Trascrizione negli Eucarioti

Negli eucarioti, la trascrizione è simile a quella dei procarioti, ma con differenze significative.
Negli eucarioti, ci sono tre tipi di RNA polimerasi coinvolte nella trascrizione:
- RNA polimerasi I
- RNA polimerasi II
- RNA polimerasi III

RNA Polimerasi I

Trascrive gli RNA ribosomiali (rRNA).
Gli rRNA sono stati centrifugati in presenza di saccarosio per determinarne il gradiente di sedimentazione.
L'unità di misura del gradiente di sedimentazione è lo Svedberg (S).
Si distinguono gli rRNA 28S, 18S, 5,8S e 5S.
L'rRNA 5S è trascritto dall'RNA polimerasi III.

RNA Polimerasi II

Trascrive gli RNA messaggeri (mRNA), i long non-coding RNA (lncRNA) e i micro RNA (miRNA).
I miRNA sono RNA di circa 21 nucleotidi importanti nei processi di regolazione genica.

RNA Polimerasi III

Trascrive l'rRNA 5S e altri piccoli RNA (300-500 nucleotidi) della cellula, come gli RNA transfer (tRNA) e gli small nuclear RNA.
- Una sottocategoria degli small nuclear RNA sono gli small nucleolar RNA, i quali lavorano all’interno del nucleolo.

Fattori di Trascrizione

Sono necessari fattori generali di trascrizione per tutte le categorie di RNA polimerasi.
- Questi aiutano l'enzima nella ricerca del promotore e garantiscono una trascrizione basale.
Fattori trascrizionali specifici regolano l'espressione di un gene specifico.
Proteine che possono essere attivatori o inibitori del processo modulano l'espressione dei geni.
Nei procarioti l’informazione genetica è molto più accessibile, mentre negli eucarioti i geni eucariotici sono immersi nella cromatina, e questa necessita di essere svolta affinché avvenga il processo di trascrizione.
I complessi di rimodellamento della cromatina separano i nucleosomi per consentire all'RNA polimerasi di trascrivere.

Promotori

I diversi tipi di RNA polimerasi riconoscono promotori differenti.
L'RNA polimerasi I riconosce promotori lunghi circa 60pb a cavallo del punto di inizio della trascrizione.
- Questi richiedono la presenza della TATA binding protein (TBP).
L'RNA polimerasi III ha promotori che si trovano prevalentemente all'interno della regione trascritta.
I geni trascritti dall'RNA polimerasi I e III sono detti 'housekeeping'.
- Non sono particolarmente regolati e la loro trascrizione non richiede fattori specifici.
Il promotore è sufficientemente forte da garantire molti trascritti, che risentono solo delle fasi del ciclo cellulare.

RNA Polimerasi II e la Sua Regolazione

L'RNA polimerasi II trascrive mRNA, che ha bisogno di essere altamente regolato.
Il promotore riconosciuto dall'RNA polimerasi II è costituito da una regione, il promotore basale, grande all'incirca 40pb.
- La componente principale si trova all'esterno del trascritto.
Il promotore minimo permette la produzione di mRNA tramite RNA polimerasi II.
Sequenze enhancer stimolano la trascrizione, mentre sequenze silencer la sopprimono.
Sono sequenze in cis che agiscono a distanza.
Altre sequenze, le insulator, creano isole e impediscono all'enhancer di agire su altri promotori.
Il promotore minimo ha sequenze consensus di 7-8 nucleotidi riconosciute dai fattori generali di trascrizione.
C'è una sequenza TATA posizionata a -26/-31 rispetto all'inizio della trascrizione che riconosce la proteina Tata binding protein.
Altre sequenze discrete riconoscono il transcription factor TFIIB.
Servono anche elementi in trans per regolare l'RNA polimerasi.

Tata Binding Protein

La tata binding protein riconosce la TATA box e lega il solco minore del DNA, causando una distorsione della molecola.
Il DNA si piega, indicando il promotore all'RNA polimerasi.
Il ripiegamento avvicina sequenze lontane, come gli enhancer e silencer, al promotore basale.

