Genové Inženýrství - Poznámky z Přednášky

Genové/genetické inženýrství

Cílená konstrukce buněk/organismů s novými vlastnostmi danými novými variantami a kombinacemi genů
Metody:
- Spojování fragmentů DNA izolovaných z odlišných druhů, rodů, čeledí … a přenášení těchto exogenů do heterologních hostitelů
- Vytváření zcela nových molekul DNA a jejich přenos do buněk
- Přímé mutační zásahy do genomu buněk, modifikace endogenů

Metodický základ genového inženýrství

Manipulace s DNA in vitro, amplifikace, klonování genů a jejich cílené úpravy, přenos do buněk / organismů - heterologní exprese
Cílené změny v genetické informaci lze provádět rovněž in vivo - editace genomu, chromozomové inženýrství

Klíčové objevy

Restrikční endonukleázy a další enzymy pro manipulace s DNA
- Štěpení DNA v přesně definovaném místě - reprodukovatelná fragmentace
- Spojení dvou cizorodých DNA - pocházejících z různých organismů
- Syntéza DNA ve zkumavce
- Sekvenování DNA
- Stanovení primární struktury genu
- Klonování genů
  - Pomnožení genu do mnoha kopií
  - Zavedení genu do nepříbuzných organismů - překonání mezidruhových bariér
  - Využití univerzálního genetického kódu a způsobu exprese genetické informace
  - Cílené zavádění mutací do genů - vylepšení funkce
  - Studium projevu pozměněných genů - vztah mutace a funkce

Etapy vývoje genového inženýrství

1965 – objev plazmidů
1970 – izolace prvního restrikčního enzymu
1972 – příprava prvních rekombinantních molekul DNA in vitro
1973 – začátek klonování genů
1975 – Asilomarská konference
1977 – první rekombinované molekuly DNA nesoucí savčí geny
1977 – sekvenování DNA
1978 – příprava lidského inzulinu v bakteriích (od r. 1982 vyráběn komerčně)
1980 – první pokusy o genovou terapii
1983 – objev a zavedení PCR, alternativa klonování genů ve vektorech
1996 – klonování živočichů, ovce Dolly
po roce 2000 - editace genomů - rekombinantní meganukleázy rozpoznávající dlouhé cílové sekvence, CRISPR/Cas

Využití genového inženýrství - základní výzkum

Studium struktury a funkce genů a genomů
Objasnění procesů genové exprese a její regulace
Reportérské geny
Rekombinantní DNA

Využití genového inženýrství - aplikovaný výzkum

Příprava látek významných pro lékařství, zemědělství a průmysl
Vnášení cizorodých genů do nepříbuzných organizmů a získávání produktů ve velkém množství - překonání reprodukčních bariér
Příprava látek s novými vlastnostmi
Pozměňování stávajících genů nebo vytváření nových - enzymy, protilátky, vakcíny, aj.
Vylepšování vlastností léčebných látek
Pozměňování a zlepšování vlastností organizmů
Příprava mikroorganizmů pro biotechnologie - např. zvýšení produkce
Zvyšování výnosů kulturních rostlin a užitkovosti hospodářských zvířat - odolnost vůči chorobám, škůdcům nebo zevním vlivům, produkce cizích látek v tělech rostlin a zvířat
Genová terapie - léčba genetických chorob

Klonování genů

*pomocí vektorů
* Cizorodá DNA
* Transformace/transfekce, elektroporace, infekce, mikroinjekce, nastřelení
* Klonování genu: příprava velkého počtu kopií genu nepohlavní cestou
* Vektor: malá molekula dsDNA se schopností replikace, která slouží jako nosič studované DNA
*pomocí PCR
* Syntéza primerů, které jsou komplementární k částem genu nebo sousední sekvenci a jejich připojení k DNA
* Syntéza nových řetězců DNA-polymerázou
* Oddělení řetězců
* Opakuje se cyklus: připojení primerů – polymerizace – denaturace (20-30x)
* Exponenciální nárůst počtu kopií identické sekvence
* Jedna molekula poskytne až $10^9$ amplikonů
* Amplikon se může klonovat do vektoru
* Do některých organismů lze přenášet i lineární molekuly
* Začlení se rekombinací do genomu

