Notas Exhaustivas sobre la Transferencia de Genes en Células Animales

Introducción a la Modificación Genética de Células Animales

• Importancia del proceso: La modificación genética de células animales es fundamental tanto para la investigación básica como para la biotecnología aplicada. Permite el estudio de la función y regulación génica, la producción de proteínas recombinantes y la manipulación del genoma endógeno.

• Uso de células de mamíferos: Son los huéspedes más comunes para la entrega de genes. Su ventaja principal es la capacidad de realizar modificaciones postraduccionales auténticas que bacterias, levaduras o plantas no pueden ejecutar.

• Productos valiosos: Se sintetizan a escala comercial anticuerpos, hormonas, factores de crecimiento, citoquinas y vacunas.

• Sistemas de entrega: Se basan en vectores virales, bacterianos y sintéticos. Aunque predominan las líneas celulares de mamíferos, otros sistemas como el de baculovirus en insectos han ganado popularidad.

• Aplicaciones in vivo: La aplicación más crítica es la terapia génica in vivo, introduciendo ADN en humanos para tratar enfermedades. Los vectores virales son preferidos por su eficiencia, pero los métodos no virales (liposomas, bombardeo de partículas, ultrasonido) se investigan por razones de seguridad.

• Células somáticas vs. germinales: Las células somáticas animales tienen un potencial de desarrollo restringido y no generan animales transgénicos. La transformación de la línea germinal requiere transferir genes a células pluripotentes o totipotentes (ovocitos, embriones tempranos, células madre embrionarias murinas).

Estrategias Principales para la Transferencia de Genes

Existen cuatro mecanismos principales de entrega (Figura 12.1):

• Mecanismos Biológicos (Traducción y Bactofección):

  • Traducción: Uso de vectores virales. El transgén se añade al genoma viral completo o reemplaza genes virales, explotando la capacidad natural del virus para infectar células.

  • Bactofección: Uso de bacterias (generalmente invasivas como Salmonella, Listeria o Shigella) que llevan el transgén en un plásmido independiente de su propio genoma.

• Mecanismos No Biológicos (Transfección):

  • Transfección química: Persuade a las células a absorber ADN del entorno formando complejos sintéticos.

  • Transfección física: Utiliza fuerzas físicas para introducir ADN desnudo directamente en la célula.

Métodos de Transfección Química

• Método del Fosfato de Calcio ($CaPO_4$):

  • Mecanismo: Formación de un co-precipitado fino de ADN y fosfato de calcio que se deposita sobre las células y se internaliza por endocitosis. Algunos fragmentos de ADN escapan al núcleo para su expresión.

  • Historia: Reportado por Szybalska & Szybalski (1962) y popularizado por Graham & van der Erb (1973).

  • Limitaciones: Adecuado para monocapas o suspensiones, pero no para células en grumos. La eficiencia original era baja ($1-2\%$), pero mejoras han permitido hasta un $20\%$. Es difícil de controlar debido a la sensibilidad al pH, concentraciones de iones y técnica de mezcla.

• Poliplejos (Polyplexes):

  • Definición: Complejos solubles formados por interacciones electrostáticas espontáneas entre el ADN y compuestos policatiónicos.

  • DEAE-dextrano: Primer polímero usado. Eficiente para transfección transitoria pero incapaz de generar líneas estables; ha caído en desuso.

  • Poliaminas sintéticas y PEI: Los polietileniminas (PEI) son cadenas de hidrocarburos con nitrógenos en cada tercera posición, maximizando la carga positiva. Los dendrímeros son moléculas esféricas complejas (capas alrededor de un iniciador como amoníaco) que permiten complejos homogéneos.

  • Polímeros responsivos a estímulos: Desarrollo reciente para regular la expresión in vivo. Algunos cambian su afinidad al ADN por luz UV (polímeros de azobenceno) o calor. Los basados en N-isopropilacrilamida (PIPAAm) transicionan a los $32\,^{\circ}C$. Por debajo de esta temperatura son hidrofílicos (complejo laxo para transcripción); por encima son hidrofóbicos (complejo compacto para absorción y protección contra nucleasas).

• Liposomas y Lipoplejos (Lipofección):

  • Definición: Vesículas de fosfolípidos fusogénicos. Las mezclas de lípidos catiónicos y neutros forman lipoplejos que interactúan con la membrana celular, promoviendo la entrada por endocitosis.

  • Ventajas: Baja toxicidad, simplicidad, alta eficiencia (hasta $90\%$ de células), y capacidad para transportar fragmentos grandes de ADN (como YACs).

  • Uso in vivo: Permiten la transformación tras la inyección en tejidos o el torrente sanguíneo.

Métodos de Transfección Física

• Electroporación: Generación de poros nanométricos transitorios en la membrana mediante pulsos eléctricos breves. Requiere determinar empíricamente la intensidad y duración del pulso. Puede causar hasta un $50\%$ de muerte celular para máxima eficiencia. Se usa in vivo con electrodos de superficie o de aguja.

• Ultrasonido (Sonoporación): El uso de ondas de baja frecuencia causa cavitación (formación y colapso de burbujas), abriendo poros en la membrana. Es seguro y deja el ADN intacto estructuralmente.

• Microinyección: Entrega directa al núcleo mediante agujas microscópicas. Garantiza el éxito pero se limita a pocas células por experimento. Es la técnica principal para ovocitos y embriones.

• Inyección Hidrodinámica: Transferencia de grandes volúmenes de ADN en solución salina al torrente sanguíneo para alcanzar órganos internos.

• Bombardeo de Partículas (Biobalística): Recubrimiento de partículas metálicas pequeñas con ADN que se aceleran mediante gas a alta presión o descarga eléctrica. Común para cortes de tejido (slices) o células de la piel in vivo.

