Proteine 與 Enzyme—綜合筆記（繁體中文）

第一部分：遺傳資訊與翻譯的理論知識

  • 中心法則（Central Dogma）描述：DNA 轉寫成 messenger RNA（mRNA），再由 mRNA 合成蛋白質
  • 警語與修正：這個觀點現今被認為有局限性，應不斷被質疑與更新

第二部分：mRNA 到 蛋白質的路徑與 Codon 概念

  • 三聯體（Tripletts）/ 三連鹼對（codon）是編碼單位：連續的三個鹼基決定一個氨基酸
  • Codon 的單位：三個鹼基（Triplets）組成一個 Codon，編碼一個特定氨基酸
  • Codon 的定義：mRNA 上的三鹼基序列，對應某個氨基酸
  • Codon-Sonne（編碼圖像）：展示遺傳密碼的關係，內端從 5' 端讀到 3' 端
  • 例子：AUG 代表甲硫氨酸（Met）
  • 同一個氨基酸可由多個不同的三連鹼基編碼（例如 Threonin Thr 亦可由不同 Tripletts 編碼），顯示密碼的冗餘性

第三部分：蛋白質用氨基酸（蛋白質生成氨基酸）之結構與性質

  • 蛋白質生成氨基酸定義：組成蛋白質的氨基酸
  • 結構：所有蛋白質用氨基酸皆為 α-氨基酸（α-Aminocarbonsäuren）。唯有其側鏈不同
  • 基本結構：中樞碳原子（α-碳）連結：羧基、氨基、氫、以及側鏈
  • 側鏈：變化的部分，決定大小、化學反應性、電荷與分子量
  • 立體異構：若為左手（L-）形式，Fischer 投影中 α-碳的胺基位於左側
  • 約略結論：除甘氨酸外，所有蛋白質生成氨基酸在 α-碳 皆有手性中心

第四部分：氨基酸的分類與特徵

  • 未帶電、非極性側鏈（ ungeladene unpolare Seitenkette）
    • 這類氨基酸缺乏極性基團，較不活化
  • 未帶電、極性/親水側鏈（ ungeladene polare/hydrophile Seitenkette）
    • 側鏈可含有 OH 或在半胱胺酸（Cys）有巰基末端
    • 半胱胺酸特點：能形成二硫鍵（disulfidbrücken）
  • 帶正電的側鏈（ positiv geladene Seitenkette）
    • 在生理 pH 7 下，側鏈胺基會質子化
    • 例：賴氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、組胺硫鹼酸的組胺爭（Histidin）等
    • 具體說明：Lys 有一個初級胺基在生理 pH 下質子化；Arg 有胍基在生理 pH 下質子化；His 的咪唑環在生理 pH 下質子化
  • 帶負電的側鏈（ negativ geladene Seitenkette）
    • 負電荷來自側鏈的額外羧基
  • 第三類：特例與說明
    • Cystein 的特殊性：可形成二硫鍵
    • Glycin（Gly）是唯一沒有手性的氨基酸

第五部分：氨基酸的酸鹼性與等電點（pH 與 pK）

  • 氨基酸是等兩性物質（Ampholyte）：能在不同 pH 下既失去也得到質子
  • 至少具有兩個 pK 值：Carboxyl 基（pKa1）與 Amino 基（pKa2）
  • 酸性氨基酸與鹼性氨基酸因為側鏈還有第三個可電離的基團，因而有第三個 pK 值
  • 酸性環境（低 pH）時：氨基酸總帶正電 (+1)
  • 中性環境（中性 pH）時：Amino 基質子化、Carboxyl 基去質子化，整體電荷為 0
  • 鹼性環境（高 pH）時：兩個基本基團都去質子，整體帶負電（-1）或更多
  • 緩衝區與 pI（等電點）說明：在 pH-曲線中，存在緩衝區，能在某些 pH 範圍內緩衝 pH 而不改變電荷
  • 例子說明：Gly（甘氨酸）為未帶負電之未極性 AS，有兩個 pK 值；Glutamat（谷氨酸）為酸性氨基酸，具有額外的第三個可離解的側鏈，形成第三個 pK 值，即「側鏈 pK 值」（pK_Side chain）
  • 摘要：不同氨基酸的 pK 指引出它們在緩衝曲線中的位置與等電點

