Oprava DNA

Oprava chybného párování (Mismatch Repair)

• Zvyšuje přesnost replikace DNA.
• Proofreading: 1 chyba na $10^7$ replikovaných nukleotidů.
• Mismatch repair: 1 chyba na $10^9$ replikovaných nukleotidů.
• Opraví 99% chybně spárovaných bází.
• Princip:
  • Identifikace poruchy.
  • Navázání opravného enzymu.
  • Odstranění nespárované oblasti.
  • Resyntéza DNA.

Kroky opravy chybného párování

• Detekce mismatch v nově syntetizované DNA.
• Střih nového řetězce DNA a odstranění chybně spárovaného nukleotidu a jeho sousedů.
• Nahrazení chybějící části správnými nukleotidy pomocí DNA polymerázy.
• DNA ligáza uzavře mezeru v DNA backbone.

Excizní oprava

• Čtyři fáze:
  • Rozeznání poruchy specifickým proteinem.
  • Vyštěpení poškozeného místa specifickou endonukleázou.
  • Opravná syntéza (DNA-polymeráza).
  • Spojení (DNA-ligáza).

Varianty excizní opravy

• Bázová excizní oprava:
  • Odstraňuje abnormální nebo chemicky modifikované báze z DNA.
• Nukleotidová excizní oprava:
  • Odstraňuje rozsáhlejší defekty v DNA.
• Oprava řízená metylací:
  • Využívá metylace pro identifikaci řetězce, podle kterého má oprava proběhnout.

Bázová excizní oprava

• DNA-glykosyláza rozezná abnormální bázi v DNA a rozštěpí glykosidickou vazbu mezi poškozenou bází a deoxyribózou.
• Tím vznikají apurinová nebo apyrimidinová místa (AP-místa).
• AP-endonukleázy rozeznají AP-místo, které společně s fosfodiesterázami štěpí – dojde k přerušení cukr-fosfátové kostry.
• DNA-polymeráza nahradí chybějící nukleotid podle komplementárního řetězce.
• DNA-ligáza obnoví cukr-fosfátovou kostru vytvořením fosfodiesterové vazby.

Nukleotidová excizní oprava (short-patch repair)

• Oprava s krátkým dosahem.
• Vyštěpena nejen chybná báze/nukleotid, ale i krátký úsek okolních nukleotidů.
• Řada zúčastněných proteinů nese název Uvr (UV-radiation), protože byly objeveny při studiu důsledků ozáření UV.
• Název proteinům Uvr zůstal, ač se později zjistilo jejich zapojení i do jiných opravných drah (např. SOS-odpovědi).
• Specifická endonukleáza (tzv. excinukleáza = UvrABC) vytvoří zářezy z obou stran úseku poškozených nukleotidů.
• Oligonukleotid obsahující poškozené báze se vyštěpí.
• Mezera zaplněna DNA-polymerázou a DNA-ligázou.

Mechanismus nukleotidové excizní opravy

• Poškozená DNA (T-T, chybný pár bází, apod.) rozpoznána dimerem UvrA.
• UvrB rozplétá DNA.
• Endonukleáza UvrB/UvrC štěpí cukr-fosfátovou kostru ve vzdálenosti 12 nukleotidů.
• UvrD (DNA helikáza II) odvíjí segment DNA porušením vodíkových vazeb mezi páry bází a odstraňuje jej.
• DNA-polymeráza I resyntetizuje DNA podle nepoškozeného templátu.
• DNA-ligáza spojuje opravený fragment s molekulou DNA.

Nukleotidová excizní oprava - Kroky

• Polypeptidový trimer obsahující 2 kopie proteinu UvrA a 1 kopii proteinu UvrB rozpoznává poškozenou DNA a váže se na ni.
• S použitím energie získané z ATP dochází k ohybu DNA a ke změně konformace proteinu UvrB; dimer UvrA se uvolňuje.
• Protein UvrB se váže na komplex UvrB-DNA; protein UvrB vytváří zlom na 3'-straně a protein UvrC na 5'-straně.
• UvrD-helikáza uvolňuje vyštěpený oligomer.
• DNA-polymeráza I nahrazuje protein UvrB a zaplňuje mezeru s využitím komplementárního řetězce jako matrice.
• DNA-ligáza spojuje zlomy ponechané polymerázou.