Transformación Transitoria vs. Estable

1. Etapa de Transfección: Introducción del ADN al citoplasma (muy eficiente).

2. Etapa de Integración: Incorporación al núcleo y al cromosoma del huésped (ineficiente).

• Transformación Transitoria: El ADN permanece extracromosómico, se diluye y degrada rápidamente (persiste de 1 a 2 días; hasta 80 horas en células 293). Útil para ensayos rápidos de expresión.

• Transformación Estable: Integración genómica que genera una línea celular heretable. Requiere selección para aislar los raros eventos de integración del fondo transitorio.

Marcadores de Selección para Células Animales

• Marcadores Endógenos: Requieren líneas celulares mutantes deficientes.

  • Ejemplo TK/HPRT: Células deficientes en Timidina Kinasa (TK) o Hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HPRT) mueren sin la vía de salvamento cuando la vía de novo es bloqueada por aminopterina o metotrexato (Medio HAT: Hipoxantina, Aminopterina, Timidina).

• Marcadores Dominantes: Genes de resistencia bacterianos que funcionan en cualquier tipo celular.

  • neo (nptII): Confiere resistencia a los antibióticos aminoglucósidos (G418, neomicina, kanamicina).

  • pac: Resistencia a puromicina.

  • hpt: Resistencia a higromicina-B.

• Amplificación Génica In Situ:

  • Sistema DHFR/Metotrexato: El metotrexato ($MTX$) inhibe la dihidrofolato reductasa ($DHFR$). Al aumentar gradualmente la dosis de $MTX$, se seleccionan células que han amplificado el locus $Dhfr$. Si un transgén está ligado al marcador, también se amplifica, logrando una expresión masiva. Se usan preferentemente células CHO con mutaciones dhfr.

Genes Reporteros y Análisis de Promotores

• Propósito: Codifican productos fácilmente detectables y cuantificables para medir la eficiencia de transformación o la actividad de un promotor.

• CAT (Cloranfenicol acetiltransferasa): Primer reportero usado comercialmente. Mide la acetilación de cloranfenicol marcado con $^{14}C$.

• SeAP (Fosfatasa alcalina secretada): Útil porque la proteína se secreta al medio, permitiendo ensayos sin matar la célula.

• Bioluminiscentes y Fluorescentes: Luciferasa y GFP (Green Fluorescent Protein) permiten el monitoreo en células vivas y animales completos.

Vectores Virales y de Replicación Episomal

• Vectores SV40 (Simian Virus 40):

  • ADN circular pequeño ($5\,kb$) con regiones temprana y tardía.

  • El Antígeno T grande es esencial para la replicación al unirse al origen de replicación.

  • Células COS: Líneas que expresan el Antígeno T de forma integrada, permitiendo la replicación de plásmidos con el origen del SV40 hasta $10^5$ copias por célula.

• Vectores EBV (Epstein-Barr):

  • Mantenimiento estable como episoma de bajo número de copias.

  • Requiere el elemento oriP y el gen EBNA1 (Epstein-Barr Nuclear Antigen 1).

  • Se replican solo una vez por ciclo celular, lo que les da alta estabilidad y capacidad para fragmentos grandes de ADN.

• Vectores de Adenovirus:

  • ADN lineal de $36\,kb$. Muy estable, alta capacidad, amplio rango de huéspedes (incluyendo células que no se dividen).

  • Vectores Gutless (sin tripas): Eliminan todos los genes virales, dejando solo señales de empaquetamiento y replicación ($37\,kb$ de capacidad). Reducen la citotoxicidad y la respuesta inmune.

• AAV (Virus Adeno-Asociado):

  • Parvovirus dependiente de un ayudante (adenovirus o herpesvirus).

  • Integra el ADN en el cromosoma 19 de humanos de forma sitio-específica (aunque se pierde al eliminar el gen rep en vectores).

  • Capacidad pequeña ($5\,kb$), pero se puede duplicar mediante el uso de heterodímeros de concatenación.

• Retrovirus y Lentivirus:

  • Oncoretrovirus: Solo infectan células en división (ej. MLV).

  • Lentivirus (HIV): Infectan células que no se dividen. Los vectores de tercera generación se dividen en 4 plásmidos para seguridad extrema para evitar la formación de virus competentes para la replicación.

• Alfavirus (Sindbis, Semliki Forest Virus):

  • Vectores de ARN que se replican en el citoplasma sin integración.

  • Altísimos niveles de expresión (hasta $50\%$ de la proteína celular total).

• Vaccinia (Poxvirus):

  • ADN grande ($300\,kb$), replicación citoplasmática.

  • Utilizado extensamente para vacunas recombinantes (ej. contra la rabia en zorros, ensayo clínico contra EBV). No requiere factores nucleares del huésped.

Consideraciones de Diseño para Alta Expresión (Box 12.2)

• Promotores Fuertes: CMV (citomegalovirus), RSV (virus del sarcoma de Rous), SV40.

• Intrones: La presencia de un intrón (como el del antígeno t pequeño del SV40) suele mejorar la expresión.

• Señal de Poliadenilación: Esencial para la estabilidad del ARNm; su ausencia reduce la proteína en un $90\%$.

• Optimización de Codones: Ajustar el uso de codones al huésped para evitar pausas traduccionales por escasez de ARNt.

• Contexto de Kozak: La secuencia $5'-CCRCCAUGG-3'$ es óptima para el inicio de la traducción (especialmente la purina en $-3$ y la guanina en $+4$).

• Señales de Direccionamiento: Para proteínas terapéuticas es vital enviarlas a la vía secretora (péptido señal) para asegurar glicosilaciones correctas.