Příprava rekombinantních molekul DNA

*   Cizorodá DNA
*   Klonovaná cizorodá DNA
*   Rekombinantní molekula DNA
*   Selekční marker
*   Štěpení vektoru restrikční endonukleázou BamHI, spojení vektoru s cizorodým fragmentem DNA enzymem DNA-ligázou

Genomová knihovna

Soubor klonovaných fragmentů DNA, které dohromady reprezentují celý genom příslušného organismu
Genová knihovna: naklonované pouze úseky kódující proteiny (2% u člověka)
Konstrukce (lidské) genomové knihovny

Mutageneze in vitro

„site-directed mutagenesis“ = místně cílená/řízená mutageneze
Cíle:
- Analýza vztahu mezi strukturou a funkcí nukleové kyseliny (genů a regulačních oblastí)
- Cílené změny aminokyselin v proteinech
- Řízená evoluce - příprava proteinů s novými vlastnostmi (proteinové inženýrství): využití bioinformatických nástrojů
- Příprava transgenních organismů
Postup: izolace DNA – změna v DNA in vitro – přenos do buňky – exprese - vyhodnocení účinku *Typy:
- Náhodná (který gen zodpovídá za danou vlastnost?)
  - Chemická mutageneze
  - Inkorporace chybných bází
- Cílená *Manipulace s restrikčními místy *Inzerce linkerů vyhledání genu mapováním nebo sekvenováním
  - Oligonukleotidová mutageneze (změna v konkrétním místě genu)
  - Kazetová mutageneze (syntéza mutantního genu)
  - Záměny bází, cílené změny struktury proteinů

Způsoby provedení mutageneze in vitro

*   Nespecifická chemická mutageneze
*   Manipulace s restrikčními místy a enzymatické úpravy DNA
*   Oligonukleotidová mutageneze
*   Kazetová mutageneze

Vytváření mutací

*v restrikčním místě
* Vytváření inzercí nebo delecí v sekvenci genu
* Vznik konců s přesahy
* Úprava konců
* Exonukleáza
* DNA-polymeráza (možnost částečného zaplnění dle výběru dNTP)
*naklonování DNA
*Štěpení DNA, jedno místo v genu
*Oligonukleotidová mutageneze
* konkrétní změna v konkrétním genu
* rodičovská (nemutantní) DNA
* nově syntetizovaná (mutantní) DNA
* mutagenní oligonukleotid
* dvouřetězcová heteroduplexní DNA
* mutantní homoduplex
* přenos do E. coli
* rodičovský homoduplex
*Kazetová mutageneze
* cíl: změna určité části genu
* vyštěpení fragmentu restriktázami
* nahrazení fragmentu uměle syntetizovaným mutantním oligonukleotidem s identickými konci jako má vyštěpený fragment
* kazetových variant se nasyntetizuje mnoho
* ligace a transformace E. coli
* selekce a screening kolonií
* identifikace varianty, která se pro daný účel jeví jako nejlepší

Editace genomů in vivo

Genome editing/genome editing with engineered nucleases - GEEN
- od roku 2000
- cílené změny jakéhokoliv genu u jakéhokoliv organismu in vivo
- do vybraného místa v cílové DNA se vnáší inzerce, delece a nebo se stávající sekvence nahrazuje jinou pomocí uměle připravených nukleáz
- nukleázy vytvářejí na určených místech genomu dvouřetězcové zlomy, čímž stimulují přirozené opravné mechanismy v buňkách založené na:
  - homologní rekombinaci (HR) HDR = homology directed recombination
  - spojování nehomologních volných konců (NHEJ: nonhomologous end-joining)

Nukleázy používané pro editaci genomů

*   Meganukleázy (až 30 nukleotidová cílová sekvence)
*   ZNF
*   TALEN
*   CRISPR/Cas

RNA bridge

Umělé nukleázy - Meganucleases

Jsou přítomny v archebakteriích, bakteriích, kvasinkách, houbách a rostlinách.
Meganukleázy identifikují přibližně 14–40 párů bází v cílových sekvencích. *Výhoda * 18nukleotidová sekvence rozpoznávaná meganukleázou I-SceI by hypoteticky vyžadovala genom 20krát větší než lidský genom, aby se sekvence v genomu náhodně vyskytovala.
- Meganukleázy tvoří v cílovém místě dimer. *Meganukleáza I-OnuI
  - 290 aminokyselinových zbytků je vázáno na cílové místo DNA o délce 22 párů bází.