第六部分：肽鍵與肽段構成

  • 肽鍵（Peptidebindung）由兩個氨基酸間 α-羧基與 α-胺基之間的縮合反應形成，釋放水分子
  • 條件與影響：在體內高水濃度下，反應平衡偏向自由氨基酸，需要活化能量使反應發生
  • 共振穩定性（Mesomerie）
    • 肽鍵的四個原子在共振穩定之下，介於單鍵與雙鍵之間，平面排列，對肽鍵的旋轉受限
  • 為何旋轉被限制的重要性：避免側鏈之間的過度干涉，使肽鏈能呈現穩定折疊與結構

第七部分：蛋白質的三維結構層次

  • 總結：由百餘個氨基酸透過肽鍵連結，形成蛋白質的功能單位
  • 四層結構分類：Primär、Sekundär、Tertiär、Quartär
  • 1. Primär結構（Primary structure）
    • 定義：蛋白質中氨基酸的順序（序列）
    • 由基因密碼子確定
    • N端（N-terminus）與 C端（C-terminus）之定義與方向：通常從 N 端到 C 端閱讀
  • 2. Sekundär結構（Secondary structure）
    • 定義：不考慮側鏈，只描述局部空間排列
    • 形成原因：肽鍵的羰基與氫原子之間形成氫鍵
    • 類型：α-螺旋（α-Helix）、β-折疊/β-片層（β-Faltblatt）等
    • α-螺旋：每一圈包含大約 3.6 個氨基酸；骨架的 C=O 與 N-H 之間形成氫鍵
    • β-折疊：2 條以上肽鏈以氫鍵連結
    • 平行β-折疊與 反平行β-折疊（Paralleles / Antiparalleles）
    • 其他：β-turn、Ω-迴圈，以及 random coils（無規律的區域）
  • 3. Tertiärstruktur（第三級）
    • 定義：不同二級結構的穩定三維排列，受肽鏈側鏈間相互作用所穩定
    • 主要類型：共價鍵（如二硫鍵）與非共價相互作用（氫鍵、范德瓦爾力、疏水相互作用、離子鍵等）
    • 影響：決定蛋白質的整體形狀與功能
  • 4. Quartärstruktur（第四級）
    • 定義：當蛋白質由多條肽鏈組成、組裝成多亞基（subunits）時形成的結構
    • 亞單位類型：同型聚體（Homooligomer，相同亞單位）與異型聚體（Heterooligomer，不同亞單位）
    • 最高的結構層次，描述多肽鏈如何組裝成複合體

第八部分：乳酸脫氫酶（LDH）之同工型與電泳分離

  • 試驗內容概述：LDH 同工型在 2 安瓿琼膠電泳中分離
  • LDH 的同工型（Isoenzymes, LDH-I to LDH-Ⅴ）
    • LDH-1（H4，心臟）：主要在心臟
    • LDH-2（M1H3，淋巴系統）
    • LDH-3（M2H2，肺）
    • LDH-4（M3H1，腎）
    • LDH-5（M5，肝臟與橫紋肌）
  • 結果與臨床意義：不同組分的定位可協助診斷器官受損部位
  • 蛋白質電泳基本概念：原生蛋白質（native）在未變性的情況下進行電泳分離
  • 電泳原理：離子在電場中移動速率由電荷量、分子大小與形狀決定
  • 材料與介質：Agarose 網絡形成孔道，影響分離路徑，使分離清晰可見，便於染色觀察
  • 典型示意：樣品置於膠的負極，因為整體帶負電而向正極移動；較強的負電荷移動到正極較遠的位置