Inizio della Trascrizione

Quando la tata binding protein si lega, si forma il fattore di trascrizione TFIID.
Vengono richiamate altre proteine, TFIIA e TFIIB, che orientano la trascrizione posizionando bene l'RNA polimerasi.
Il fattore di trascrizione generale TFIIF accompagna l'ingresso della RNA polimerasi.
Si forma il complesso di pre-inizio della trascrizione.
TFIIH apre il doppio filamento di DNA e fosforila una porzione specifica dell'RNA polimerasi.
- L'RNA polimerasi II ha un core proteico globulare e una coda non strutturata.
- La coda carbossi-terminale viene fosforilata da TFIIH.
- Quando ciò avviene, prende avvio il processo di allungamento.
La TATA binding protein è molto conservata nei geni finemente regolati.
Ai fattori di trascrizione generali si aggiungono i fattori di trascrizione specifici.
Proteine rimodellino la cromatina per rendere i geni accessibili all'RNA polimerasi.
Serve un complesso mediatore che faccia da ponte tra i fattori basali della trascrizione e tutte le proteine che riconoscono gli enhancer e silencer.
Le sequenze enhancer vengono riconosciute da fattori specifici della trascrizione, i fattori lontani agiscono sul promotore tramite ripiegamento del DNA.

Maturazione dell'mRNA

L'mRNA eucariotico subisce un processo di modificazione durante la trascrizione, detto maturazione.
Il dominio carbossi-terminale dell'RNA polimerasi coordina questi processi.
Vengono aggiunti un cappuccio di 7-metil-guanosina all'estremità 5’ e una coda di poliA all'estremità 3’.
Vengono rimosse delle sequenze non codificanti (splicing).
Segue un processo di regolazione genica, l'editing del trascritto.
La coda carbossi-terminale dell'RNA polimerasi II è caratterizzata da una ripetizione di 7 aminoacidi che presenta una serina in posizione 2 e una serina in posizione 5.
- Questi due aminoacidi sono i siti di fosforilazione.
Prima il fattore trascrizionale TFIIH fosforila la serina 5, poi la serina 2.
Il cappuccio rende più efficiente lo splicing, conferisce maggiore stabilità alla molecola, permette il trasporto dal nucleo al citoplasma e determina una traduzione valida.
Durante la fase di allungamento, altre chinasi fosforilano la serina 2.
L'RNA polimerasi di nuovo si fa veicolo per concentrare lo spliceosoma.
La serina 2 viene fosforilata per richiamare le proteine che aggiungono la coda di poli A.

Fine della Trascrizione

La trascrizione termina quando viene trascritta una sequenza ricca in A, il segnale di poliadenilazione.
L'mRNA viene tagliato circa 30 nucleotidi a valle.
Il complesso proteico della poliadenilazione contiene proteine in grado di tagliare l'mRNA trascritto e proteine in grado di poliadenilare.
L'mRNA che continua ad essere trascritto dopo il taglio viene degradato da enzimi che inducono il distacco dell'RNA polimerasi.
Il cap a 5’ e la coda di poliA a 3’ servono alla stabilità della molecola trascritta.

Geni Interrotti

Tra i geni eucarioti ci sono geni interrotti: non tutto quello che viene trascritto verrà poi tradotto.
Gli esperimenti 'pulse chase' hanno determinato la scoperta dei geni interrotti.
Gli RNA citoplasmatici sono più corti di quelli nucleari, suggerendo che vengono prima trascritti come lunghi pre-mRNA e poi tagliati.
Il DNA complementare all'mRNA maturo è stato utilizzato per esperimenti di ibridazione.
Le regioni che si appaiano sono gli esoni, quelle che formano le anse sono gli introni.
Il 15% delle malattie ereditarie umane è causato da errori nei processi di splicing.
Gli introni possono essere pochi e piccoli, o molti e grandi.