Umělé nukleázy - ZFN a TALEN

chimérické nukleázy složené z „programovatelné“ sekvenčně specifické domény pro vazbu na DNA a domény pro nespecifické štěpení DNA
připravené genovým inženýrstvím
přerušují oba řetězce dsDNA - „double-strand breaks“
aktivují opravné mechanismy, kterými lze za přítomnosti specifického templátu vnášet trvalé a cílené změny do genomu buňky
nukleázy „na míru“ lze připravit technikami rekombinantní DNA v podobě sekvencí, které je kódují a přenést do buněk transfekčními nebo infekčními postupy
- ZFNs a TALENs se vážou na cílovou sekvenci a orientují doménu restriktázy FokI tak, aby mohla štěpit DNA
- dimerizovaná nukleáza FokI štěpí DNA obou řetězců v oblasti „spacer“
- vzniklé zlomy jsou opraveny reparačními mechanismy, které často vedou k inzerci nebo deleci několika bází („indels“)
- Pro generování ZFP se specificitou pro sekvenci GGGGGTGAC se identifikují tři prsty, z nichž každý se váže na jeden triplet. Tyto prsty se poté propojí můstky.
- RVD - Opakující se variabilní di-zbytky jsou aminokyseliny v pozicích 12 a 13, které určují specificitu k cílovému nukleotidu - T, C, A a G.

Nukleáza Cas9 systému CRISPR

CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
Cas = CRISPR-associated system (Cas9 – endonukleáza)
bakteriální DNáza pro ochranu před fágy
má dvě místa štěpení – po jednom pro každé vlákno DNA
naváděcí „guide“ RNA nukleázu zaměřuje na specifickou sekvenci DNA
ZFN a TALENy vyžadují navržení a syntézu proteinů, které dokáží rozeznat cílovou sekvenci DNA, což je finančně i časově náročnější než při využití komplementárního párování DNA-RNA v případě systému CRISP/Cas
CRISPR/Cas – imunitní systém bakterií
lokus CRISPR - repetitivní sekvence obsahující úseky DNA exogenního původu (virového/plazmidového), tzv. spacery – pozůstatky minulých infekcí
spacery vznikají štěpením fágové/plazmidové DNA nukleázou Cas a jejím začleněním do přední části lokusu CRISPR
spacery se přepisují do prekurzorové pre-crRNA a upravují do podoby krátkých CRISPR RNA (crRNA)
crRNA se vážou k endonukleáze Cas a navádějí ji ke komplementárním sekvencím DNA téhož viru při následných infekcích
nukleáza Cas vytváří dvouřetězcové zlomy - systém získané imunity
lokusy CRISPR se průběžně vyvíjejí - tak, jak se bakterie setkávají s různými fágy
části genomu aktuálních fágů se začleňují do přední části lokusu CRISPR
přitom často z lokusu CRISPR odpadávají stopy dávných infekcí
inovací lokusu CRISPR je bakterie připravena reagovat na aktuální situaci
CRISPR/Cas – využití v genovém inženýrství
připravit konstrukt obsahující úsek přepisovaný do crRNA odpovídající genu, který chceme pozměnit a gen kódující nukleázu Cas9
vnést do buněk - transfekce/infekce
technologie je potenciálně riziková
*možnost zneužití, biologická zbraň?
*možnost zacílení na onkogen: genová terapie rakoviny?

Umělé nukleázy - RNA Bridge

Rekombinázy jsou proteiny, které katalyzují reakce, ve kterých jsou dlouhé úseky DNA invertovány, deletovány nebo vyříznuty z donorové DNA a vloženy do cílové DNA.
Konvenční rekombinázy rozpoznávají sekvence DNA vytvářením rozsáhlých interakcí protein-DNA. Při inzerčních reakcích se čtyři molekuly rekombinázy specificky vážou na sekvenci, která bude od dárce vyjmuta, a na cílovou sekvenci, do které bude vložena DNA dárce.
Je obtížné sestrojit proteiny tak, aby se specificky vázaly na jiné sekvence.

Byly popsány rekombinázy, které používají molekulu RNA, nazývanou „ bridge RNA“ k rozpoznání DNA.
Tato RNA obsahuje dvě smyčky, které se vážou na donorové a cílové sekvence, jak je ukázáno.
Smyčky mohou být nezávisle konstruovány tak, že rekombináza provádí inverze, delece a inzerce uživatelem specifikovaných sekvencí.