第九部分：蛋白定量—Biuret 方法與實驗要點

  • Biuret 方法原理：在鹼性環境中，肽鍵與銅(II)離子（Cu^{2+}）反應，形成藍色的配位複合物，其顏色深淺與蛋白濃度成正比
  • 酒精與鹼性條件：樣品在鹼性條件中進行，Cu^{2+} 與肽鍵共價鍵配位
  • 實驗流程要點：在樣品中加入 Cu^{2+}，觀察顏色變化；利用分光光度計在 546 nm（或 Skript 指定的 579 nm）測光密度，求取蛋白濃度
  • 定量範圍： Biuret 方法的靈敏度較低，約 1–10 μg/mL 的蛋白
  • 討論與限制：依賴鹼性環境與肽鍵數量，對低濃度蛋白靈敏度較低

第十部分：以肝臟中的精氨酸酶（Arginase）為例的酶活性測定

  • 背景：酶是蛋白質的生物催化劑，降低反應活化能，讓反應在生理條件下進行

  • 酶的特性：具有高度專一性、在生理條件下有效、受調控

  • 關鍵術語與概念：

    • 酶促反應的機理通常以「底物-酶-產物」的動力學建立（S, E, ES, P）
    • 傳統的催化機制可用「鍵匙與鎖匙」（Key–Lock principle）描述，活性位點（Active site）對底物有特定匹配

  • Michaelis-Menten 動力學概述：

    • 速率依底物濃度與酶濃度而變，呈現飽和型曲線
    • 假設：ES 複合物的形成與解離可視為平衡
    • 反應式與速率常數：
    • v1、v{-1} 為 ES 的生成與解離速率；v2、v{-2} 為 ES 轉化為 E 與 S 的速率與分解速率
    • 公式：v=V<em>extmax[S]K</em>M+[S]v = \frac{V<em>{ ext{max}} [S]}{K</em>M + [S]}
    • 重要參數：
    • Michaelis 常數 K_M：底物與酶結合的親和力指標（低值意味高親和力）
    • v_{ ext{max}}：當酶被底物飽和時的最大速率
    • k_{ ext{cat}}（轉換數/位酶秒）與換算效率

  • 影響因素：溫度、pH、底物濃度、酶濃度

  • 進一步：Lineweaver-Burk 繪圖法（雙倒數表示）可用於求取 vmax 與 KM

  • 單位與衡量：

    • Enzymaktivität（酶活性）以 katal（kat）或 U（國際單位）表示
    • 1 katal = 1 mol 反應物在 1 秒內轉化為產物
    • 1 U = 1 μmol 反應物在 1 分鐘內轉化
    • 轉換關係：1 U = 1 nkat

第十一部分：Harnstoffzyklus（尿素循環）與 Arginase 在肝臟中的角色

  • 基本概念：Harnstoffzyklus 是肝細胞特有的循環路徑，將氨（NH3）與碳酸氫鹽（HCO3−）轉化為尿素，以排除氮
  • 目的：排出氮，尿素相對於氨具有較低毒性，且能穿過生物膜
  • 大致流程（與本實驗內容相關的點）
    • NH4+ 與 HCO3− 在反應中活化為 Carbamoylphosphate，之後與 Aspartat 產生尿素與 fumarat
    • Arginase 是第五步，水解 Arginin 生成尿素與 ornithin，ornithin 再透過 antiport 回到線粒體中
  • Arginase 的重要性：肝臟中 Arginase 活性作為評估酶量與肝功能的一種手段
  • 整體結論：Arginase 對肝臟尿素合成路徑的貢獻，並與氮代謝的整體調控有關