Splicing

La cellula deve identificare le regioni di confine tra esone e introne.
Si distinguono il sito donatore e il sito accettore.
Al centro della sequenza intronica c'è il sito di ramificazione.
Il 2’ OH dell’adenina del sito di ramificazione si sostituisce al legame fosfodiesterico tra l’ ultimo nucleotide dell’esone e il primo nucleotide dell’introne, creando una struttura a laccio.
Si crea l’unione di esone-esone, e la struttura a cappio dell’introne viene rimossa.
Lo spliceosoma è un complesso formato da proteine e small nuclear RNAs (snRNAs).
La ribonucleo particella U1 riconosce il sito donatore e vi si lega. U2 si lega al sito di ramificazione e richiama i complessi U4, U5 e U6, che si sostituiscono a U1.
U5 prende contatto con il sito di splicing al 3’ e fa sì che avvenga l’unione esone-esone, ne media l’interazione.
Lo spliceosoma conferisce all’mRNA la conformazione tale per cui possano crearsi i legami fosfodiesterici.
Lo spliceosoma marca il punto in cui ha operato, ovvero le giunzioni esone-esone, con un complesso proteico denominato Exon Junction Complex (EJS).

Regioni Non Tradotte

Il primo e l’ultimo esone di ciascun gene contengono regioni non tradotte: 5’ UTR e 3’ UTR.
L’mRNA completo comprende la regione codificante fatta di esoni, all’estremità le regioni 5’ e 3’ non tradotte, il cap al 5’ e la coda di poliA.

Splicing Alternativo

Da uno stesso trascritto di mRNA si possono produrre molecole non identiche che contengono infatti esoni diversi: splicing alternativo.
Il gene in figura viene trascritto come mRNA precursore e contiene 5 esoni.
Gli mRNA vengono tutti tradotti, ma si vanno a formare proteine diverse.
Ciò crea variabilità.
La fibronectina è una proteina che subisce uno splicing cellulo-specifico.
Lo splicing alternativo avviene attraverso sequenze in cis (presenti sull’mRNA), le ESE e ISE (exonic-intronic enhancer), che vengono lette da elementi in trans (proteine).
Ci sono inoltre delle sequenze inibitrici, le ESS e ISS (exonic-intronic splicing silencer).
Nei processi evolutivi la presenza degli esoni è funzionale alla comparsa di nuovi tipi proteici.
Un esone contiene una sequenza con un'informazione per un dominio proteico. Quando l’esone viene duplicato, la stessa informazione viene duplicata e amplificata.
Un gene di Drosophila presenta 12 varianti dell’esone 4, 48 varianti dell’esone 6, 33 varianti dell’esone 9 e 2 varianti dell’esone 17.
Questo singolo gene può creare 38.000 proteine diverse.
Lo splicing influenza anche il trascrittoma, ovvero la totalità degli mRNA a disposizione di una cellula.
Lo stesso gene subisce nelle cellule della tiroide un processo di splicing diverso da quello del cervello. Si producono due ormoni diversi.
Ci sono dei geni che sono in grado di svolgere un auto-splicing, ovvero non hanno bisogno dello spliceosoma.
Gli mRNA contengono introni di gruppo I e di gruppo II.
- I primi sono capaci di ripiegarsi e formare una tasca nella quale accolgono un nucleotide, di solito una guanina G, che svolge la stessa funzione dell’adenina A nel sito di ramificazione.
- Gli introni di gruppo II si ripiegano anche questi in modo tale da estroflettere un adenina A dall'appaiamento che avviene all’interno della molecola di RNA.
- Si ottiene una struttura tridimensionale molto simile a quella degli mRNA eucariotici lavorati dagli spliceosomi, con la differenza che in questi la struttura spaziale è costituita da 3 molecole di RNA (mRNA, U2, U6) e negli introni di gruppo II è invece intramolecolare.