Proteinové inženýrství

Cílené pozměňování genů pro cílené modifikace proteinů.
Cíl: změna struktury a funkce proteinů prostřednictvím technologie rekombinantní DNA
- změny vazebných oblastí proteinů
- termostabilita
- citlivost k oxidaci a toxickým látkám
- rychlost a substrátová specifita reakcí
Enzymy obsažené v pracích prášcích
- silně geneticky upravené, aby měly požadované vlastnosti
  - schopnost změkčování vody
  - detergent na odstraňování nečistot - proteinů, barviv, polysacharidů, atd.
  - účinnost při vysoké i nízké teplotě
  - bělící účinek
- Subtilisin, proteáza produkovaná Bacillus subtilis do extracelulárního prostoru, rozkládá substráty a jejich produkty se živí
  - lyzuje řadu substrátů
  - upraven tak, aby vydržel vysoké teploty
  - rozšíření spektra substrátům
  - odolnost vůči bělidlům
  - vše prováděno postupnými záměnami aminokyselin

Exprese exogenu v novém hostiteli

vytváření funkčních produktů klonovaných genů v nepříbuzných organismech pozor na odlišnosti
- regulační sekvence
- využití kodonů
- posttranslační modifikace *Transkripční fúzní vektor
  - obsahuje promotor
  - translační signály - RBS, iniciační kodon poskytuje klonovaná DNA
    *Translační fúzní vektor
- obsahuje signály pro iniciaci transkripce i translace
- klonovaný fragment se začleňuje do kódující oblasti genu obsažené ve vektoru
- inzert musí respektovat čtecí rámec

Inzulin

produkován B buňkami Langerhansových ostrůvků slinivky a vylučován do krve
snižuje hladinu cukru v krvi a antagonizuje funkci glukagonu
používá se pro léčbu cukrovky
proteohormon, u člověka složen ze dvou polypeptidů A a B spojených dvěma disulfidickými můstky *Tvorba inzulinu Sekreční dráha
- ribozom na drsném endoplazmatickém retikulu: syntéza preprohormonu - jeden polypeptid obsahující signální sekvenci a peptidy A, C, B
- vnitřní prostor endoplazmatického retikula: vzniká prohormon - ztráta signální sekvence, vytvoření disulfidických vazeb mezi úseky A a B
- Golgiho aparát: vzniká hormon - inzulin a vyštěpení mezilehlého úseku C
- sekrece do krve
  *Exprese lidského inzulinu v bakteriálních buňkách
- chemická syntéza dvou molekul DNA kódujících řetězce A a B
- klonování do vektoru pBR322 pod kontrolu promotoru lac, spojení s částí genu -gal
- transformace bakterií
- purifikace proteinů
- odštěpení -gal části z proteinové chiméry
- vytvoření S-S můstků mezi řetězci A a B in vitro

Klonování genů v rostlinách pomocí vektorů

vektory založené na přirozeně se vyskytujících plazmidech bakterie Agrobacterium tumefaciens
vektory založené na rostlinných virech

přímý přenos (bez vektorů)
*Využití plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens
* žádný známý plazmid specifický pro rostliny
* bakteriální plazmid Ti („tumor- inducing“) lze do rostlin přenést
* bakterie A. tumefaciens pronikají do dvouděložné rostliny v místě poranění, přenášejí do rostlinných buněk plazmid Ti a vyvolají zde onemocnění „crown gall“ – ložisko plynoucí z nadměrné proliferace buněk

