Genexpressie – Transcriptie, RNA-processing & Turnover

De richting van de genetische informatiestroom

• Genetische informatie-stroom: DNA → RNA → eiwit
  • Replicatie: $\text{DNA} \xrightarrow{\text{Dd-DP}} \text{DNA}$
  • Transcriptie: $\text{DNA} \xrightarrow{\text{Dd-RP}} \text{RNA}$
  • Translatie: $\text{mRNA} \xrightarrow{\text{ribosoom}} \text{polypeptide}$
• Alle hoofdklassen RNA’s ontstaan via transcriptie:
  • mRNA, tRNA, rRNA, lncRNA, snRNA, snoRNA, enz.
• In prokaryoten gebeurt transcriptie en translatie gelijktijdig; in eukaryoten ruimtelijk/-tijds gescheiden (kern vs. cytosol).

Centrale dogma & uitzonderingen

• Klassiek schema (Crick) kent vier polymerase-typen:
  • Dd-DP (DNA-afhankelijk DNA-pol)
  • Dd-RP (DNA-afhankelijk RNA-pol)
  • Rd-DP (RNA-afhankelijk DNA-pol = reverse transcriptase)
  • Rd-RP (RNA-afhankelijk RNA-pol)
• Uitzonderingen:
  • Reverse transcriptie (retrovirussen, retrotransposons, telomerase).
  • RNA-replicatie door Rd-RP (RNA-virussen, sommige eukaryoten).
• Virusvoorbeelden: (+)ssRNA SARS-CoV-2 (Rd-RP), (−)ssRNA Influenza, retrovirus HIV (Rd-DP + integratie), dsRNA Rotavirus, dsDNA HPV.
• Telomerase: ribonucleoproteïne met dubbele activiteit
  • $\text{Rd-DP}$ verlengt telomeren
  • $\text{Rd-RP}$ betrokken bij siRNA-silencing.

Prokaryoten vs. eukaryoten – algemene vergelijking

• Prokaryoten: 1 RNA-polymerase + σ-factor, geen kern, snelle respons (co-transcriptionele translatie).
• Eukaryoten: 3 RNA-polymerasen (I → rRNA, II → mRNA/lncRNA, III → tRNA/5S rRNA), nood aan algemene transcriptiefactoren, mRNA-processing + export als extra regulatielaag.

Prokaryotische transcriptie – mechanisme

• RNA-polymerase holo-enzym = $\alpha_2\beta\beta'\sigma$.
• Promotorconsensus:
  • $\text{−35 box: TTGACA}$
  • $\text{−10 box (Pribnow): TATAAT}$
  • UP-element stroomopwaarts; discriminator downstream.
• Initiatie
  • σ bindt −10/−35, α bindt UP.
  • Helicase-activiteit ontvouwt 14 bp → transcription bubble.
  • Abortieve initiatie + DNA-scrunching zonder primer.
• Elongatie
  • ‘Promoter escape’: σ valt af, pol glijdt 3′→5′ over matrijs; RNA groeit 5′→3′.
  • Proofreading: pyrofosfolyse (PPi-terugreactie) & backtracking-hydrolyse.
• Terminatie
  • Rho-onafhankelijk: GC-haarspeld + U-spoor.
  • Rho-afhankelijk: Rho (ATP-helicase) bindt rut-site, breekt RNA-DNA hybride.

Eukaryotische transcriptie – mechanisme

• Promotortypen
  • Pol I: kernpromotor + upstream control element.
  • Pol II: Inr, TATA, BRE, DPE (TATA-/TATA-less promotors).
  • Pol III: interne A- en B-boxen (tRNA) of C-box (5S).
• Pre-initiatiecomplex (PIC)
  • Algemene TF’s (TFIIA, B, D (TBP), E, F, H) + pol II.
  • TFIIH = ATP-helicase + kinase: fosforyleert CTD (Ser5 → initiatie; Ser2 → elongatie).
• Elongatie / terminatie
  • Vergelijkbaar kanaalsysteem als prokaryoten; nucleosoom-remodellering vereist.
  • Terminatieresolutie:
    • Pol I: 18-nt signaal + eiwit.
    • Pol II: knip 10–35 nt na $\text{AAUAAA}$ → polyadenylatie.
    • Pol III: poly-U.
• α-Amanitine (Amanita phalloides) remt pol II → leverfalen.

