pocillos y los lados del gel). Corte la esquina inferior izquierda del gel para orientarlo.
Lave el exceso de formaldehído y bromuro de etidio remojando el gel en 2× SSC tres veces durante 5 min.
Opcional. Irradie el gel en un transiluminador UV para introducir roturas aleatorias en la columna vertebral del RNA. Esto se utiliza para mejorar la eficiencia de transferencia de las moléculas de RNA grandes y puede mejorar la eficiencia de hibridación (ver Nota 8).
Corte un trozo de membrana del tamaño del gel dejando la membrana entre las dos hojas de papel protector. No manipule la membrana sin guantes (ver Nota 9).
Pre-humedezca la membrana flotando en la superficie de agua libre de RNasa durante unos minutos. Una vez que la membrana esté húmeda (normalmente en menos de un minuto), inspeccione la membrana para comprobar que está uniformemente humedecida (ver Nota 10). Sumerja la membrana y transfiérala al buffer de transferencia SSC 10× y equilibre durante 1–2 min.
Corte dos trozos de papel de filtro Whatman 3MM del tamaño del gel.
Asegúrese de que la esponja y el filtro Whatman 3MM de la unidad de transferencia estén saturados con buffer y de que el nivel de buffer en la unidad esté al menos a 1 cm del fondo.
Montar el sándwich de transferencia: Sin atrapar burbujas de aire, coloque el gel en la unidad de transferencia. Coloque tiras de parafilm a lo largo de los bordes del gel para evitar el "cortocircuito" del flujo de buffer. Coloque con cuidado la membrana de filtro encima del gel. A continuación, coloque las dos piezas de papel de filtro Whatman 3MM encima del bocadillo, una a la vez. Corte una pila de toallas de papel (5 cm cuando esté comprimida) y colóquela encima de las hojas de papel Whatman. Por último, coloque un peso ligero (por ejemplo, una placa de vidrio) encima de las toallas de papel para comprimir la pila. Deje que la transferencia se produzca durante al menos 6 h, preferiblemente durante la noche.
Desmonte el sándwich de transferencia. Seque el exceso de líquido con papel de cocina o toallas de papel y coloque el filtro encima de una hoja de papel 3MM. No deje que el filtro se seque por completo. Si el gel se tiñó con bromuro de etidio, se puede confirmar la transferencia correcta inspeccionando el filtro a la luz UV (o incluso a la luz del día). El RNA unido al filtro también se puede teñir en etapas posteriores con azul de metileno (ver Nota 11).
Opcional. Coloque el filtro en el cross-linker UV con el lado de la membrana que estaba en contacto con el gel hacia arriba. Utilice el ajuste de "auto-crosslink" como punto de partida (ver Nota 12).

Northern Blotting de RNA Glioxalado Separado en un Gel de Agarosa

El ejemplo es un gel de agarosa al 1% blotted por tradicional blotting capilar pasivo ascendente a una membrana de nylon cargada positivamente. Este tipo de experimento se utiliza para el análisis de la mayoría de los mRNA de células de mamíferos.

Verter 100 mL de dH2O en un matraz Ehrlenmeyer de 250 mL. Utilice un rotulador para indicar el nivel de agua en el matraz. Retire aproximadamente 10 mL del agua y añada 1.0 g de agarosa al matraz. Disuelva la agarosa hirviendo, por ejemplo, en un horno microondas. Cuando la agarosa esté completamente disuelta, enfríela a 60◦C bajo el grifo de agua corriente. Añada 5 mL de MOPS 20×. Ajuste el volumen al original de 100 mL con dH2O utilizando la marca en el matraz. Mezclar y verter el gel en la cubeta. Inserte el formador de pocillos y deje que el gel se solidifique durante al menos media hora (ver Nota 13).
Inserte la cubeta de gel en el aparato de gel. Llenar con buffer de electroforesis (1× MOPS) y retirar con cuidado el formador de pocillos.
Mezclar en un tubo de microcentrífuga de calidad RNA 5.4 μL de glioxal 6 M, 16.0 μL de DMSO, 1.5 μL de MOPS 20×, y 7.1 μL de RNA (hasta 10 μg). Coloque la muestra a 50◦C durante 1 h para desnaturalizar. Recuerde tratar la escalera de RNA en paralelo.
Enfríe la muestra de RNA en hielo, añada 4 μL de buffer de carga, e inmediatamente cargue las muestras en los pocillos del gel.
Ejecute el gel asegurándose de que no se forme ningún gradiente de pH durante la ejecución. El glioxal se disocia del RNA a pH>8.0.
Al final de la ejecución (normalmente cuando el azul de bromofenol ha migrado 8 cm), el carril o carriles que contienen la escalera de RNA pueden cortarse y teñirse. Alternativamente, proceda a los pasos de blotting.
Transfiera el RNA a una membrana de nylon cargada positivamente como se describe en la Sección 3.1, Pasos 6, y 8–15.
Opcional. Después de la inmovilización, elimine el glioxal del RNA lavando el filtro durante 15 min a 65◦C en Tris-Cl 20 mM, pH 8. Alternativamente, el glioxal se eliminará durante la incubación con buffer de hibridación en el paso de pre-hibridación.