Oprava DNA řízená metylací

• Nejpokročilejší z excizních oprav.
• Delší dosah („long-patch repair“).
• Rozlišuje, která báze je správná a podle ní zajišťuje opravu.
• Klíč spočívá v metylaci DNA.

Metylace DNA

• Metylaci podléhá obvykle adenin nebo cytozin.
• Zajištěna enzymy - metylázami.
• U bakterií např. Dam-metyláza metyluje adenin v sekvenci GATC.
• Po replikaci DNA: nově syntetizované řetězce po určitou dobu ještě metylovány nejsou – hemimetylovaný stav.
• Metyláza funguje se zpožděním 2 – 3 minuty.
• Po tuto dobu lze jednoznačně rozlišit mateřské řetězce od nově syntetizovaných.

Oprava řízená metylací - Mechanismus

• Díky hemimetylaci systém rozeznává, který řetězec je původní a využije jej k opravě.
• Distorze je rozeznána proteinem MutS (mutator).
• Dimer MutS2 rozpoznává chybnou bázi na nově syntetizovaném a dosud nemetylovaném řetězci.
• MutS rozeznává chybné párování a aktivuje další komponenty komplexu Mut.
• MutH – se váže na hemimetylovaná místa GATC a přerušuje v nich nemetylovanou sekvenci.
• Nově syntetizovaný (nemetylovaný) řetězec je přerušen a postupně zkracován specifickými exonukleázami.
• Vyštěpený úsek může být dlouhý i tisíce nukleotidů v závislosti na tom, jak daleko od sekvence GATC se vyskytuje místo špatného párování.
• Je nahrazen nově syntetizovaným řetězcem pole původního templátu (DNA-pol III) a spojen s původní DNA (DNA-ligáza).
• Funguje u prokaryot i eukaryot.
• Náprava postreplikačních chyb.
• Absence systému: zvýšený výskyt mutací.

Postreplikační rekombinační oprava

• Postreplikační: probíhá jen v návaznosti na replikaci poškozené DNA.
• Rekombinační: zapojen proces rekombinace mezi sesterskými molekulami DNA.
• V místě poruchy se DNA-polymeráza III z replikované DNA uvolňuje a syntézu obnovuje s určitým odstupem.
• Vzniká mezera.
• Do mezery se váže protein RecA: multifunkční protein, který zprostředkovává homologní rekombinaci a rozeznává jednořetězcové zlomy v DNA.
• Navození homologního párování neporušeného a porušeného řetězce.
• Chybějící úsek DNA syntetizuje DNA-pol I podle neporušeného řetězce z druhého dvojvlákna.
• Poškození zůstává v jedné z molekul a je opraveno později excizní opravou.
• Celistvost DNA zachována.

SOS-odpověď

• Obecná reakce buňky na závažné poškození DNA.
• Komplexní reakce - zahrnuje excizní opravy i rekombinace.
• Replikací poškozených úseků mutagenními DNA-polymerázami vznikají chyby - tzv. adaptivní mutace.
• Závisí na expresi specifických genů, která je v nepoškozených buňkách blokována dimerizovaným represorem LexA.
• Dereprese je důsledkem monomerizace LexA, kterou zprostředkuje RecA.
• RecA se aktivuje poškozením DNA a zvýšenou mírou přítomnosti neúspěšně replikovaných úseků ssDNA.

Indukce SOS-odpovědi

• Nepoškozená DNA:
  • Represor LexA se jako dimer váže na operátory v promotorech genů SOS-odpovědi a brání jejich expresi.
• Poškozená DNA:
  • Se obtížně replikuje, DNA-polymeráza se zastavuje a vznikají nezreplikované úseky ssDNA.
  • K ssDNA se váže RecA a za přítomnosti ATP se aktivuje (RecA*).
  • RecA* stimuluje štěpení LexA, který v této formě ztrácí schopnost vazby na operátor a aktivuje tak expresi opravných genů.

