Genexpressie – Transcriptie, RNA-processing & Turnover

Genetische informatie-stroom: DNA → RNA → eiwit
- Replicatie: \text{DNA} \xrightarrow{\text{Dd-DP}} \text{DNA}
- Transcriptie: \text{DNA} \xrightarrow{\text{Dd-RP}} \text{RNA}
- Translatie: \text{mRNA} \xrightarrow{\text{ribosoom}} \text{polypeptide}
Alle hoofdklassen RNA’s ontstaan via transcriptie:
- mRNA, tRNA, rRNA, lncRNA, snRNA, snoRNA, enz.
In prokaryoten gebeurt transcriptie en translatie gelijktijdig; in eukaryoten ruimtelijk/-tijds gescheiden (kern vs. cytosol).

Klassiek schema (Crick) kent vier polymerase-typen:
- Dd-DP (DNA-afhankelijk DNA-pol)
- Dd-RP (DNA-afhankelijk RNA-pol)
- Rd-DP (RNA-afhankelijk DNA-pol = reverse transcriptase)
- Rd-RP (RNA-afhankelijk RNA-pol)
Uitzonderingen:
- Reverse transcriptie (retrovirussen, retrotransposons, telomerase).
- RNA-replicatie door Rd-RP (RNA-virussen, sommige eukaryoten).
Virusvoorbeelden: (+)ssRNA SARS-CoV-2 (Rd-RP), (−)ssRNA Influenza, retrovirus HIV (Rd-DP + integratie), dsRNA Rotavirus, dsDNA HPV.
Telomerase: ribonucleoproteïne met dubbele activiteit
- \text{Rd-DP} verlengt telomeren
- \text{Rd-RP} betrokken bij siRNA-silencing.

Prokaryoten: 1 RNA-polymerase + σ-factor, geen kern, snelle respons (co-transcriptionele translatie).
Eukaryoten: 3 RNA-polymerasen (I → rRNA, II → mRNA/lncRNA, III → tRNA/5S rRNA), nood aan algemene transcriptiefactoren, mRNA-processing + export als extra regulatielaag.

RNA-polymerase holo-enzym = \alpha_2\beta\beta'\sigma.
Promotorconsensus:
- \text{−35 box: TTGACA}
- \text{−10 box (Pribnow): TATAAT}
- UP-element stroomopwaarts; discriminator downstream.
Initiatie
- σ bindt −10/−35, α bindt UP.
- Helicase-activiteit ontvouwt 14 bp → transcription bubble.
- Abortieve initiatie + DNA-scrunching zonder primer.
Elongatie
- ‘Promoter escape’: σ valt af, pol glijdt 3′→5′ over matrijs; RNA groeit 5′→3′.
- Proofreading: pyrofosfolyse (PPi-terugreactie) & backtracking-hydrolyse.
Terminatie
- Rho-onafhankelijk: GC-haarspeld + U-spoor.
- Rho-afhankelijk: Rho (ATP-helicase) bindt rut-site, breekt RNA-DNA hybride.

Promotortypen
- Pol I: kernpromotor + upstream control element.
- Pol II: Inr, TATA, BRE, DPE (TATA-/TATA-less promotors).
- Pol III: interne A- en B-boxen (tRNA) of C-box (5S).
Pre-initiatiecomplex (PIC)
- Algemene TF’s (TFIIA, B, D (TBP), E, F, H) + pol II.
- TFIIH = ATP-helicase + kinase: fosforyleert CTD (Ser5 → initiatie; Ser2 → elongatie).
Elongatie / terminatie
- Vergelijkbaar kanaalsysteem als prokaryoten; nucleosoom-remodellering vereist.
- Terminatieresolutie:
  • Pol I: 18-nt signaal + eiwit.
  • Pol II: knip 10–35 nt na \text{AAUAAA} → polyadenylatie.
  • Pol III: poly-U.
α-Amanitine (Amanita phalloides) remt pol II → leverfalen.

rRNA = 70–80 % van totaal RNA.
Eukaryoot
- Nucleolus (NOR-clusters): pre-rRNA 45S door pol I → processing → 18S, 5.8S, 28S.
- 5S rRNA apart door pol III.
- snoRNAs (+ snoRNPs) dirigeren 2′-O-methylaties & pseudouridylaties.
Prokaryoot: polycistronische pre-rRNA (23S, 16S, 5S) met spacers.

