Guía Exhaustiva de Electroforesis de ADN y Proteínas: Fundamentos, Técnicas y Protocolos

Objetivos de la Práctica de Electroforesis

• Objetivo General:

  • Separar e identificar diferentes macromoléculas mediante la técnica de electroforesis.

• Objetivos Específicos:

  • Evaluar de manera detallada el proceso de purificación de la favina empleando electroforesis en condiciones desnaturalizantes.

  • Visualizar las muestras de ADN obtenidas y evaluar la eficiencia del método de extracción utilizado.

Fundamento Teórico de la Electroforesis

• Definición y Principio:

  • La electroforesis es una técnica descrita como simple, rápida y sensible para la separación de moléculas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico.

  • El fenómeno fundamental se basa en la migración de moléculas con carga hacia los electrodos de carga opuesta tras la aplicación de una corriente eléctrica.

• Factores que Afectan la Movilidad:

  • La velocidad de migración de las moléculas depende de diversos factores críticos:

    • Carga efectiva de la molécula.

    • Intensidad del campo eléctrico aplicado.

    • Tamaño de la molécula macromolecular.

    • Viscosidad del medio de soporte.

• Influencia del Entorno Químico:

  • La carga de las moléculas está determinada por los grupos ionizables en su superficie.

  • El signo y la magnitud de dicha carga varían en función del $pH$ y la fuerza iónica del medio.

  • La optimización de la separación se logra seleccionando condiciones adecuadas de $pH$ y fuerza iónica.

• Tipos de Soportes:

  • Celulosa: Utilizada específicamente para separar moléculas de bajo peso molecular, tales como aminoácidos y carbohidratos.

  • Almidón, Agarosa y Poliacrilamida: Empleados comúnmente para macromoléculas complejas.

  • Geles de poliacrilamida y agarosa: Son los más utilizados para el estudio de proteínas y ácidos nucleicos.

Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE)

• Características de los Geles de Acrilamida:

  • Poseen un alto poder de resolución tanto para proteínas como para ácidos nucleicos.

  • Presentan interacciones mínimas entre la matriz del gel y las moléculas migrantes.

  • Ofrecen una alta estabilidad física de la matriz.

  • Poseen una alta sensibilidad para la detección.

• Mecanismo de Separación:

  • La resolución mejora gracias a que la separación no se limita a la movilidad electroforética, sino que añade un efecto de tamizado molecular.

  • El gel actúa como un tamiz: las moléculas grandes encuentran resistencia y se mueven lentamente, mientras que las moléculas pequeñas migran a mayor velocidad.

• Química de la Polimerización:

  • Los geles se forman por la polimerización de radicales libres de acrilamida y su entrecruzamiento con $N,N' \text{-metilen-bis-acrilamida}$.

  • La reacción está controlada por dos agentes clave:

    • Persulfato de amonio (APS): Actúa como el iniciador.

    • $N,N,N',N' \text{-tetraetilendiamina (TEMED)}$: Actúa como el catalizador.

• Control del Tamaño del Poro:

  • El tamaño del poro se controla mediante la concentración de acrilamida ($T$) y el grado de entrecruzamiento ($C$).

  • Relación de Concentración:

    • Concentraciones bajas ($2.5\,\%$) crean poros grandes para biomoléculas de alto peso molecular.

    • Concentraciones altas ($8 - 15\,\%$) crean poros pequeños para biomoléculas de menor tamaño.

  • Fórmulas de Cálculo:

    • $\text{\% } T = \frac{(a+b) \times 100}{V}$

    • $\text{\% } C = \frac{b \times 100}{(a+b)}$

    • Donde $a$ es la masa de acrilamida (g), $b$ es la masa de $N,N' \text{-metilen-bis-acrilamida}$ (g) y $V$ es el volumen final (mL).

Electroforesis en Gel Discontinuo y SDS-PAGE

• Estructura del Gel Discontinuo:

  • Se divide en dos zonas con diferentes propiedades de $pH$ y porosidad:

    • Gel de Concentración (Superior): $pH \, 6.8$ y $\text{\% } T = 3.9$. Facilita la formación de bandas concentradas al inicio.

    • Gel de Separación (Inferior): $pH \, 8.8$ y $\text{\% } T = 8 - 15$. Provee la resolución final.

  • Capacidad de detección: Es ideal para analizar proteínas en bajas cantidades (rango de $1 - 2 \, \mu g$).

• Principio del SDS-PAGE:

  • Permite determinar el Peso Molecular (PM) de las proteínas mediante el uso de agentes específicos:

    • Dodecil sulfato de sodio (SDS): Detergente aniónico que rompe estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria mediante interacciones hidrofóbicas. Se une en una proporción de 1 molécula de SDS por cada 2 residuos de aminoácidos, otorgando una carga neta negativa y forma lineal a la proteína.

    • $\beta \text{-mercaptoetanol}$: Agente reductor que desnaturaliza la proteína rompiendo los puentes disulfuro.

  • La movilidad resultante depende exclusivamente del tamaño molecular.

• Determinación del Peso Molecular (PM):

  • Se utiliza un marcador o patrón de PM conocido.