第十二部分：以 Arginase 活性測定為例的實驗設計與步驟

  • 實驗設計概覽：測量肝臟同型組織的 Arginase 活性
  • 對照與標準：使用尿素標準品，將產生的尿素濃度轉換為 μmol/min（U）
  • 步驟概覽（要點）：
    1) Arginase 反應在 37°C 下孵育 10 分鐘
    2) 停止反應，加入高氯酸（HClO4）使蛋白沉澱與失活
    3) Aliquot 取出一部分混合物於 Urease 反應中，室溫下再孵 5 分鐘
    4) 加入 Hypochlorit（ClO−）與 Salicylat，與 NH3 形成綠色顏色複合物
    5) 使用比色計測定吸光度，與尿素標準對照求出樣本中的尿素量
    6) 零值（Blank）：包含肝臟匯含有的既有尿素量，不計入測定
    7) 計算：將吸光度轉換為 μmol 尿素，表示為每分鐘轉化的尿素量（單位 U 或 kat）
  • 重要注意事項：
    • 反應停止與沉澱的處理需要避免後續干擾
    • Aliquot 的使用是為了多次測定或避免整體樣本的性質改變
    • Null value 與標準樣品的比較是定量的核心
    • 本實驗中 Ammonia 來源於尿素水解過程，在鹼性條件中呈現

第十三部分：實驗與計算的導向性問題

  • 想想看：為何加入酸（酸性條件）？何時加入？會如何影響反應與測定？
  • 為何使用 Aliquot？為何不直接處理整個樣本？（以避免重複或混雜）
  • 為何需要建立 Zero 值（Null value）？其在定量中扮演什麼角色？
  • 根據 Skript 與實驗數據，如何推算 0.25 μmol 的量？該怎麼計算？
  • 以上問題有助於理解實驗設計的原理與數據解釋，並能提升實驗室分析能力

附註：重要公式與定義彙整

  • 核心公式：Michaelis-Menten 動力學
    • v=V<em>extmax[S]K</em>M+[S]v = \frac{V<em>{ ext{max}} [S]}{K</em>M + [S]}
  • 等電點與 pK 的敘述性表達
    • 等電點（pI）定義：在該 pH 下，氨基酸整體淨電荷為 0
  • 肽鍵的生成與性質
    • 肽鍵形成：兩個氨基酸間的 α-羧基與 α-胺基之間發生縮合，釋放水分子
    • ext{A}1- ext{COOH} + ext{H}2 ext{N-A}2 ightarrow ext{A}1- ext{CO}- ext{NH}- ext{A}2 + ext{H}2 ext{O}
  • 蛋白質三維結構層級
    • Primär、Sekundär、Tertiär、Quartär 的定義與特徵
  • LDH 同工型與組織定位
    • LDH1: H4（心臟）；LDH5: M5（肝與橫紋肌）等
  • Biuret 方法要點
    • 反應物：肽鍵 + Cu^{2+} 在鹼性條件下形成藍色配位複合物
    • 光度測量：最大吸收在 546 nm（有時 579 nm）
  • Arginase 與尿素循環的關鍵步驟
    • Arginase 催化 Arg -> 尿素 + 運旨氨基酸 Ornithine
    • 尿素循環的核心思想：將氮排出體外，並以尿素方式運輸
  • Urease 相關分析
    • 尿素水解：
    • net： ext{(NH}2)2 ext{CO} + ext{H}2 ext{O} ightarrow ext{NH}4^+ + ext{HCO}_3^-（實驗報告中的表述）
    • 之後的處理步驟以產生綠色螯合物進行比色測定

小結

  • 本筆記彙整了從基礎遺傳學到蛋白質結構、以及實驗技術（電泳、Biuret 定量、Arginase 活性與 Urease 聯動檢測）的核心與細節，重點涵蓋：中心法則的修正觀點、密碼子與氨基酸的編碼與結構特徵、肽鍵與蛋白質結構層次、同工型的臨床意義、定量方法的原理與限制、以及尿素循環與相關測定的實務流程與思考題。