*Plazmid Ti

A. tumefaciens jej dopraví do rostlinných buněk
- část plazmidu (T-DNA) se začleňuje do chromozomové DNA
  Funkční elementy Ti plazmidu
- oblast T *integruje se do chromozomu rostlinné buňky, nese onkogeny *Oblast vir
  - nese geny, jejichž produkty napomáhají přenosu oblasti T
značná velikost plazmidu (cca 200 kb)
Pokud se do T-DNA začlení cizorodá nukleotidová sekvence, dojde k jejímu přenosu do rostlinných buněk.
*Struktura Ti-plazmidu A. tumefaciens
T-DNA: část plazmidu přenášená do rostliny
*onc
* geny zodpovědné za transformaci rostlinných pletiv, tzv. onkogeny, kódující rostlinné hormony
*Ops
* geny zodpovědné za tvorbu opinů (zvláštních aminokyselin pro metabolismus agrobakterií)
*RB a LB
* sekvence nezbytné pro začlenění T-DNA do genomu rostliny
mimo T-DNA
*geny pro katabolismus opinů, jsou pro bakterie zdrojem energie, uhlíku a dusíku
*geny vir pro přenos T-DNA do rostlinných buněk
*Transformace rostlin navozená Ti-plazmidem A. tumefaciens
poraněná rostlina
infekce rostliny bakterií s Ti-plazmidem
přenos T-DNA do rostlinné buňky
*začlenění T-DNA do genomu rostlinné buňky
5. vytvoření krčkového nádoru
*Všechny rostlinné buňky exogen nepřijmou
*malý praktický význam z hlediska biotechnologií
*gen je třeba dopravit do všech buněk organismu
*Regenerace rostlin z transformovaných buněk
*infekce rostlinných buněk A. tumefaciens v kultuře
*selekce transformantů
*regenerace rostliny z transformovaných buněk
*všechny buňky rostliny ponesou klonovaný gen