  • Se construye una curva de calibración graficando $\log(PM)$ vs. Movilidad relativa.

  • El PM de la proteína problema se obtiene mediante la ecuación de la recta de dicha gráfica.

Electroforesis de ADN en Gel de Agarosa

• Características de la Agarosa:

  • Es un polímero lineal de residuos alternantes de D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa unidos por enlaces $\alpha(1\text{-}3)$ y $\beta(1\text{-}4)$.

  • Forma una malla tridimensional con diámetros de fibra entre $50$ y >200 \, nm.

• Tipos de Agarosa según su Fusión:

  • Estándar: Se disuelven a $90 - 95 \, ^{\circ}C$ y solidifican entre $35 - 45 \, ^{\circ}C$.

  • Bajo punto de fusión: Se disuelven a $65 \, ^{\circ}C$ y solidifican entre $30 - 35 \, ^{\circ}C$.

• Revelado y Visualización:

  • Bromuro de Etidio (BrEt): Agente que se intercala en las bases del ADN. Bajo luz ultravioleta ($\lambda \approx 300 \, nm$) emite fluorescencia anaranjada ($590 \, nm$). Es altamente tóxico.

  • SYBR Green I: Se une al surco menor del $dsDNA$. Emite fluorescencia verde ($\lambda \approx 520 \, nm$) con luz azul. Es útil para cuantificación en tiempo real.

  • HydraGreen™ y SYBR Safe: Alternativas menos tóxicas y mutagénicas con sensibilidad similar al BrEt.

Metodología: Electroforesis de Proteínas (SDS-PAGE)

• Reactivos Críticos:

  • Buffer de carga 6X: Contiene azul de bromofenol ($0.012\,\%$), SDS ($10\,\%$), glicerol ($30\,\%$) y $\beta \text{-mercaptoetanol}$ ($33\,\%$).

  • Buffer de corrida 1X: Mezcla de Glicina ($14.4 \, g$), Tris ($3.02 \, g$) y SDS ($1 \, g$) en $1 \, L$, ajustado a $pH \, 8.3$.

  • Solución de monómeros: Acrilamida $30\,\%$ y Bisacrilamida $0.8\,\%$ (Neurotóxica).

  • Solución de tinción: Azul de Coomassie R-250 ($0.05\,\%$) en $35 - 100 \, mM$ de $HCl$.

• Procedimiento de Preparación del Gel:

  • El gel separador al $12\,\%$ se vierte primero. Se añade etanol al $70\,\%$ en la parte superior para asegurar una superficie plana.

  • Tras $15 - 20$ minutos de polimerización, se lava el etanol y se añade el gel concentrador ($3.9\,\%$) insertando el peine.

• Preparación de Muestras y Corrida:

  • Se mezclan $50 \, \mu L$ de muestra con $10 \, \mu L$ de buffer de carga 6X.

  • Las muestras se hierven durante 5 minutos a $95 - 100 \, ^{\circ}C$ para desnaturalizar.

  • La corrida inicia a $80 \, V$ hasta que el frente llega al gel de separación, luego se aumenta a $120 \, V$.

• Tinción y Lavado:

  • Se utiliza microondas por $90$ segundos para acelerar la tinción con azul de Coomassie.

  • El lavado con agua (también con ayuda de microondas) se repite hasta que el gel quede transparente y solo las bandas de proteína sean visibles.

Metodología: Electroforesis en Gel de Agarosa (ADN)

• Reactivos Críticos:

  • Buffer TBE 5X: Tris ($54 \, g$), ácido bórico ($27.5 \, g$) y EDTA ($0.5 \, M$, $pH \, 8.0$, $20 \, mL$).

  • Buffer de carga de ADN 6X: $50\,\%$ glicerol, $10 \, mM$ Tris $pH \, 8.0$, $1 \, mM$ EDTA y azul de bromofenol.

• Preparación del Gel:

  • Se prepara comúnmente al $1\,\%$ ($0.5 \, g$ de agarosa en $50 \, mL$ de Buffer TBE 1X).

  • El calentamiento se realiza en microondas ($60 - 90 \, s$) usando gafas de protección.

  • El colorante (SYBR Green o HydraGreen) se añade cuando la solución baja a $50 \, ^{\circ}C$.

• Corrida del Gel:

  • Se cargan $20 \, \mu L$ de muestra (mezcla de ADN y buffer 6X).

  • Voltaje aplicado: $100 - 150 \, V$ (o $1 - 5 \, V/cm$ según la distancia entre electrodos).

  • El ADN migra hacia el ánodo (polo positivo) debido a la carga negativa de sus grupos fosfato.

  • La corrida finaliza cuando el frente alcanza $2/3$ de la longitud del gel.

Análisis de Resultados y Preguntas de Control

• Actividades Post-laboratorio:

  • Identificar las masas moleculares de los patrones.

  • Elaborar gráficas de $\log(PM)$ vs. Movilidad relativa.

  • Evaluar la eficiencia de la purificación de la favina por cromatografía de afinidad.

  • Explicar los resultados de la extracción de ADN.

• Cuestionario Teórico:

  • Definir la función de cada reactivo empleado.

  • Determinar la concentración óptima de agarosa para la separación de ADN genómico.