RNA-processing: rRNA

• rRNA = 70–80 % van totaal RNA.
• Eukaryoot
  • Nucleolus (NOR-clusters): pre-rRNA 45S door pol I → processing → $18S, 5.8S, 28S$.
  • 5S rRNA apart door pol III.
  • snoRNAs (+ snoRNPs) dirigeren 2′-O-methylaties & pseudouridylaties.
• Prokaryoot: polycistronische pre-rRNA (23S, 16S, 5S) met spacers.

RNA-processing: tRNA

• Pre-tRNA: leader & trailer wegknippen, eventueel intron-splicing door RNA-endonuclease+ligase.
• 10–15 % basen chemisch gemodificeerd (methylaties, inosine-vorming = RNA-editing).

RNA-processing: mRNA (eukaryoot)

• 5′-capping
  • 7-methyl-G via 5′–5′ trifosfaatbinding; extra ribose-methylaties mogelijk.
  • Bescherming + ribosoomherkenning.
• 3′-polyadenylatie
  • Cut 10–35 nt na $\text{AAUAAA}$; Poly(A)-polymerase voegt $\approx 200$ A’s toe zonder template.
  • ↑ stabiliteit, export, translatiestimulatie.
• Splicing
  • Intron consensus: 5′ GU…AG 3′ + branch-point A.
  • Spliceosoom: snRNAs U1/U2/U4/U5/U6 + >200 eiwitten.
  • Lariat-mechanisme, co-/post-transcriptioneel.
  • Exon-junction complex (EJC) rekruteert NXF1 voor export, medieert NMD.
• Alternatieve splicing
  • >95 % humane multiexon-genen; versterker/silencer-elementen + SR-/hnRNP-eiwitten.
  • Leidt tot proteoomexpansie (>100 000 eiwitten op ~25 000 genen).
• Klinische relevantie: fouten in splicing ≈15 % erfelijke ziekten (SMA, DMD, retinitis pigmentosa, enz.).
• Progeria (HGPS)
  • Puntmutatie in exon 11 van lamine A → cryptische 5′ splice site → deletie 150 nt → progerin.

RNA-editing

• Def.: co-/post-transcriptionele aanpassing van nucleotidesequentie.
• Adenosine → Inosine (A-to-I) door ADAR in tRNA, mRNA, miRNA.
• Cytidine → Uridine (C-to-U) in $APOB$-mRNA: verschil $APOB100$ (lever) vs. $APOB48$ (darm).
• Insertion/deletion editing: trypanosoma-mitochondriën via guide-RNA’s (U-inserties).
• DNA-editing parallel: APOBEC3G deamineert dC in ssDNA → G→A hypermutaties (antiviraal, maar HIV Vif neutraliseert).

RNA-turnover & amplificatie

• Halfwaardetijd mRNA: <30 min (bacterie) tot dagen (eukaryoot).
  • Bepaald door poly(A)-lengte, AU-rijke 3′ UTR-elementen.
  • Gemeten met pulse-chase.
• rRNA/tRNA zeer stabiel; mRNA hoog-turnover → snelle regulatie + enorme amplificatie:
  • Voorbeeld zijderups: 2 fibroïne-genen → $10^9$ eiwitten/cel in 4 d.

Key-technieken voor DNA-eiwit-interacties

• EMSA: mobiliteitsshift van gelabeld DNA met/zonder eiwit.
• DNA-footprinting: DNase I + partiële vertering → ‘voetafdruk’ beschermde basen.
• ChIP (chromatine-immunoprecipitatie)
  • Crosslink, sonicatie, IP met antilichaam; analyse via PCR, microarray (ChIP-chip) of NGS (ChIP-seq).

Medische implicaties & toxines

• α-Amanitine vergiftiging (groene knolamaniet): remt pol II → fatale leverafbraak.
• Systemic lupus erythematosus: auto-antilichamen tegen snRNPs → wijdverspreide splicing-defecten.
• ACE2 als receptor voor SARS-CoV-2; Rd-RP essentieel antiviraal doeleiwit.

Concept-checks – samenvatting

• Componenten & locatie: 1 RNA-pol (PROK) vs. 3 RNA-pol (EUK); kern scheidt transcriptie/translatie.
• Mechanistische vergelijking
  • Gelijk: de novo synthese, directionele polymerisatie, abortieve initiatie + proofreading.
  • Verschillend: promotorarchitectuur, TF-behoefte, terminatiesignalen.
• Spliceosoomuitval (lupus) → massale ORF-verstoring, NMD, foutieve eiwitten → ernstige pathologie.