Průběh SOS-odpovědi

• Nastává exprese více než 50 genů regulonu SOS.
• Zajištění excizní opravy, homologní rekombinace, záchranné replikace, zastavení buněčného cyklu, atd.
• Geny uvr - pro vyštěpení poškozených nukleotidů.
• Geny recA, ruvAB – pro výměnu řetězců DNA a rekombinaci.
• Geny polB a dinB pro DNA-polymerázy II a IV.
• Geny umuC a umuD pro „error-prone“ (chyby navozující) DNA-pol V.
• DNA-polymeráza V je nepřesná, zvyšuje počty mutací, ale současně umožňuje dokončení replikace DNA a přežití.

SOS-mutageneze – poslední záchrana

• Geny umu = UV-indukovaná mutageneze.
• Do poškozeného místa při replikaci doputuje DNA-polymeráza III.
• V místě distorze nemůže pokračovat dál.
• Pro dokončení replikace musí zafungovat atypická mutagenní DNA-polymeráza spojená do komplexu s proteiny UmuC, UmuD a RecA.
• Mutagenní DNA-polymeráza je schopna replikovat i místo poškození, přičemž začleňuje náhodné nukleotidy.
• Poškození zůstává, ale replikace proběhne.
• Integrita DNA je zachována a oprava může nastat později.

Průvodní jevy SOS-odpovědi

• Indukce profágů (lambda, P22, f80).
  • Silné poškození buňky je profágy zaznamenáno.
  • Uvolňují se z chromozomu.
  • Zahajují lytický cyklus.
  • Pomnoží se a z buňky zmizí.
• Indukce tvorby kolicinů – antibakteriálních látek.
  • Preventivní útok na jiné bakterie, se kterými by bakterie oslabená mutagenem mohla prohrávat v boji o zdroje.
• Zmírnění restrikce.
  • Snížení aktivity restrikčních endonukleáz.
  • Bakterie mohou přijmout exogenní DNA.
  • Nepoškozená DNA uvolněná z jejich bratrů a sester se může přijmout a začlenit rekombinací do vlastního genomu.

Oprava dvouřetězcových zlomů DNA

• Nebezpečný typ poškození DNA.
• Riziko fragmentace chromozomů a ztráty genů.
• Oprava obtížná.
• Dvě obecné strategie buněk:
  • „non-homologous end joining“ (NHEJ).
  • Homologní rekombinace.

Spojování nehomologních konců DNA (NHEJ)

• Proces běžný u vyšších eukaryot.
• Rychlé spojování přerušených konců ligací.
• Probíhá ve všech fázích buněčného cyklu.
• Brání rozsáhlým poškozením genomu.
• Oprava je nedokonalá.
• Rozeznány volné konce dvouřetězcového zlomu.
• Úpravy nekompatibilních konců nukleázami.
• Časté ztráty hraničních nukleotidů a defekty funkce postižených genů.
• Ligace.

Homologní rekombinace

• Využití sesterské dvoušroubovice pro opravu poškozené DNA.
• Hlavním problémem opravy je nalezení intaktního templátu, podle kterého má oprava proběhnout.
• Obvykle nastává krátce po replikaci (v pozdní S nebo G2 fázi cyklu), kdy jsou duplikované šroubovice fyzicky blízko sebe.
• Bez ztráty nukleotidů, vysoká přesnost.

Průběh opravy homologní rekombinací

• Dvouřetězcové zlomy rozeznány kinázou ATM, která fosforyluje protein BRCA1.
• BRCA1 se podílí na sestavení iniciačního komplexu homologní rekombinace.
• V místě zlomu se sestavuje proteinový komplex MRN, jehož 5´ -3´exonukleázová aktivita zkracuje 5´ -konce přerušených řetězců a vytvoří jednořetězcové přesahy.
• Speciální rekombinační enzymy (RecA u bakterií a Rad52 u eukaryot) řídí hledání a průnik ssDNA do homologní oblasti v sesterském duplexu („strand invasion“).
• Po nalezení dostatečně dlouhého úseku vhodného pro párování bází reparační DNA-polymeráza prodlužuje proniknuvší řetězec.
• Jako templát využívá nepoškozený řetězec.
• Po dosažení místa zlomu se nově syntetizovaný řetězec spojí se svým původním partnerem.
• Oprava je dokončena další syntézou DNA kolem místa zlomu na obou řetězcích poškozeného helixu a ligací přerušených řetězců.
• Výsledkem jsou dvě kompletní šroubovice, přičemž jedna z nich posloužila jako templát pro opravu druhé.