Pre-tRNA: leader & trailer wegknippen, eventueel intron-splicing door RNA-endonuclease+ligase.
10–15 % basen chemisch gemodificeerd (methylaties, inosine-vorming = RNA-editing).

5′-capping
- 7-methyl-G via 5′–5′ trifosfaatbinding; extra ribose-methylaties mogelijk.
- Bescherming + ribosoomherkenning.
3′-polyadenylatie
- Cut 10–35 nt na \text{AAUAAA}; Poly(A)-polymerase voegt \approx 200 A’s toe zonder template.
- ↑ stabiliteit, export, translatiestimulatie.
Splicing
- Intron consensus: 5′ GU…AG 3′ + branch-point A.
- Spliceosoom: snRNAs U1/U2/U4/U5/U6 + >200 eiwitten.
- Lariat-mechanisme, co-/post-transcriptioneel.
- Exon-junction complex (EJC) rekruteert NXF1 voor export, medieert NMD.
Alternatieve splicing
- >95 % humane multiexon-genen; versterker/silencer-elementen + SR-/hnRNP-eiwitten.
- Leidt tot proteoomexpansie (>100 000 eiwitten op ~25 000 genen).
Klinische relevantie: fouten in splicing ≈15 % erfelijke ziekten (SMA, DMD, retinitis pigmentosa, enz.).
Progeria (HGPS)
- Puntmutatie in exon 11 van lamine A → cryptische 5′ splice site → deletie 150 nt → progerin.

Def.: co-/post-transcriptionele aanpassing van nucleotidesequentie.
Adenosine → Inosine (A-to-I) door ADAR in tRNA, mRNA, miRNA.
Cytidine → Uridine (C-to-U) in APOB-mRNA: verschil APOB100 (lever) vs. APOB48 (darm).
Insertion/deletion editing: trypanosoma-mitochondriën via guide-RNA’s (U-inserties).
DNA-editing parallel: APOBEC3G deamineert dC in ssDNA → G→A hypermutaties (antiviraal, maar HIV Vif neutraliseert).

Halfwaardetijd mRNA: <30 min (bacterie) tot dagen (eukaryoot).
- Bepaald door poly(A)-lengte, AU-rijke 3′ UTR-elementen.
- Gemeten met pulse-chase.
rRNA/tRNA zeer stabiel; mRNA hoog-turnover → snelle regulatie + enorme amplificatie:
- Voorbeeld zijderups: 2 fibroïne-genen → 10^9 eiwitten/cel in 4 d.

EMSA: mobiliteitsshift van gelabeld DNA met/zonder eiwit.
DNA-footprinting: DNase I + partiële vertering → ‘voetafdruk’ beschermde basen.
ChIP (chromatine-immunoprecipitatie)
- Crosslink, sonicatie, IP met antilichaam; analyse via PCR, microarray (ChIP-chip) of NGS (ChIP-seq).

α-Amanitine vergiftiging (groene knolamaniet): remt pol II → fatale leverafbraak.
Systemic lupus erythematosus: auto-antilichamen tegen snRNPs → wijdverspreide splicing-defecten.
ACE2 als receptor voor SARS-CoV-2; Rd-RP essentieel antiviraal doeleiwit.

Componenten & locatie: 1 RNA-pol (PROK) vs. 3 RNA-pol (EUK); kern scheidt transcriptie/translatie.
Mechanistische vergelijking
- Gelijk: de novo synthese, directionele polymerisatie, abortieve initiatie + proofreading.
- Verschillend: promotorarchitectuur, TF-behoefte, terminatiesignalen.
Spliceosoomuitval (lupus) → massale ORF-verstoring, NMD, foutieve eiwitten → ernstige pathologie.