Sequenziamento Sanger

Sequenziamento Sanger
Che cos’è la tecnica?

  • Metodo per determinare l'ordine preciso dei nucleotidi (A, T, G, C) in una sequenza di DNA.

  • Conosciuto come "metodo di terminazione della catena" per l'interruzione controllata della sintesi del DNA.

  • Sviluppato nel 1977 da Frederick Sanger, ancora in uso in forma automatizzata.

  • Le macchine producono un cromatogramma per visualizzare la sequenza nucleotidica.

Principio chimico-biologico del sequenziamento

Principio

  • La DNA polimerasi aggiunge nucleotidi complementari al filamento stampo.

  • Necessita del gruppo 3'-OH per formare legami fosfodiesterici.

  • I dideossinucleotidi (ddNTP) sono incorporati casualmente, privi del gruppo 3'-OH.

  • Questo causa un'interruzione irreversibile della catena, bloccando ulteriori legami.

Ruolo della DNA polimerasi

  • Inizia la sintesi con nucleotidi normali (dNTP).

  • Se incorpora un ddNTP, la sintesi si arresta, creando frammenti di DNA di diverse lunghezze.

Generazione di frammenti di DNA

  • L'incorporazione casuale di ddNTP produce frammenti.

  • Questi frammenti sono separati tramite elettroforesi per determinare la sequenza.

Strumenti e materiali usati

  • Provette: Quattro provette con ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP marcati con pigmento fluorescente.

  • Reagenti: DNA template singolo filamento, DNA polimerasi, primer specifico, dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).

  • Strumentazione di analisi: Tubo con gel elettroforetico (o elettroforesi capillare), laser, rilevatori per fluorofori, computer per cromatogramma.

Passaggi step-by-step della tecnica

  1. Preparazione della reazione: DNA template, primer, DNA polimerasi, dNTP e un ddNTP specifico marcato in provette.

  2. Sintesi e terminazione: La DNA polimerasi aggiunge dNTP, ma si blocca con l'incorporazione di un ddNTP (privo di 3'-OH).

  3. Generazione di frammenti: Si formano frammenti di DNA di varie lunghezze, ognuno terminante con un ddNTP.

  4. Separazione elettroforesi: I frammenti sono separati per dimensione tramite elettroforesi capillare (i più piccoli migrano più rapidamente).

  5. Lettura della sequenza: La sequenza si ricava leggendo le bande del gel o l'elettroferogramma (ogni picco colorato è un nucleotide).

Risultati prodotti dalla tecnica

  • Una popolazione di frammenti di DNA di lunghezza variabile, terminati da un ddNTP specifico.

  • Separazione tramite elettroforesi produce bande (metodo classico) o picchi fluorescenti (metodo automatico).

  • La lettura permette di derivare la sequenza nucleotidica complementare all'originale.

  • Consente identificazione di mutazioni puntiformi, polimorfismi (SNP), inserzioni geniche e analisi di regioni associate a malattie.

Interpretazione dei risultati

Metodo classico: gel e autoradiografia

  • Quattro corsie, una per ddNTP (A, T, C, G).

  • Si legge dal basso verso l'alto (5' → 3'), seguendo l'ordine delle bande nelle corsie.

Metodo automatico: elettrofogramma

  • Tutti i ddNTP fluorescenti in un'unica provetta; frammenti separati in un capillare.

  • Laser eccita i fluorofori e un detector registra i segnali colorati.

  • L'elettroferogramma mostra picchi colorati ordinati per lunghezza, letti da sinistra a destra per ricavare la sequenza.

  • Picchi doppi indicano eterozigosi o varianti.

Applicazioni reali della tecnica Sanger

  1. Diagnosi mediche e genetiche: Identifica mutazioni che causano malattie ereditarie (es. fibrosi cistica, mutazioni BRCA1/2, talassemie). Conferma mutazioni e analizza geni per la farmacogenomica.

  2. Identificazione forense: Per identificare individui da DNA, confermare profili STR e analizzare reperti degradati.

  3. Verifica di OGM: Valida l'inserimento di transgeni, controlla sequenze di promotori e geni reporter, verifica assenza di mutazioni indesiderate.

Caso reale famoso: Progetto Genoma Umano (1990-2003)

  • Il sequenziamento Sanger è stato lo strumento principale per mappare il genoma umano completo.

  • Oltre il 90\% del progetto realizzato con sequenziamento Sanger automatico (Dye Terminator).

Limiti ed errori della tecnica Sanger

Limiti

  • Affidabilità: Efficace per sequenze fino a circa 1200\ basi.

  • Accuratezza: Elevata precisione per sequenze specifiche e rilevazione di mutazioni.

  • Idoneità: Adatto per l'identificazione di mutazioni puntiformi e polimorfismi.

  • Standardizzazione: Tecnica consolidata e ampiamente utilizzata.

  • Bassa produttività: Sequenzia al massimo \approx 800-1200\ basi per reazione, meno delle tecniche NGS.

  • Necessità di primer specifici: Richiede conoscenza parziale della sequenza, non idonea per sequenze totalmente sconosciute.

  • Sensibilità: Soggetta a interferenze da strutture secondarie del DNA (es. hairpin).

  • Adattabilità: Non adatta per miscele eterogenee; sequenzia tipicamente un singolo allele dominante.

  • Qualità del campione: Richiede DNA purificato; impurezze possono inibire la polimerasi.

Conclusioni

  • Il sequenziamento Sanger determina l'ordine dei nucleotidi del DNA tramite terminazione della catena con ddNTP marcati.

  • Genera frammenti di diverse lunghezze, letti via elettroforesi o elettroferogramma per ricostruire la sequenza.

  • È stato la base del Progetto Genoma Umano ed è essenziale per analisi precise di mutazioni, polimorfismi e verifiche genetiche.

  • Applicazioni principali: diagnosi mediche, identificazione forense, controllo OGM.

  • Nonostante limiti come la bassa produttività e la necessità di primer, l'accuratezza e l'affidabilità lo mantengono come uno standard.