Dědičné choroby způsobené poruchami oprav DNA

• Xeroderma pigmentosum – extrémní citlivost k slunečnímu záření, náchylnost k nádorům kůže.
  • Důsledek poruchy v opravě DNA po UV záření (tyminových dimerů).
  • Mutace v genech kódujících proteiny zapojené do nukleotidové excizní opravy.
  • Často je postižena excinukleázová aktivita.
• Další poruchy v nukleotidové excizní opravě:
  • Cocaynův syndrom – opožděný růst, poruchy mentálních schopností
  • Trichothiodystrofie – krátké končetiny, lomivé vlasy, šupinatá pokožka, psychomotorická retardace.
• Ataxia telangiectasia
• Fanconiho anémie
• Bloomův syndrom
• Wernerův syndrom
  • Vysoká citlivost k ionizujícímu záření.
  • Chyby v opravách DNA.
  • Vysoká četnost chromozomových aberací.
  • Vysoké riziko malignit (mutace BRCA).

Mezidruhová příbuznost DNA

• Díky opravným mechanismům se změny ve struktuře DNA v průběhu evoluce hromadí pomalu.
• Mezi člověkem a šimpanzem je asi 5 milionů let divergence, ale jejich nukleotidové sekvence v DNA jsou z 98% identické.
• Díky přesnosti procesů replikace a reparace se během 100 milionů let genetická informace měnila jen minimálně.

Rekombinace DNA

• Proces vzniku nových kombinací genů v důsledku výměny částí homologních chromozomů.
• Nastává často během meiózy při pohlavním rozmnožování.
• Zvětšení genetické diverzity u potomstva – evoluční výhoda.
• Existuje i v prokaryotických buňkách po přenosu cizorodé DNA transformací, transdukcí nebo konjugací.

Typy rekombinace DNA

• Homologická (obecná, závislá na RecA):
  • Vyžaduje dlouhé úseky DNA s vysokým stupněm sekvenční homologie.
  • Běžná mezi dvěma kopiemi téhož chromozomu (v meióze) a při opravách zlomů v DNA.
• Nehomologická (místně-specifická, ilegitimní):
  • Probíhá mezi molekulami DNA, které obsahují jen krátké specifické sekvence rozpoznávané místně-specifickými rekombinázami, nikoliv proteinem RecA.
  • Nevyžaduje podstatnou sekvenční homologii.

Homologická rekombinace - Mechanismus

• Rozeznání homologických úseků dvouřetězcových DNA.
• Přerušení jednoho řetězce každé dvoušroubovice endonukleázou.
• Výměna řetězců.
• Spojení řetězců ligací za vzniku Hollidayovy struktury.
• Posun bodu překřížení.
• Dva možné výsledky „rezoluce“.
• Reakce zprostředkovány rekombinačními enzymy.

Rozložení Hollidayova spojení

• I. Regenerace původních molekul DNA obsahujících pouze krátkou heteroduplexní oblast resolvázy (endonukleázy) RuvC a RuvG
• II. Vytvoření hybridních molekul DNA obsahujících krátkou heteroduplexní oblast a zaměněné koncové úseky

Místně specifická rekombinace

• Nevyžaduje podstatnou míru homologie.
• Využívaná např. mobilními genetickými elementy.
• Řízená enzymy, které rozeznávají krátké sekvence na koncích mobilních elementů.

Začlenění fágové DNA do chromozomu hostitelské buňky

• Jednoduchý crossing-over krátké homologické sekvence.
• Integráza.
• Mechanismus: místně-specifická rekombinace.
• Excizionáza.