Využití genového inženýrství u rostlin

Potraviny a krmiva

ovlivňování agronomických vlastností
rezistence k herbicidům
rezistence k patogenům - hmyzu, virům, plísním apod.
*tolerance ke stresům
vodní stres – sucho, teplotní stres – mráz/horko; osmotický stres – zasolení půd
*modifikace posklizňových vlastností
prodloužení skladovatelnosti
zpomalení zrání a navození rezistence k chorobám souvisejícím se skladováním
vylepšování nutriční hodnoty a chuti
produkce sekundárních metabolitů
farmakologické přípravky
technické plodiny
produkce škrobu a olejů pro průmyslové využití
fytoremediace
využití zelených rostlin k odstraňování znečišťujících látek z prostředí
*Transgenní rostliny rezistence k hmyzím škůdcům
využití bílkoviny s toxickými účinky na hmyz, kterou produkují spóry bakterie Bacillus thuringiensis, tzv. -endotoxin
-endotoxin je vysoce jedovatý pro některé skupiny hmyzu, ale zcela neškodný pro savce a člověka
dříve bakterie Bacillus thuringiensis kultivovány ve velkých objemech a jako postřik aplikovány na rostliny (JZD Slušovice)
gen pro -endotoxin později přenesen do rostlin přímo - transgenní brambory, kukuřice, rýže, tabák, rajče, brokolice, bavlník
na toxickou formu se endotoxin mění až ve střevě hmyzu
nepřímý způsob – naklonování genu pro tvorbu toxinu do bakterií kolonizujících rostliny (listy, kořeny) – např. Pseudomonas fluorescens
*Transgenní BT-kukuřice
obsahuje navíc 3 geny
gen podmiňující odolnost rostlin proti hmyzím škůdcům
kódující -endotoxin B. thuringiensis
gen pro odolnost vůči herbicidu Basta
gen pro rezistenci pochází z bakterie Streptomyces
Basta je herbicid s krátkou životností, který je šetrný k prostředí
gen pro odolnost k antibiotiku ampicilinu
selekční marker použitý pro selekci transgenních rostlin (buněk)
gen je bakteriálního původu
*Transgenní rostliny rezistence k herbicidům
plevel negativně ovlivňuje výnos a kvalitu plodiny - konkurence o výživné látky, světlo, zdroj škůdců
herbicidy jsou chemické látky, které narušují některé metabolické procesy v rostlině a poškozují ji
selektivní eliminace plevele je problém, řada herbicidů je totálních – ničí i kulturní plodiny
teprve po vnesení transgenů pro necitlivost k herbicidům do genomu kulturních plodin se dosáhne jeho selektivity
*Transgenní rostliny rezistence k herbicidu glyfozátu (Roundup)
glyfozát – neselektivní/totální herbicid
účinný na 76 ze 78 nejvýznamnějších plevelů
inhibuje enzymy zajišťující syntézu esenciálních aminokyselin
tyto enzymy netvoří živočichové – herbicid jim neškodí
Strategie
vnesení genu pro tvorbu cílového enzymu do kulturních rostlin - větší množství enzymu zlepší odolnost rostlin
vnesení genu pro tvorbu pozměněného - výkonnějšího enzymu
vnesení genu pro tvorbu enzymu, který je k herbicidu odolný
*Transgenní rostliny vylepšení nutričních hodnot plodů a semen nebo rostlinných produktů využívaných průmyslově
rajče FlavrSavr firmy Calgene – nese transgen kódující antisense mRNA genu pro polygalakturonidázu
polygalakturonidáza se podílí na poslední fázi zrání plodů
gen se do rajčat přenesl s cílem zamezit měknutí plodů, ke změně měknutí nedošlo, ale zpomalilo se kažení rajčat, navíc se zlepšila jejich chuť
skladovatelnost/konzumní zralost prodloužena o 1 - 2 týdny
další syntetický gen vložený do rajčat – zamezuje expresi jednoho z genů pro syntézu etylénu
pokud se etylén v průběhu zrání plodů netvoří, plody nečervenají a nedozrávají
sklidí se zelené a etylén je jim aplikován až v okamžiku, kdy mají dozrát
rýže s provitaminem A (karotenem)
řeší nedostatek vitamínu A v chudých zemích (následek šeroslepost, slepota)
do genomu rýže zavedeny 3 geny, jejichž exprese vede k tvorbě provitaminu A
další modifikace rýže má za cíl zvýšit obsah železa
řepka – olej ze semen obsahující zvýšený podíl kys. laurové (mýdla a detergenty)
řepka – olej ze semen bohatý na myristát - kosmetika nebo kys. erukovou - mazadla a výroba nylonu
Arabidopsis a řepka – tvorba biodegradovatelných polymerů využitelných jako plasty – polyhydroxybutyrát
polymery podobné polyesteru ve vláknech bavlníku
kávovník bez kofeinu - v důsledku spontánních mutací nalezena vzácná varianta, u které chybí klíčový enzym pro tvorbu kofeinu
*Transgenní rostliny produkce vakcín rostlinami („jedlé vakcíny“)
rostliny jsou vhodné pro pasivní imunizaci (pojídání transgenních rostlin obsahujících fragmenty protilátek) i aktivní imunizaci (indukci protilátek)
imunizace pojídáním syrové zeleniny obsahující antigen (vakcínu), který indukuje tvorbu imunoglobulinů
povrchový antigen viru hepatitidy B
podjednotka B toxinu cholery
*Transgenní živočichové
studium fungování genů v kontextu celého organismu
vylepšování užitkových vlastností hospodářských zvířat
vytváření cizorodých proteinů
modely studia genetických chorob
hledání možností pro genovou terapii nemocí člověka
Způsoby přenosu genů do savčích buněk
pomocí virových vektorů
bez vektorů – mikroinjekcí
*Přenos exogenu retrovirovými vektory
pomocné živočišné buňky pěstované v kultuře jsou transfekovány rekombinantním retrovirovým vektorem
v transfekovaných buňkách se tvoří retrovirové částice s cizorodou DNA a pučením buňky opouštějí
tyto rekombinantní virové částice se použijí pro infekci cílových buněk
v infikovaných buňkách retroviry zajistí stabilní integraci dané DNA do chromozomu tvorbou provirů
využití možnosti „trans“ komplementace retrovirových funkcí defektním pomocným („helper“) virem nebo hostitelem
funkce, které nelze „trans“ komplementovat, musí kódovat samotný vektor
*Přenos exogenu bez vektoru
nejefektivnějším přenosem do savčích buněk je mikroinjekce
plazmidová nebo lineární DNA je mikroinjekcí přenesena do jádra savčích buněk a začleňuje se do jejich chromozomu
mikroinjekce do oplodněné vaječné buňky se uplatňuje při tvorbě transgenních organismů (krátká kultivace in vitro, implantace do náhradní matky)
mikroinjekce modifikovaných embryonálních kmenových buněk do blastocysty, implantace do náhradní matky - vede k tvorbě chimérických (mozaikovitých) organismů (směs upravených a neupravených buněk)
*Přenos genů do zárodečných myších buněk mikroinjekcí
DNA se mikroinjekcí vpraví do projádra oplozeného myšího vajíčka
po kultivaci in vitro se vajíčka přenesou do náhradní matky, kde se dále vyvíjejí
u přibližně 10 - 30% potomstva bude cizorodá DNA integrována do genomu všech buněk (transgenní myš)
*Přenosy genů do myší prostřednictvím ES buněk
embryonální kmenové (ES) buňky jsou uměle kultivované